Sequence characterization of coding regions of the myostatin gene (GDF8) from Brazilian Murrah buffaloes (Bubalus bubalis) and comparison with the Bos taurus sequence

Within about 30 years the Brazilian buffalo (Bubalus bubalis) herd will reach approximately 50 million head as a result of the great adaptive capacity of these animals to tropical climates, together with the good productive and reproductive potential which make these animals an important animal protein source for poor and developing countries. The myostatin gene (GDF8) is important in the physiology of stock animals because its product produces a direct effect on muscle development and consequently also on meat production. The myostatin sequence is known in several mammalian species and shows a high degree of amino acid sequence conservation, although the presence of non-silent and silent changes in the coding sequences and several alterations in the introns and untranslated regions have been identified. The objective of our work was to characterize the myostatin coding regions of B. bubalis (Murrah breed) and to compare them with the Bos taurus regions looking for variations in nucleotide and protein sequences. In this way, we were able to identify 12 variations at DNA level and five alterations on the presumed myostatin protein sequence as compared to non double-muscled bovine sequences.

Isolamento, caracterização e expressão em sistema bacteriano de um gene que codifica uma proteína transportadora de lipídeos de Piper nigrum

A pimenteira-do-reino (Piper nigrum L.) constitui uma das espécies de pimenta mais amplamente utilizadas no mundo, pertencendo à família Piperaceae, a qual compreende cerca de 1400 espécies distribuídas principalmente no continente americano e sudeste da Ásia, onde esta cultura originou. A pimenteira-do-reino foi introduzida no Brasil no século XVII, e tornou-se uma cultura de importância econômica desde 1933. O Estado do Pará é o principal produto brasileiro de pimenta-do-reino, contudo sua produção vem sendo afetada pela doença fusariose causada pelo fungo Fusarium solani f. sp. piperis. Estudos prévios revelaram a identificação de sequencias de cDNA diferencialmente expressas durante a interação da pimenteira-do-reino com o F. solani f. sp. piperis. Entre elas, uma sequencia de cDNA parcial que codifica para uma proteína transportadora de lipídeos (LTP), a qual é conhecida por seu importante papel na defesa de plantas contra patógenos e insetos. Desta forma, o objetivo principal deste trabalho foi isolar e caracterizar as sequencias de cDNA e genômica de uma LTP de pimenteira-do-reino, denominada PnLTP. O cDNA completo da PnLTP isolado por meio de experimentos de RACE apresentou 621 bp com 32 pb and 235 bp nas regiões não traduzidas 5‘ e 3‘, respectivamente. Este cDNA contem uma ORF de 354 bp codificando uma proteína deduzida de 117 resíduos de aminoácidos que apresentou alta identidade com LTPs de outras espécies vegetais. Análises das sequencias revelou que a PnLTP contem um potencial peptídeo sinal na extremidade amino-terminal e oito resíduos de cisteína preditos por formar quatro pontes de dissulfeto, as quais poderiam contribuir para a estabilidade desta proteína. O alinhamento entre as sequencias de cDNA e genômica revelou a ausência de introns na região codificante do gene PnLTP, o que está de acordo ao encontrado em outros genes de LTPs de plantas. Por último, a PnLTP madura foi expressa em sistema bacteriano. Experimentos adicionais serão realizados com o objetivo de avaliar a habilidade da PnLTP recombinante em inibir o crescimento do F. solani f. sp. piperis.

Avaliação do perfil de metilação e expressão do gene CDH1 em Cebus apella como modelo experimental para câncer gástrico

O câncer gástrico continua sendo uma importante causa de morte dentre os tipos de câncer no Brasil e no mundo. A origem do câncer de estomago provém, assim como nos demais, de acúmulo de alterações genéticas. Portanto, se faz necessário saber quais alterações genéticas são importantes para desencadear a patogênese do câncer gástrico. O MNU, conhecido carcinógeno, quando ingerido de forma oral em doses determinadas desencadeia o desenvolvimento de adenocarcinoma gástrico do tipo intestinal, com aparecimento de estágios pré definidos característico deste tipo tumoral. Com base nestes conhecimentos, realizamos um experimento com 6 macacos da espécie Cebus apella induzidos à desenvolver câncer gástrico do tipo intestinal. Os animais ingeriam 16mg/kg de peso diariamente da droga, com desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas em todos. Infelizmente, devido à toxicidade da droga, somente um animal sobreviveu ao tratamento e desenvolveu desenvolveu uma massa tumoral propriamente dita. Foram feitas avaliações periódicas dos animais, em dias pré-determinados (ao início, no 120º, 150º, 300º, 940º) com coletas de fragmentos da mucosa gástrica. Foram coletadas 20 amostras de tecido, distribuídas entre mucosa normal, gastrite, displasia, metaplasia e tumoral. Destas amostras extraímos DNA para as análises do gene CDH1. Não há na literatura sequencia deste gene para a espécie utilizada no estudo. Com este objetivo, utilizamos iniciadores construídos a partir de sequencias de CDH1 de Callithrix jacchus (espécie filogeneticamente) e seqüenciamos cerca de 342pb da região promotora de CDH1 de C. apella. As análises mostraram uma similaridade de 98% desta região com a dos humanos, com presença de vários sítios de ligação de fatores de transcrição (sp1, Ap2, NF-x, AREB6, Puf e CTF) além da presença do CAAT Box. Esta região ainda possui 30 sitios CpGs, o que indica que ela pode estar sofrendo regulação epigenética. Para se verificar como se encontrava o padrão de metilação desta região realizamos uma análise de MSP com iniciadores específicos e constatamos que houve predominância de alelos não metilados de CDH1 para todas as amostras pré neoplásicas e a amostra de adenocarcinoma encontra-se metilada. O que pode ser constatado com um ensaio de Imunohistoquímica, onde somente a amostra tumoral não expressava a proteína caderina. Desta maneira nossas análises sugerem que a metilação do gene CDH1 desempenha papel importante na tumorigênese gástrica em C. apella, e é um evento tardio, uma vez que não é observado nos outro tipos teciduais não tumorais E, partindo-se da similaridade entre as seqüências, podemos sugerir que o mesmo evento pode está ocorrendo em humanos. Esta metilação do promotor do CDH1 leva a um silenciamento deste gene o que desencadeia o estabelecimento de adenocarcinomas gástricos, fato apoiado pela literatura onde vários trabalhos apontaram que a hipermetilação do promotor da caderina está associada ao desenvolvimento do câncer gástrico.

