Soroepidemiologia e caracterização molecular da infecção pelo Vírus linfotrópico de células T humanas 1 e 2 (HTLV-1/2) em mulheres gestantes na cidade de Belém, Pará

A infecção pelo HTLV-1/2 já foi investigada em diversas populações, mostrando prevalência variável conforme a área geográfica, grupos étnicos e subpopulações analisadas. Em estudos brasileiros foi observada uma maior prevalência nos Estados da Bahia e do Pará. O presente estudo teve como objetivo avaliar a prevalência do HTLV em mulheres grávidas na cidade de Belém, Pará, por meio de técnicas sorológicas e moleculares. Foram coletadas 1.027 amostras de sangue e alíquotas de plasmas foram testadas para a presença de anticorpos anti-HTLV-1/2, utilizando o método imunoenzimático do tipo ELISA. A confirmação da infecção e diferenciação dos tipos e subtipos virais foi realizada por meio da Reação em Cadeia mediada pela Polimerase em duas etapas (Nested PCR) através da amplificação gênica das regiões pX, env e 5’LTR seguido da análise de RFLP e seqüenciamento. Foram detectados seis (0,58%) casos de sororreatividade para o HTLV que posteriormente foram confirmados pela amplificação de um fragmento de 159 pb da região pX. A análise de RFLP com a enzima TaqI mostrou que quatro (66,7%) amostras eram positivas para HTLV-1 e duas (33,3%) para HTLV-2. Uma das amostras HTLV-2 teve o fragmento de 630 pb do gene env amplificado. A análise com a endonuclease XhoI mostrou a presença de um perfil de RFLP característico dos subtipos HTLV-2a/2c. Duas amostras HTLV-1 e uma HTLV-2 tiveram a região 5’LTR amplificada e seqüenciada. Por meio da análise filogenética foi possível classificar as amostras HTLV-1 como Cosmopolita Transcontinental e a HTLV-2 como pertencente ao subtipo HTLV-2c. Esse estudo mostra a relevância de se introduzir o teste para HTLV na triagem pré-natal, a fim de reduzir transmissão vertical e horizontal em nosso estado.

Nested-PCR do gene que codifica o antígeno b aplicada ao diagnóstico da tuberculose pulmonar

A reação em cadeia da polimerase usada para amplificação de uma seqüência interna de um fragmento previamente amplificado (nested-PCR) foi investigada como uma alternativa complementar a pesquisa de bacilos álcool ácido resistentes e a cultura do Mycobacterium tuberculosis em meio de Lowenstein-Jensen. Foram investigadas 144 amostras de escarro de pacientes suspeitos de tuberculose encaminhados ao Laboratório de Tuberculose do Instituto Evandro Chagas em Belém, no período de junho de 2002 a dezembro de 2003. Das 144 amostras, 121 foram caracterizadas como tuberculose, 119 foram positivas na cultura, 95 na baciloscopia e 128 na nested-PCR. A sensibilidade da nested-PCR foi 96% (116/121), enquanto a especificidade foi 48% (11/23). A nested-PCR poderá ser uma ferramenta complementar para o diagnóstico da tuberculose, pois apresenta sensibilidade equivalente à cultura, no entanto, necessita de maiores avaliações visando minimizar o número de resultados falso-positivos.

Molecular analysis of three FUT3 gene single nucleotide polymorphisms and their relationship with the lewis erythrocytary phenotype in a human population of japanese-ancestry living in Tomé Açu, a town in the Brazilian Amazon

The Lewis blood group system involves two major antigens, Le^ª and Le^b. Their antigenic determinants are not primary gene products but are synthesized by the transfer of sugar subunits to a precursory chain by a specific enzyme which is the product of the FUT3 gene (Lewis gene). The presence of three FUT3 gene single nucleotide polymorphisms (SNPs) (59T > G; 508G > A and 1067T > A) was related to the Lewis phenotype of erythrocytes from 185 individuals of Japanese ancestry living in the town of Tomé-Açu in the Brazilian Amazon region. This relationship was detected using a serological hemagglutination test and the Dot-ELISA assay along with the molecular technique PCR-RFLP. We found that the three SNPs investigated in this study only accounted for a proportion of the Lewis-negative phenotype of the erythrocytes.

