Utilização do DELI-teste para avaliação da sensibilidade in vitro do Plasmodium vivax à Cloroquina em condições de campo no município de Tucuruí, Pará

O Estado do Pará é um dos responsáveis pela maioria das notificações de malária na Região Amazônica. Plasmodium vivax é a espécie mais freqüente e a avaliação da sensibilidade do mesmo à cloroquina é essencial para verificar se tal droga mantém sua eficácia. Entretanto, isso não era factível em função da não disponibilidade de metodologia de cultivo de curto prazo e da dificuldade de avaliação da maturação desse parasito. Recentemente, um sistema para cultivo de curto prazo de P. vivax foi introduzido, assim como uma metodologia de mensuração (DELIteste) da maturação/crescimento do parasito baseada na detecção da enzima Lactato Desidrogenase do parasito (pLDH), permitindo estudos de sensibilidade dessa especie plasmodial aos antimaláricos. O objetivo desse trabalho foi então avaliar o desempenho dessa metodologia para avaliar a quimiossensibilidade de P. vivax a cloroquina em condições de campo no município de Tucuruí, no Estado do Para. Foram utilizados 44 pacientes positivos para malária vivax, diagnosticados pelo exame de gota espessa, dos quais, após consentimento, foram coletados 5mL de sangue. Uma suspensão de hemácias de cada paciente, preparada em meio de cultura especial (meios RPMI e Waymouth, soro AB+, hematocrito de 1,8%), foi colocada em cultivo in vitro de curto prazo (48 horas), a 37°C e microaerofilia, frente a uma gama de concentrações (2,34-600ng/mL) de cloroquina. As placas foram então congeladas e, posteriormente, os parasitos foram lisados por congelamento e descongelamento, liberando a pLDH. A mensuração da pLDH foi feita por ELISA-sanduiche (DELI-teste), utilizando como anticorpos de captura os monoclonais 6C9 (anti-pLDH de Plasmodium) e 11D (anti-LDH de P. vivax) e como anticorpo de detecção o monoclonal 19G (anti-pLDH de Plasmodium). Os valores de densidade ótica obtidos permitiram, na maioria dos casos, traçar curvas de sensibilidade a droga e o conseqüente calculo da concentração inibitória de 50% (IC50). Do total de amostras, 53,8% apresentaram melhores curvas com o monoclonal 11D e 46,1% com o monoclonal 6C9. Das 44 amostras, 26 (59,2%) permitiram traçar curvas interpretáveis de sensibilidade a cloroquina. O rendimento de 59% pode ser considerado satisfatório em função da conhecida dificuldade de se cultivar P. vivax in vitro, e das precárias condições de infra-estrutura para realização das culturas. Doze (46,2%) dessas 26 amostras apresentaram IC50 superior ao limiar de 100nM, sendo consideradas resistentes. Esse elevado percentual de amostras com perda e sensibilidade a cloroquina é preocupante e indica que esse tipo de avaliação deve ser continuada e estendida a outras localidades para se ter uma caracterização mais clara dessa situação. O DELIteste é o único capaz de avaliar a resistência in vitro do P. vivax e sua utilização em condições de campo pode contribuir para direcionar estratégias terapêuticas para malária em nosso País.

Leishmania (L.) amazonensis inibe a maturação e a função ativadora das células de Langerhans da pele tratadas com TNF-α e anti-CD40 in vitro

Leishmania amazonensis é um dos principais agentes etiológicos em um amplo espectro de formas clínicas da Leishmaniose Tegumentar Americana. De modo geral, a resistência frente às leishmanioses decorre do desenvolvimento de uma resposta imune celular eficiente, porém muitos estudos têm demonstrado que citocinas específicas ou combinações de citocinas podem ser fatores de resistência ou suscetibilidade à infecção por L. amazonensis. Estudos recentes sugerem a participação das células de Langerhans (LCs) nas resposta anti-Leishmania, porém os mecanismos envolvidos durante esta interação são ainda pouco estudados. Objetivos: Estudar o papel do TNF-α e anti-CD40 nas interações in vitro entre as LCs e L. amazonensis, observando o perfil de citocinas produzidas e a expressão de moléculas de superfície, bem como verificar a capacidade destas células em ativar a produção de IFN-γ e IL-4 por células do linfonodo. Metodologia: As LCs foram isoladas da epiderme de camundongos BALB/c e incubadas com promastigotas de L. amazonensis, TNF-α e/ou anti- CD40. Após 24h, as LCs foram co-cultivadas com células obtidas de linfonodos por 72h. As citocinas IL-6, IL-12, IFN-γ e IL-4 foram dosadas por ensaio imunoenzimático (ELISA) e as moléculas de superfície foram analisadas por citometria de fluxo. Resultados: Os níveis de IL- 6 e IL-12p70 produzidos pela LCs foram significativamente reduzidos após interação com L. amazonensis, mesmo após o tratamento das LCs com TNF-α ou anti-CD40. Em relação às moléculas de superfície, não houve diferença na expressão de CD207 em nenhum dos grupos, porém a presença de L. amazonensis promoveu uma redução significativa na expressão de CD40 nas LCs tratadas com TNF-α ou anti-CD40, e aumentou a expressão de CD86 em todos os grupos. Na presença de L. amazonensis, as células do linfonodo apresentaram uma produção diminuída de IFN-γ e não houve alteração na produção de IL-4. Quando cocultivadas com LCs estimuladas previamente com L. amazonensis, a produção de IFN-γ também foi reduzida, mesmo na presença dos estímulos TNF-α e/ou anti-CD40. Não foram observadas alterações significativas na produção de IL-4 pelas células do linfonodo cocultivadas nas mesmas condições experimentais. Conclusão: L. (L.) amazonensis exerce um efeito imunomodulador sobre a resposta imune mediada por LCs, inibindo a produção de IL-6 e IL-12p70 e expressão de CD40, além de impedir a ativação da produção de IFN-γ por células do linfonodo co-cultivadas com LCs, mesmo após tratamento com TNF-α e anticorpo anti-CD40.