Análise de mutações no gene GJB2 em indivíduos com deficiência auditiva neurossensorial não sindrômica

A surdez é o defeito sensorial mais frequente nos seres humanos, podendo ter diferentes causas ambientais ou hereditárias. Em países desenvolvidos, estimativas sugerem que em cada 1000 nascidos dois manifestam algum tipo de surdez e mais de 60% desses casos são de origem genética. No Brasil, muito pouco ainda é conhecido sobre surdez hereditária, acreditasse que quatro em cada mil recém-nascidos manifestem algum tipo de deficiência auditiva e que a frequência da surdez causada por fatores genéticos seja da ordem de 16%, enquanto os 84% restantes dos casos sejam causado por fatores ambientais e de etiologia desconhecida. As várias formas de surdez hereditária já identificada são muito raras, com exceção de uma causada por mutações no gene GJB2 que codifica a conexina 26. As conexinas representam uma classe de família de proteínas responsáveis pela formação de canais de comunicação entre células adjacentes (Gap Junctions), esta comunicação entre células adjacentes é fundamental para o crescimento e para a diferenciação de tecidos. Até o presente foram descritas 102 mutações do GJB2 que estão associadas com surdez hereditária. Três mutações se destacam por apresentarem frequência elevada em grupos populacionais específicos: 35delG entre europeus e brasileiros; 167delT entre Judeus askenazitas; e 235delG entre asiáticos. Neste trabalho, foi realizada a análise molecular de toda a sequência codificadora do gene GJB2 (Conexina 26) em uma amostra populacional constituída de 30 indivíduos não aparentados com surdez esporádica pré-lingual não sindrômica provenientes da população de Belém do Pará. O DNA foi obtido através de amostras de sangue periférico e analisado por meio da técnica convencional de PCR seguida do sequenciamento automático. Mutações no gene da Conexina 26 foram observadas em 20% da amostra (6/30). As mutações 35delG e R143W foram observadas em um único paciente (1/30), as duas no estado heterozigoto e relacionadas com a surdez do paciente. Duas outras mutações foram observadas em diferentes indivíduos: G160S em 1 paciente correspondendo a 3,3% (1/30); e V27I foi observado em 4 indivíduos com frequência alélica de 0.08; contudo as mutações G160S e V27I não estão relacionadas com a surdez. Neste trabalho as frequências observadas de mutações são equivalentes a frequências observadas em outras populações anteriormente estudadas. Esses resultados indicam que mutações no gene GJB2 são importantes causas de surdez em nossa região e não se pode excluir que a possibilidade da surdez apresentada por alguns indivíduos possa ser decorrente, principalmente, por fatores ambientais como processos infecciosos ocorridos durante a gestação, ou nos primeiros meses de vida.

Characterization of polymorphisms in the mannose-binding lectin gene promoter among human immunodeficiency virus 1 infected subjects

ABSTRACT: The present study investigated the prevalence of mutations in the -550 (H/L) and -221 (X/Y) mannose-binding lectin (MBL) gene promoter regions and their impact on infection by human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) in a population of 128 HIV-1 seropositive and 97 seronegative patients. The allele identification was performed through the sequence-specific primer polymerase chain reaction method, using primer sequences specific to each polymorphism. The evolution of the infection was evaluated through CD4+ T-lymphocyte counts and plasma viral load. The allele and haplotype frequencies among HIV-1-infected patients and seronegative healthy control patients did not show significant differences. CD4+ T-lymphocyte counts showed lower levels among seropositive patients carrying haplotypes LY, LX and HX, as compared to those carrying the HY haplotype. Mean plasma viral load was higher among seropositive patients with haplotypes LY, LX and HX than among those carrying the HY haplotype. When promoter and exon 1 mutations were matched, it was possible to identify a significantly higher viral load among HIV-1 infected individuals carrying haplotypes correlated to low serum levels of MBL. The current study shows that haplotypes related to medium and low MBL serum levels might directly influence the evolution of viral progression in patients. Therefore, it is suggested that the identification of haplotypes within the promoter region of the MBL gene among HIV-1 infected persons should be further evaluated as a prognostic tool for AIDS progression.