Determination of strains of Helicobacter pylori and of polymorphism in the interleukin-8 gene in patients with stomach cancer

CONTEXTO: A neoplasia gástrica é a segunda causa mais comum de morte por câncer no mundo e o H. pylori é classificado como carcinógeno humano tipo I pela Organização Mundial de Saúde. Entretanto, apesar da elevada prevalência da infecção pelo H. pylori em todo mundo, menos de 3% de indivíduos portadores dessa bactéria desenvolvem neoplasias gástricas. Tal fato indica que a evolução para malignização possa estar associada a fatores bacterianos, do hospedeiro e do ambiente. OBJETIVOS: Investigou-se a associação do polimorfismo da região promotora do gene IL-8 (-251) e do genótipo do H. pylori, baseado nos alelos vacA e na presença do gene cagA, com a clínica e os dados histopatológicos. MÉTODOS: Em estudo prospectivo, 102 pacientes com câncer gástrico e 103 voluntários saudáveis foram analisados. O polimorfismo da IL-8 (-251) foi determinado pela reação de PCR-RFLP e sequenciamento. Para genotipagem dos alelos vacA e do gene cagA das cepas bacterianas foi utilizada a PCR. As biopsias gástricas foram avaliadas histologicamente. RESULTADOS: A sorologia para o H. pylori foi positiva em 101 (99%) de todos os pacientes analisados, e 98 (97%) deles foram colonizados por apenas uma cepa bacteriana. Em pacientes com monoinfecção, 82 (84%) das cepas bacterianas observadas apresentavam o genótipo s1b/m1. O gene cagA foi detectado em 74 (73%) dos pacientes infectados pelo H. pylori. A presença do gene cagA demonstrou estar associada com a presença do genótipo s1b/m1 do gene vacA (P = 0,002). Quanto ao polimorfismo do gene da IL-8 (-251), observou-se que os genótipos AA (P = 0,026) e AT (P = 0,005) foram mais frequentes no grupo de pacientes com adenocarcinoma gástrico. Comparando os diferentes tipos de cepas bacterianas isoladas, com o polimorfismo do gene da IL-8-251 e dados histopatológicos, observou-se que, portadores do alelo A (AT e AA) infectados por cepas virulentas (m1s1 cagA+), demonstraram risco aumentado de apresentar maior grau de inflamação (OR = 24,75 IC 95% 2,29-267,20 P = 0,004) e aumento da atividade neutrofílica (OR = 28,71 IC 95% 2.62-314 P = 0,002) na mucosa gástrica. CONCLUSÃO: Os resultados demonstram que a interação entre o polimorfismo do gene da IL-8, particularmente em portadores do alelo A, e o tipo de cepa infectante do H. pylori (s1m1 cagA positiva) desempenha importante função no desenvolvimento do câncer gástrico.

RT-PCR for confirmation of echovirus 30 isolated in Belém, Brazil

Echovirus (Echo) 30 or human enterovirus B is the most frequent enterovirus associated with meningitis cases. Epidemics and outbreaks of this disease caused by Echo 30 have occurred in several countries. In Brazil, Echo 30 has been isolated from sporadic cases and outbreaks that occurred mainly in the south and southeast regions. We used RT-PCR to examine Echo 30 isolates from meningitis cases detected from March 2002 to December 2003 in Belém, state of Pará, in northern Brazil. The patients were attended in a Basic Health Unit (State Health Secretary of Pará), where cerebrospinal fluid (CSF) was collected and stored in liquid nitrogen. Weekly visits were made by technicians from Evandro Chagas Institute to the health unit and samples were stored at -70ºC in the laboratory until use. HEp-2 and RD cell lines were used for viral isolation and neutralization with specific antisera for viral identification. RNA extraction was made using Trizol reagent. The RT-PCR was made in one step, and the total mixture (50 µL) was composed of: RNA, reaction buffer, dNTP, primers, Rnase inhibitor, reverse transcriptase, Taq polymerase and water. The products were visualized in agarose gel stained with ethidium bromide, visualized under UV light. Among the 279 CSF samples examined, 30 (10.7%) were EV positive, 29 being Echo 30 and one was Cox B. Nineteen Echo 30 were examined with RT-PCR; 18 tested positive (762 and 494 base pairs). The use of this technique permitted viral identification in less time than usual, which benefits the patient and is of importance for public-health interventions.

Direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in bovine and bubaline tissues through nested-PCR

Post-mortem bacterial culture and specific biochemical tests are currently performed to characterize the etiologic agent of bovine tuberculosis. Cultures take up to 90 days to develop. A diagnosis by molecular tests such as PCR can provide fast and reliable results while significantly decreasing the time of confirmation. In the present study, a nested-PCR system, targeting rv2807, with conventional PCR followed by real-time PCR, was developed to detect Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) organisms directly from bovine and bubaline tissue homogenates. The sensitivity and specificity of the reactions were assessed with DNA samples extracted from tuberculous and non-tuberculous mycobacteria, as well as other Actinomycetales species and DNA samples extracted directly from bovine and bubaline tissue homogenates. Regarding the analytical sensitivity, DNA of the M. bovis AN5 strain was detected up to 1.5 pg by nested-PCR, whereas DNA of M. tuberculosis H37Rv strain was detected up to 6.1 pg. The nested-PCR system showed 100% analytical specificity for MTC when tested with DNA of reference strains of non-tuberculous mycobacteria and closely-related Actinomycetales. A clinical sensitivity level of 76.7% was detected with tissues samples positive for MTC by means of the culture and conventional PCR. A clinical specificity of 100% was detected with DNA from tissue samples of cattle with negative results in the comparative intradermal tuberculin test. These cattle exhibited no visible lesions and were negative in the culture for MTC. The use of the nested-PCR assay to detect M. tuberculosis complex in tissue homogenates provided a rapid diagnosis of bovine and bubaline tuberculosis.

