Cinética da enzima alfa-galactosidase a e investigação de doença de fabry em pacientes hemodialisados

A Alfa-galactosidase A (α-Gal A) humana é uma enzima lisossômica que quando deficiente causa a doença de Fabry. A doença de Fabry é uma esfingolipidose cuja principal causa de morbi-mortalidade é a insuficiência renal crônica (IRC). O objetivo deste estudo foi a implantação de um protocolo laboratorial que permita o diagnóstico da doença de Fabry em plasma e leucócitos, além da análise das características cinéticas da enzima α-Gal A em plasma e busca ativa da doença em 25 indivíduos com IRC de causa desconhecida. Também foram avaliadas a reprodutibilidade e a estabilidade do método enzimático. A padronização dos ensaios foi realizada com o substrato fluorescente 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranosídeo. A reprodutibilidade foi avaliada utilizando amostras de plasma aliquotadas a 4ºC, -20ºC e -70ºC, analisadas uma vez ao mês por 6 meses e a estabilidade da fluorescência por até 24 horas após o término do ensaio enzimático. A padronização permitiu a implantação de valores de referência da α-Gal A para o estado do Pará, de 4 a 28 nmoles/h/mL (plasma) e de 20 a 96 nmoles/h/mg proteína (leucócitos). A enzima α-Gal A se mostrou termolábil, visto que com apenas 1 minuto de pré-incubação das amostras a 60ºC, sua atividade decaiu 71,09%. Com relação ao tempo de incubação, a atividade enzimática apresentou uma disposição linear crescente entre 15 a 180 minutos de incubação. A α-Gal A apresentou maior atividade no pH 4,8, o Km encontrado para a α-Gal A foi de 1,007 mM e a Vmáx foi 30,9 nmoles/h/mL. A melhor temperatura de armazenamento de plasma até o ensaio enzimático é -20ºC, onde foi observada menor variação em um período máximo de 6 meses. O método enzimático utilizado é estável, mesmo após 24 horas do término do ensaio, em temperatura ambiente. Com relação aos pacientes com IRC de causa desconhecida, todos apresentaram valor de atividade da α-Gal A dentro dos parâmetros de referência e, portanto, nenhum foi diagnosticado com doença de Fabry. O entendimento da cinética da α-Gal A e do seu comportamento in vitro possibilita um melhor diagnóstico laboratorial da doença de Fabry gerando dados para futuras comparações com indivíduos afetados por mutações nesta enzima

Caracterização molecular de Vibrio cholerae O1 sacarose negativa de isolados clínicos e ambiente na Amazônia brasileira

O V.cholerae é um microorganismo autóctone do ambiente aquático e os sorogrupos O1 e O 139 estão ligados a pandemia e epidemia de cólera. Os V.cholerae não O1 e não O139 ou vibrios não aglutinantes (NAGs) estão envolvidos em casos isolados e surtos de diarréia semelhantes à cólera. No decorrer da sétima pandemia houve o surgimento de diversos isolados “El Tor atípicos”. Entre estes se encontra a variante bioquímica do V.cholerae O1 que não fermenta a sacarose no TCBS em 18 a 24 horas que é o tempo de incubação convencional. Neste trabalho foram estudados 138 isolados de V.cholerae O1 e não O1 não fermentador da sacarose no TCBS de procedência clínica e ambiental, obtidos entre 1994 e 1995 na Amazônia Brasileira (Estados do Pará, Amapá e Amazonas). Avaliou-se a fermentação da sacarose no TCBS e em caldo; o perfil de suscetibilidade a oito diferentes antimicrobianos em ágar difusão; a relação clonal entre os V.cholerae O1 e NAG clínicos e ambientais pelo PFGE e a presença de genes de virulência ctxAB e tcpA pela reação em cadeia da polimerase. Observou-se que as amostras de V.cholerae não fermentaram a sacarose em 24 de incubação no ágar TCBS e em caldo, 43% utilizaram a sacarose em 24 horas e 57% a fermentavam tardiamente (tempo superior a 24 horas). Os isolados apresentaram baixo percentual de resistência a antimicrobianos (8,7%) e nenhum caso de multiresistência. Em relação aos genes de virulência, de um modo geral, os isolados de V.cholerae O1 apresentavam o tcpA e o ctxAB. Nos não O1 estes estavam ausentes, com exceção de um isolado clínico não O1 (gene tcpA+). A análise do PFGE revelou pulsotipos distintos entre os O1 e NAGs, embora dois destes últimos tenham apresentado relação clonal com os O1 clínicos. Todos os O1 clínicos apresentaram relação clonal com isolados de referência da sétima pandemia.