Gen knockdown der Metalloproteasen Meprin alpha 1, alpha 2 und beta im Zebrabärbling Danio rerio

Die Metalloproteasen Meprin α und β übernehmen Schlüsselfunktionen in vielen (patho-) physiologischenrnProzessen. So sind sie beteiligt an der Umstrukturierung der extrazellulären Matrix, an immunologischenrnReaktionen oder an entzündlichen Gewebserkrankungen. Die beiden Enzyme kommenrnhauptsächlich in den Bürstensaummembranen von Niere und Darm sowie in der Haut von Vertebratenrnvor. Für die Erforschung der biologischen Aktivität der Meprine wurde in dieser Arbeit der ModellorganismusrnDanio rerio verwendet, der vor allem durch die Möglichkeit der gentechnischen Manipulationrnprädestiniert ist. Im Fisch konnten drei homologe Enzyme (Meprin α1, α2 und β) nachgewiesenrnwerden. Während mRNA-Analysen eine nahezu ubiquitäre Verteilung der Meprine offenbarten,rnkonnte ich mittels spezifischer Antikörper die Expression auf Proteinebene nachweisen. WährendrnMeprin α1 und β verstärkt im Darmepithel und in der Epidermis lokalisiert sind, konnte Meprinrnα2 ausschließlich in der Lamina propria des Darms identifiziert werden.rnDer Hauptteil der vorliegenden Arbeit zielt auf die spezifische Reduzierung des Expressionslevels derrnMeprine in Embryonen des Zebrabärblings. Dies wurde durch die Mikroinjektion von sogenanntenrnMorpholinos in die Zygote erzielt. Morpholinos sind RNA-Moleküle, die spezifisch an die mRNA desrnZielproteins binden können und die Translation verhindern. Die auftretenden Effekte durch das Fehlenrnder Meprine lassen so Rückschlüsse auf ihre physiologische Funktion zu. Nach der Injektion vonrnMorpholinos gegen Meprin α1 zeigten sich lediglich leichte epidermale Deformationen. Bei Meprin βrnhingegen kam es zu einer massiven Fehlbildung von Organen im Rumpf- und Schwanzbereich. Diesesrnführte zu erheblichen Defekten; die Embryonen starben innerhalb der ersten 24 Stunden nach derrnBefruchtung. Demzufolge müssen Meprin α1 und Meprin β insbesondere an der Gewebsdifferenzierungrnbeteiligt sein. Dies korreliert mit verschiedenen Experimenten, u.a. an knockout Mäusen, ausrndenen hervorgeht, dass die Prozessierung und Aktivierung der Cytokine Interleukin-1β oder Interleukin-rn18 durch Meprin β erfolgen kann.rnDie Injektion von Meprin α2-Morpholinos erbrachte ein weiteres, eindrucksvolles Ergebnis: Das Blutgefäßsystemrnvon injizierten Embryonen war vollständig unterbrochen und es sammelten sich Erythrozytenrnim Bereich der Caudalvene an. Diese Phänotypen gleichen den knockdown-Experimenten mitrndem vascular endothelial growth factor VEGF-A, dem entscheidenden Wachstumsfaktor in der Angiogenesern(Blutgefäßbildung). Eine Inkubation des humanen VEGF-A mit (humanem) rekombinantemrnMeprin α bzw. β führte zu einer differenzierten Prozessierung des Moleküls. Diese Ergebnisse legenrnnahe, dass Meprin α pro-angiogenetisch wirkt, indem es VEGF-A prozessiert und damit die Gefäßbildungrnaktiviert. Aus den Daten dieser Arbeit wird die hohe Signifikanz der Meprine für die Proliferationrnund Differenzierung spezieller Gewebe deutlich, welche somit eine wichtige Grundlage für Studienrnan höheren Vertebraten darstellt.

Proteomics-driven approach for the detection of breast cancer biomarkers

Breast cancer (BC) is the most often diagnosed cancer entity of women worldwide. No molecular biomarkers are usable in the clinical routine for the early detection of BC. Proteomics is one of the dynamic tools for the successful examination of changes on the protein level. In this thesis different proteomics-based investigations were performed for the detection of protein and autoantibody biomarkers in serum samples of BC and healthy (CTRL) subjects. First, protein levels of candidates from previous profiling studies were investigated via antibody-microarray platform. Three proteins were found in distinct levels in both groups: secretoglobin family 1D member 1, alpha-2 macroglobulin and inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family member 4. The second part was dedicated to the de novo exploration of potentially immunogenic tumor antigens (TA’s) with immunoprecipitation and Western immunoblotting followed by identification over mass spectrometry. Autoantibody levels were verified in individual serum profiling via the protein microarray platform. Two autoantibody’ cohorts (anti-Histone 2B and anti-Recoverin) were found in different levels in both groups. The findings of this PhD thesis underline deregulated serum protein and autoantibody levels in the presence of BC. Further investigations are needed to confirm the results in an independent study population.

