5 resultados para somatic hybridisation

em Lume - Repositório Digital da Universidade Federal do Rio Grande do Sul


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A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

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Considerando não apenas a importância das antraciclinas na terapêutica do câncer, mas também os efeitos colaterais associados ao uso destas drogas, o presente estudo procurou avaliar a atividade genotóxica de seis antraciclinas em uso clínico - doxorrubicina (DOX), daunorrubicina (DNR), epirrubicina (EPI), idarrubicina (IDA), além dos análogos de última geração, pirarrubicina (THP) e aclarrubicina (ACLA). Para tanto, foi empregado o Teste de Mutação e Recombinação Somática (SMART) em Drosophila melanogaster, que permite a detecção simultânea de mutação gênica e cromossômica, assim como de eventos relacionados com recombinação mitótica - possibilitando quantificar a contribuição deste último parâmetro genético para a genotoxicidade total induzida pelas drogas em estudo. Os dados obtidos a partir desta análise demonstraram que todas as antraciclinas estudadas induziram acréscimos significativos, relacionados tanto à mutação, quanto à recombinação nas células somáticas deste inseto. Além disso, a recombinação mitótica - entre cromossomos homólogos - foi o evento responsável por, aproximadamente, 62 a 100% da toxicidade genética observada. A comparação do potencial genotóxico dos diferentes análogos, através da padronização do número de danos genéticos por unidade de tratamento (mM), caracterizou a ACLA e o THP como as drogas mais potentes – sendo cerca de 20 vezes mais efetivas, como genotoxinas, do que a DOX, o análogo menos potente. Já que a principal ação genotóxica desta família de compostos está relacionada à inibição da topoisomerase II (topo II) – uma enzima que atua no relaxamento da supertorção da dupla hélice de DNA, através da quebra e posterior religação de suas fitas - as diferenças observadas podem ser atribuídas ao mecanismo envolvido neste bloqueio Enquanto os análogos DOX, DNR, EPI, IDA e THP atuam como venenos de topo II - tornando permanentes as quebras induzidas pela enzima - a ACLA inibe a função catalítica desta enzima, impedindo a sua ligação ao DNA. Cabe ainda ressaltar que a genotoxicidade da ACLA não está restrita à sua atividade catalítica sobre a topo II, mas também à sua ação como veneno de topo I e à sua habilidade de intercalar-se na molécula de DNA. Quando a potência genotóxica destas drogas foi associada a suas estruturas químicas, observou-se que substituições no grupamento amino-açúcar levaram a uma maior atividade tóxico-genética, quando comparadas a modificações no cromóforo. Cabe ainda ressaltar que as modificações estruturais, presentes nos análogos DOX, DNR, EPI, IDA e THP, não alteraram a sua ação recombinogênica. No entanto, no que se refere a ACLA, observaram-se decréscimos significativos na indução de recombinação mitótica - que podem ser atribuídas às múltiplas substituições presentes tanto no grupamento amino-açúcar quanto no cromóforo. O conjunto destas observações evidencia que a genotoxicidade total das drogas em estudo está centrada na indução de recombinação homóloga - um evento predominantemente envolvido tanto na iniciação, quanto na progressão do câncer. A alta incidência de tumores secundários, em pacientes submetidos ao tratamento com as antraciclinas, pode, pois, ser atribuída à ação preferencial destas drogas sobre a recombinação mitótica – embora a atividade mutagênica não possa ser desconsiderada.

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A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