Investigação de Leishmania SP em carrapatos de cães de bairros de Imperatriz-MA, através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A Leishmaniose é uma doença causada pelo protozoário Leishmania sp, podendo acometer homem e animais dependendo da espécie do parasita, São transmitidos pelos flebotomíneos fêmeas, insetos do gênero Lutzomyia, que ao exercer o hematofagismo inoculam as formas promastigota infectantes, mas recentemente, tem sido levantado hipóteses sobre a transmissão por carrapatos. Segundo a vigilância epidemiológica de Imperatriz-MA a cidade é endêmica tanto para Leishmaniose Tegumentar (LT) quanto para a Leishmaniose Visceral (LV). Este trabalho teve como objetivo principal investigar a presença de DNA de Leishmania sp em carrapatos coletados de cães atendidos em petshop e Centro de Controle de Zoonoses do município de Imperatriz utilizando a técnica de PCR. O DNA foi extraído a partir de 640 carrapatos fêmeas e testadas utilizando o primer que amplifica o gene de mini-exon de Leishmania sp. Os carrapatos foram coletados de 41 cães de diferentes bairros da cidade de Imperatriz. A maioria dos carrapatos foram identificados como Rhipicephalus sanguineus. Os seguintes sinais clínicos sugestivos de leishmaniose foram observados nos cães: onicogrifose em 53,65% (22/41); úlceras em 63,41% (26/41), a perda de cabelo e inapetência em 39,02% (16/41). Cento e setenta carrapatos (26,56%) coletados de 16 cães apresentaram DNA de Leishmania do subgênero Viannia, responsável pela forma cutânea da doença. Não foi detectado nenhum DNA de Leishmania infantum chagasi. Carrapatos infectados foram coletados de ambos os cães sintomáticos e assintomáticos. Embora ainda não tenha sido demonstrado que os carrapatos possam transmitir Leishmania aos cães sob condições naturais, o resultado deste estudo tem vários aspectos importantes, pois é um método não-invasivo de detecção, capaz de diferenciar os grupos de parasitas em circulação, em especial se os animais não têm lesões, pode ser um indicador biológico em locais onde não é feito uma investigação sorológica e nem entomológica, podendo dar suporte aos programas de vigilância de saúde local.

Molecular analysis of three FUT3 gene single nucleotide polymorphisms and their relationship with the lewis erythrocytary phenotype in a human population of japanese-ancestry living in Tomé Açu, a town in the Brazilian Amazon

The Lewis blood group system involves two major antigens, Le^a and Le^b. Their antigenic determinants are not primary gene products but are synthesized by the transfer of sugar subunits to a precursory chain by a specific enzyme which is the product of the FUT3 gene (Lewis gene). The presence of three FUT3 gene single nucleotide polymorphisms (SNPs) (59T > G; 508G > A and 1067T > A) was related to the Lewis phenotype of erythrocytes from 185 individuals of Japanese ancestry living in the town of Tomé-Açu in the Brazilian Amazon region. This relationship was detected using a serological hemagglutination test and the Dot-ELISA assay along with the molecular technique PCR-RFLP. We found that the three SNPs investigated in this study only accounted for a proportion of the Lewis-negative phenotype of the erythrocytes.

Identification of blood meal sources of Lutzomyia longipalpis using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis of the cytochrome B gene

An analysis of the dietary content of haematophagous insects can provide important information about the transmission networks of certain zoonoses. The present study evaluated the potential of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis of the mitochondrial cytochrome B (cytb)gene to differentiate between vertebrate species that were identified as possible sources of sandfly meals. The complete cytb gene sequences of 11 vertebrate species available in the National Center for Biotechnology Information database were digested with Aci I, Alu I, Hae III and Rsa I restriction enzymes in silico using Restriction Mapper software. The cytb gene fragment (358 bp) was amplified from tissue samples of vertebrate species and the dietary contents of sandflies and digested with restriction enzymes. Vertebrate species presented a restriction fragment profile that differed from that of other species, with the exception of Canis familiaris and Cerdocyon thous. The 358 bp fragment was identified in 76 sandflies. Of these, 10 were evaluated using the restriction enzymes and the food sources were predicted for four: Homo sapiens (1), Bos taurus (1) and Equus caballus (2). Thus, the PCR-RFLP technique could be a potential method for identifying the food sources of arthropods. However, some points must be clarified regarding the applicability of the method, such as the extent of DNA degradation through intestinal digestion, the potential for multiple sources of blood meals and the need for greater knowledge regarding intraspecific variations in mtDNA.