Synthese, Charakterisierung und Testung von Phenylacrylsäure-Derivaten, Benzothiazolen und Diarylthioethern als potentielle Inhibitoren der Dengue-Virus-Typ-2-NS2B-NS3-Protease

Dengue-Fieber ist eine durch Stechmücken der Gattungen Aedes aegypti und Aedes albopticus übertragene, virale Infektionskrankheit des Menschen, welche eine zunehmende Bedrohung für die Weltbevölkerung darstellt; das Infektionsrisiko betrifft vorwiegend Menschen, die in tropischen und subtropischen Gebieten der Erde (Asien, Afrika, Amerika) leben. Bei dem Erreger handelt es sich um ein Flavivirus, bestehend aus einer positiv polarisierten Einzelstrang-RNA, welches in vier verschiedenen Serotypen existiert. Eine Infektion mit Dengue-Viren zeigt sich durch drei mögliche Krankheitsbilder: Klassisches Dengue-Fieber (DF), hämorrhagisches Dengue-Fieber (DHF) oder Dengue-Schock-Syndrom (DSS). Das Dengue-Virus-Genom codiert eine Serin-Protease mit einer klassischen katalytischen Triade, bestehend aus den Aminosäuren His51, Asp75 und Ser135. Die Funktion der Dengue-Virus-Protease besteht in der post-translationalen, proteolytischen Prozessierung des viralen Polyprotein-Vorläufers, womit sie essentiell für die Virus-Replikation ist und damit einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen Dengue-Fieber darstellt. Die Ziele der vorliegenden Arbeit bestanden darin, neue potentielle Inhibitoren der Dengue-Virus Typ 2 NS2B-NS3 Protease (DEN-2 NS2B-NS3pro) zu synthetisieren, deren Hemmwirkung sowie den Inhibitionstyp mithilfe fluorimetrischer Enzym-Assays zu bestimmen, Struktur-Wirkungs-Beziehungen (u.a. mithilfe von Molecular Docking-Rechnungen) zu analysieren und die erhaltenen Leitstrukturen zu optimieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Substanzklassen und damit zwei Teilprojekte behandelt: Phenylacrylsäureamide im ersten Teilprojekt, Benzothiazole und Diarylthioether zusammen im zweiten Teilprojekt. Im ersten Teilprojekt zeigten einige Phenylacrylsäureamide eine schwache Hemmung der DEN-2 NS2B-NS3pro zwischen ca. 50 und 61 % bei einer Inhibitorkonzentration von 50 µM sowie eine nicht-kompetitive Hemmung, welche jedoch durch vielfältige Derivatisierung kaum verändert oder verbessert werden konnte. Darüber hinaus wurden die endogenen Serin-Proteasen alpha-Chymotrypsin und Trypsin durch einige Phenylacrylsäureamide erheblich stärker gehemmt als die DEN-2 NS2B-NS3pro. Das zweite Teilprojekt befasste sich mit der Synthese und Testung von Diarylthioethern mit hydroxy-substituierten Benzothiazol-Bausteinen sowie der Testung einiger methoxy-substituierter Synthese-Vorstufen der Endverbindungen, um die Relevanz und den Einfluss der einzelnen Bausteine auf die Hemmung der DEN-2 NS2B-NS3pro zu untersuchen. Der in der vorliegenden Arbeit synthetisierte, potenteste Inhibitor der DEN-2 NS2B-NS3pro (Hemmung: 90 % [50 µM]; IC50 = 3.6 +/- 0.11 µM) und der DEN-3 NS2B-NS3pro (Hemmung: >99 % [100 µM]; IC50 = 9.1 +/- 1.02 µM), SH65, ein Diarylthioether-Benzothiazol-Derivat, entstand aufgrund der Vorhersage zweier möglicher Bindungsmodi (kompetitiv und nicht-kompetitiv) mithilfe von Molecular Docking-Experimenten an der Röntgen-Kristall-struktur der DEN-3 NS2B-NS3pro (PDB-Code: 3U1I). Nach experimenteller Bestimmung der IC50-Werte bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen erwies sich SH65 jedoch als nicht-kompetitiver Inhibitor der DEN-2 NS2B-NS3pro. Trypsin wurde von SH65 vergleichbar stark gehemmt (96% [50 µM]; IC50 = 6.27 +/- 0.68 µM) wie die beiden getesteten Dengue-Virus-Proteasen, nicht jedoch alpha-Chymotrypsin (nur 21% Hemmung bei 50 µM), wodurch diesem Inhibitor zumindest eine relative Selektivität gegenüber Serin-Proteasen zugeschrieben werden kann. SH65 zeigte lediglich Protease-Hemmung in den Enzym-Assays, jedoch keine antivirale Aktivität bei der Testung an Dengue-Virus-infizierten Zellen, was aber wiederum bei der synthetisierten Vorstufe von SH65, welche anstelle der beiden Hydroxy-Gruppen über Methoxy-Gruppen verfügt, der Fall war. Diarylthioether mit mehrfach hydroxy-substituiertem Benzothiazol-Baustein stellen hiermit eine neue, vielversprechende Wirkstoffgruppe zur Hemmung sowohl der Dengue-Virus Typ 2- als auch der Dengue-Virus Typ 3 NS2B-NS3 Protease dar.