Polymorphism in the promoter region of the mannose-binding lectin gene among human T-cell lymphotropic virus infected subjects

ABSTRACT: The present study investigated the frequency of the mutations at positions -550 and -221 of the mannose-binding lectin (MBL) gene in a sample of 75 human T-cell lymphotropic virus (HTLV) infected patients and 96 HTLV seronegative controls, in order to evaluate the occurrence of a possible association between the polymorphism and HTLV infection. A sequence specific primer-polymerase chain reaction was used for discrimination of the polymorphism. The analysis of allele frequencies at position -550 did not show any significant differences between HTLV infected group and controls, but there was a significant difference at position -221. The comparative analysis of haplotypes frequencies were not significant, but the genotype frequencies between the two groups, revealed a higher prevalence of genotype LYLX (25.3%), associated with medium and low MBL serum levels among HTLV infected subjects. The odds ratio estimation demonstrated that the presence of genotype LYLX was associated with an increased risk of HTLV infection (p = 0.0096; 1.38 < IC95% < 7.7605). There was no association between proviral load and the promoter polymorphism, but when promoter and exon 1 mutations were matched, it was possible to identify a significant higher proviral load among HTLV infected individuals carrying haplotypes correlated to low serum levels of MBL. The present study shows that the polymorphism in the promoter region of the MBL gene may be a genetic marker associated with HTLV infection, and emphasizes the need for further studies to determinate if the present polymorphism have any impact on diseases linked to HTLV infection.

Polimorfismo da região promotora do gene MBL (Mannose-Binding Lectin) e o seu impacto na infecção pelo Vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1) e na progressão da SIDA/AIDS

Um emergente interesse à MBL tem surgido, devido a sua importância no sistema imune inato. Recentes estudos relatam uma influência do polimorfismo na região promotora nas regiões -550 (H/L) e -221 (X/Y) do gene MBL, com a deficiência do sistema imune à determinados patógenos. O objetivo do presente estudo é investigar a associação entre o polimorfismo na região promotora do gene MBL e a infecção pelo HIV-1e a progressão à SIDA/AIDS. No estudo foi feita identificação destes alelos em uma população de 127 pacientes soropositivos para HIV-1 e em 97 indivíduos soronegativos, a partir da técnica de SSP-PCR, utilizando-se seqüências de iniciadores específicos para cada variante. A evolução da infecção nos pacientes soropositivos foi avaliada por meio da contagem de linfócito T CD4⁺ e da carga viral plasmática. As distribuições nas freqüências alélicas e haplotípicas entre os grupos de portadores do HIV-1 e nos controles soronegativos não apresentaram diferenças estatisticamente significantes (p>0,05). Entretanto, pacientes soropostivos portadores do haplótipo HY apresentaram uma maior contagem e uma evolução significativa no número de linfócitos T CD4⁺; e uma menor contagem e maior redução da carga viral plasmática, em relação aos pacientes portadores dos haplótipos LY, LX e HX. Os resultados do presente estudo mostram que a presença de haplótipos relacionados a médios e baixos níveis séricos de MBL podem ter um papel direto na forma como o paciente soropositivo evolui laboratorialmente. Desse modo, conclui-se que a caracterização dos haplótipos da região promotora do gene MBL em portadores da infecção pelo HIV-1 pode ser importante na avaliação do prognóstico de evolução da SIDA/AIDS.

Nested-PCR do gene que codifica o antígeno b aplicada ao diagnóstico da tuberculose pulmonar

A reação em cadeia da polimerase usada para amplificação de uma seqüência interna de um fragmento previamente amplificado (nested-PCR) foi investigada como uma alternativa complementar a pesquisa de bacilos álcool ácido resistentes e a cultura do Mycobacterium tuberculosis em meio de Lowenstein-Jensen. Foram investigadas 144 amostras de escarro de pacientes suspeitos de tuberculose encaminhados ao Laboratório de Tuberculose do Instituto Evandro Chagas em Belém, no período de junho de 2002 a dezembro de 2003. Das 144 amostras, 121 foram caracterizadas como tuberculose, 119 foram positivas na cultura, 95 na baciloscopia e 128 na nested-PCR. A sensibilidade da nested-PCR foi 96% (116/121), enquanto a especificidade foi 48% (11/23). A nested-PCR poderá ser uma ferramenta complementar para o diagnóstico da tuberculose, pois apresenta sensibilidade equivalente à cultura, no entanto, necessita de maiores avaliações visando minimizar o número de resultados falso-positivos.