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Introdução: Esta tese de doutorado é mais uma contribuição do Grupo de Qualidade de Vida (Centro Brasileiro) do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas: Psiquiatria, da UFRGS. Esse grupo têm trabalhado em projetos transculturais de elaboração de instrumentos de qualidade de vida (QV) sob a coordenação da Organização Mundial de Saúde. Entre os instrumentos genéricos de QV já desenvolvidos estão o WHOQOL-100 e o WHOQOL-Bref e entre os instrumentos específicos, para populações especiais, estão o WHOQOL-HIV, o WHOQOL-SRPB e, mais recentemente, o WHOQOL-OLD. O desenvolvimento de uma escala de QV para idosos é especialmente importante tendo em vista especificidades deste grupo etário, bem como o aumento da proporção de idosos na população mundial. Objetivos: O objetivo maior deste estudo é desenvolver uma escala de QV para idosos (WHOQOL-OLD). Entretanto, como trata-se de um processo com longa duração de tempo, foram gerados objetivos específicos a partir da revisão da literatura e coleta de dados, que deram origem a 5 artigos, cada um com sua proposta, a saber: artigo 1. Apresentar a metodologia utilizada e os resultados dos grupos focais para avaliação de QV do idoso, artigo 2. Identificar variáveis relevantes na QV de pessoas idosas, artigo 3. Investigar a relação da percepção de QV do idoso com a percepção de QV do idoso na opinião de seu cuidador, artigo 4. Investigar variáveis associadas com percepção subjetiva de saúde em idosos internados e artigo 5. Pesquisar um possível viés nas respostas de idosos no Inventário de Depressão de Beck (BDI). Métodos: O primeiro estudo teve um desenho qualitativo enquanto os demais foram quantitativos. As amostras variaram para cada estudo. Em todos os estudos idosos(as) acima de 60 anos foram entrevistados. Para os estudos 1 e 2, a amostra contou com profissionais da área da saúde (1) e cuidadores (1 e 2). E, para o estudo 5, adultos acima de 18 anos também foram pesquisados. A coleta dos dados foi realizada em hospitais, lares e grupos comunitários, residências e recrutamento utilizando a técnica de "snow-ball" (bola de neve) em que cada sujeito indicava um outro sujeito. Todos os entrevistados preencheram o Termo de Consentimento Informado e, a partir daí, foram convidados a responder acerca de informações sociodemográficas, QV percebida (WHOQOL-100) e sintomatologia depressiva (BDI), com pequena variação para os cuidadores. O último estudo contou apenas com os dados sociodemográficos e com as respostas ao BDI. Resultados: De forma abreviada, os resultados dos 5 artigos confirmam as especificidades do idoso e portanto a necessidade de desenvolvimento de instrumentos específicos para esta população. O artigo 1 teve como resultado a sugestão de novos itens para idosos, a partir das respostas espontâneas e análise dos domínios e facetas do WHOQOL-100. O artigo 2, por sua vez, mostrou associações da percepção de QV geral com níveis de depressão, percepção subjetiva de saúde e sexo. No artigo 3, foi possível verificar uma tendência, em todos os domínios e na medida QV geral, de o cuidador responder pior percepção de QV do idoso do que o próprio idoso cuidado, apesar de algumas concordâncias (domínios físico, nível de independência, meio ambiente e espiritualidade/religião). Também observou-se que a intensidade de depressão do idoso exerceu forte influência tanto na sua própria percepção de QV quanto na percepção do cuidador sobre o idoso. O artigo 4 mostrou uma prevalência alta e não esperada de idosos internados que se percebiam como saudáveis. Foi possível observar, ainda, uma associação significativa entre percepção saudável e menor intensidade de sintomas depressivos, bem como melhor percepção de QV no domínio nível de independência. E por último, o artigo 5 discute o viés da subescala somático e de desempenho nas respostas do idoso ao BDI. Conclusões: Idosos constituem um grupo particular e, como tal, apresentam especificidades relevantes. A avaliação dos idosos em relação às suas percepções de QV está associada a sexo, idade, estado civil, classe social, percepção de saúde e mais fortemente associada a níveis de sintomas depressivos. Explorando o cuidador como avaliador da QV do idoso observou-se uma tendência de o cuidador perceber a QV do idoso pior do que a própria percepção do idoso, apesar de fortes correlações para todos os domínios e na medida QV geral na percepção do par idoso-cuidador. Já na avaliação de percepção de saúde em idosos foi verificada a influência da intensidade dos sintomas depressivos bem como da dimensão independência: quanto menor a intensidade de depressão e quanto maior o nível de independência, maior associação com percepção de saúde entre idosos. Além desses, características próprias da população idosa podem interferir nos resultados do BDI fazendo com que seus achados sejam maximizados por questões somáticas e de desempenho sugerindo pontos de corte especiais para os idosos. Novos estudos são sugeridos a fim de atender a demanda específica do idoso.

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Visando aumentar a resistência a moléstias fúngicas, o presente trabalho teve como objetivo introduzir um gene (chit1) que codifica uma quitinase do fungo Metarhizium anisopliae em cultivares de soja [Glycine max (L.) Merrill]. A co-transformação foi a estratégia escolhida, visando a obtenção de plantas livres de transgenes marcadores na progênie das plantas transformadas. A co-transformação foi realizada via biolística, tendo como tecido-alvo conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5. O plasmídeo pGusHyg, que contém o gene repórter gusA e o gene marcador hpt, foi bombardeado concomitantemente com o plasmídeo pMOG463chit1, que porta o gene chit1. Os conjuntos de embriões bombardeados foram transferidos para meio seletivo contendo higromicina, visando a obtenção de material estavelmente transformado. Os conjuntos embriogênicos higromicina-resistentes foram transferidos seqüencialmente para meios de proliferação D-20 (sem higromicina), maturação e regeneração. No total, foram obtidos 387 e 380 embriões histodiferenciados das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5, respectivamente. Plantas transgênicas adultas e férteis foram regeneradas. Para avaliar a eficiência da estratégia de cotransformação, foram realizadas análises moleculares de embriões histodiferenciados e de plantas regeneradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram o cálculo da taxa de co-transformação de 44% para os embriões histodiferenciados da cultivar MG/BR46 Conquista e de 50% para plantas de IAS-5. Não existem, até o momento, relatos de trabalhos em soja utilizando embriões somáticos globulares em proliferação como alvo para estudos de co-transformação.