Anisotrope Kolloide aus flüssigkristallinen Polymeren

In dieser Arbeit wird die Synthese, Charakterisierung und Manipulation anisotroper Kolloide aus flüssigkristallinen Polymeren beschrieben. Um Kolloide verschiedener Größe und aus verschiedenen Polymeren zu erhalten, wurden verschiedene Techniken verwendet. Einerseits wurden Kolloide aus nematischen und smektischen Polymeren mit Durchmessern meist im Bereich von 0,5 bis 3,5 Mikrometern hergestellt. Dazu wurden 16 verschiedene Acrylat- und Methacrylatmonomere synthetisiert und mittels Dispersionspolymerisation polymerisiert. Durch Variation der Polymerisationsbedingungen wurden Kolloide verschiedener Größe und Polydispersität erhalten. Durch Saatpolymerisation konnten zudem die Kugelgrößen bei gleichbleibend geringer Polydispersität erhöht werden. Polarisationsmikroskopie zeigt, dass die meisten Kolloide mit einer Größe zwischen ca. 2 bis 4 Mikrometern eine bipolare Direktorkonfiguration haben. Einige dieser Kolloide wurden mit einer optischen Pinzette mit zirkular polarisiertem Licht eingefangen und rotiert. Zum anderen wurden verschiedene flüssigkristalline Polymere (Polysiloxane, Hauptkettenpolymere und Polyacrylate) durch den Miniemulsionsprozess in Kolloide mit Durchmessern im Bereich von ca. 50 bis 300 nm überführt. Durch Variation der Emulgator- und Polymermenge sowie der Art des Emulgators konnte die Kugelgröße beeinflusst werden. Für die Polysiloxankolloide erfolgte die Aufklärung ihrer inneren Struktur mittels TEM und Kryo-TEM, da durch das Silizium im Polymerrückgrat ohne zusätzliches Anfärben ein Kontrast vorhanden ist. Die TEM-Aufnahmen zeigen deutlich die smektische Schichtstruktur innerhalb der Kolloide aus „verdünnten“ Copolysiloxanen und sind somit der erste direkte Beweis für die Mikrophasenseparation zwischen den Mesogenen und Polysiloxanketten, die bisher basierend auf Röntgenmessungen nur indirekt vorhergesagt wurde. Für die Copolysiloxane mit 2-Ring-Mesogenen wurden zwiebelartige Strukturen und für die Copolysiloxane mit 3-Ring-Mesogenen parallele Schichtstrukturen gefunden. Im ersten Fall folgt die smektische Schichtstruktur der Kugelsymmetrie des Kolloids, im zweiten Fall dominiert die Tendenz der smektischen Schichten, sich parallel anzuordnen.

High resolution study of local stress inside alumina - micro mechanical analysis using laser scanning confocal microscope

The aim of this work is to measure the stress inside a hard micro object under extreme compression. To measure the internal stress, we compressed ruby spheres (a-Al2O3: Cr3+, 150 µm diameter) between two sapphire plates. Ruby fluorescence spectrum shifts to longer wavelengths under compression and can be related to the internal stress by a conversion coefficient. A confocal laser scanning microscope was used to excite and collect fluorescence at desired local spots inside the ruby sphere with spatial resolution of about 1 µm3. Under static external loads, the stress distribution within the center plane of the ruby sphere was measured directly for the first time. The result agreed to Hertz’s law. The stress across the contact area showed a hemispherical profile. The measured contact radius was in accord with the calculation by Hertz’s equation. Stress-load curves showed spike-like decrease after entering non-elastic phase, indicating the formation and coalescence of microcracks, which led to relaxing of stress. In the vicinity of the contact area luminescence spectra with multiple peaks were observed. This indicated the presence of domains of different stress, which were mechanically decoupled. Repeated loading cycles were applied to study the fatigue of ruby at the contact region. Progressive fatigue was observed when the load exceeded 1 N. As long as the load did not exceed 2 N stress-load curves were still continuous and could be described by Hertz’s law with a reduced Young’s modulus. Once the load exceeded 2 N, periodical spike-like decreases of the stress could be observed, implying a “memory effect” under repeated loading cycles. Vibration loading with higher frequencies was applied by a piezo. Redistributions of intensity on the fluorescence spectra were observed and it was attributed to the repopulation of the micro domains of different elasticity. Two stages of under vibration loading were suggested. In the first stage continuous damage carried on until certain limit, by which the second stage, e.g. breakage, followed in a discontinuous manner.

A new double laser pulse pumping scheme for transient collisionally excited plasma soft X-ray lasers

Within this thesis a new double laser pulse pumping scheme for plasma-based, transient collisionally excited soft x-ray lasers (SXRL) was developed, characterized and utilized for applications. SXRL operations from ~50 up to ~200 electron volt were demonstrated applying this concept. As a central technical tool, a special Mach-Zehnder interferometer in the chirped pulse amplification (CPA) laser front-end was developed for the generation of fully controllable double-pulses to optimally pump SXRLs.rnThis Mach-Zehnder device is fully controllable and enables the creation of two CPA pulses of different pulse duration and variable energy balance with an adjustable time delay. Besides the SXRL pumping, the double-pulse configuration was applied to determine the B-integral in the CPA laser system by amplifying short pulse replica in the system, followed by an analysis in the time domain. The measurement of B-integral values in the 0.1 to 1.5 radian range, only limited by the reachable laser parameters, proved to be a promising tool to characterize nonlinear effects in the CPA laser systems.rnContributing to the issue of SXRL pumping, the double-pulse was configured to optimally produce the gain medium of the SXRL amplification. The focusing geometry of the two collinear pulses under the same grazing incidence angle on the target, significantly improved the generation of the active plasma medium. On one hand the effect was induced by the intrinsically guaranteed exact overlap of the two pulses on the target, and on the other hand by the grazing incidence pre-pulse plasma generation, which allows for a SXRL operation at higher electron densities, enabling higher gain in longer wavelength SXRLs and higher efficiency at shorter wavelength SXRLs. The observation of gain enhancement was confirmed by plasma hydrodynamic simulations.rnThe first introduction of double short-pulse single-beam grazing incidence pumping for SXRL pumping below 20 nanometer at the laser facility PHELIX in Darmstadt (Germany), resulted in a reliable operation of a nickel-like palladium SXRL at 14.7 nanometer with a pump energy threshold strongly reduced to less than 500 millijoule. With the adaptation of the concept, namely double-pulse single-beam grazing incidence pumping (DGRIP) and the transfer of this technology to the laser facility LASERIX in Palaiseau (France), improved efficiency and stability of table-top high-repetition soft x-ray lasers in the wavelength region below 20 nanometer was demonstrated. With a total pump laser energy below 1 joule the target, 2 mircojoule of nickel-like molybdenum soft x-ray laser emission at 18.9 nanometer was obtained at 10 hertz repetition rate, proving the attractiveness for high average power operation. An easy and rapid alignment procedure fulfilled the requirements for a sophisticated installation, and the highly stable output satisfied the need for a reliable strong SXRL source. The qualities of the DGRIP scheme were confirmed in an irradiation operation on user samples with over 50.000 shots corresponding to a deposited energy of ~ 50 millijoule.rnThe generation of double-pulses with high energies up to ~120 joule enabled the transfer to shorter wavelength SXRL operation at the laser facility PHELIX. The application of DGRIP proved to be a simple and efficient method for the generation of soft x-ray lasers below 10 nanometer. Nickel-like samarium soft x-ray lasing at 7.3 nanometer was achieved at a low total pump energy threshold of 36 joule, which confirmed the suitability of the applied pumping scheme. A reliable and stable SXRL operation was demonstrated, due to the single-beam pumping geometry despite the large optical apertures. The soft x-ray lasing of nickel-like samarium was an important milestone for the feasibility of applying the pumping scheme also for higher pumping pulse energies, which are necessary to obtain soft x-ray laser wavelengths in the water window. The reduction of the total pump energy below 40 joule for 7.3 nanometer short wavelength lasing now fulfilled the requirement for the installation at the high-repetition rate operation laser facility LASERIX.rn

1,2-Additionen deprotonierter Alpha-Aminonitrile: Umgepolte Imine als vielseitige Synthesebausteine

Von aromatischen Aldehyden abgeleitete α-Aminonitrile können ohne die Anwendung von Schutzgruppen in α-Position deprotoniert werden, wenn keine lithiumhaltigen Basen verwendet werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Reaktionen deprotonierter α-Aminonitrile mit Elektrophilen zu untersuchen. Die Addition von α-Aminocarbanionen an Imine führt unter intramolekularer Eliminierung von HCN zu Endiaminen, die sich in einer Eintopfsynthese abhängig von der Aufarbeitung in 1,2-Diamine oder 1,2-Diimine umwandeln lassen. Die nach Oxidation durch Luftsauerstoff erhaltenen Diimine können mit dem Reduktionsmittel BH3·THF diastereoselektiv reduziert werden. Es hat sich hier gezeigt, dass durch Zugabe einer katalytischen Menge an NaBH4 hauptsächlich die syn-Diamine erhalten werden, der Zusatz von Phthalsäure wiederum liefert bevorzugt die anti-Produkte. In beiden Fällen wird das Produkt in quantitativer Ausbeute erhalten. So konnte also eine effektive diastereoselektive Reduktionsmethode entwickelt werden, die eine freie Wahl der syn- oder anti-Konfiguration ermöglicht. Um enantiomerenreine 1,2-Diamine zu erhalten, wurden verschiedene Methoden getestet. Sowohl auxiliargesteuerte Synthesen mit einem N-Glycosyl-Aminonitril oder mit chiralen Sulfinyliminen als auch die Reduktion durch chirale Borverbindungen (CBS-Katalysatoren, Triacyloxyborhydrid oder Diisopinocamphenylboran), Transferhydrierungen mit chiralen Difluortitanocen-, Noyori- oder Organophosphat-Katalysatoren sowie enantioselektive Hydrierungen mit chiralen Übergangsmetall-katalysatoren waren jedoch nicht erfolgreich. Die Umsetzung der 1,2-Diimine mit Chlormethylethern oder -estern liefert die entsprechenden unsymmetrischen Imidazoliumsalze. Diese konnten zu N-heterocyclischen Carbenen deprotoniert und erfolgreich als Liganden in Suzuki- und Heck-Reaktionen eingesetzt werden. Durch die 1,2-Addition α-deprotonierter Streckerprodukte und anschließende Reduktion im Eintopfverfahren konnten 1,2-Aminoalkohole in mäßigen bis guten Ausbeuten dargestellt werden. Die Umsetzung von α-Aminocarbanionen mit N-Acyliminen erlaubt zudem die Synthese tetrasubstituierter Imidazole und trisubstituierter Oxazole in drei beziehungsweise vier Stufen: Die zunächst gebildeten α-Amino-α-acylaminopropionitrile können isoliert und in Gegenwart von Base einer Retro-Strecker-Reaktion unterworfen werden. Abhängig vom Substitutionsmuster schließt sich in manchen Fällen nach der Eliminierung von HCN direkt die Cyclisierung zum Imidazol an. Nicht cyclisierte Intermediate lassen sich durch Dehydratisierung mit PCl5 zu Imidazolen umsetzen, aber auch unter sauren Bedingungen zu α-Acylaminoketonen hydrolysieren, welche wiederum durch Einwirkung von PCl5 in Oxazole überführt werden können. Auf diese Weise wurden Imidazole und Oxazole in moderaten bis hohen Gesamtausbeuten hergestellt.