Imunorreatividade à FMRF-amida no sistema nervoso central e na musculatura pediosa de Megalobulimus oblongus

O mapeamento da imunorreatividade ao neuropeptídio FMRF-amida no SNC e na musculatura pediosa de Megalobulimus oblongus foi realizado com o objetivo de dar continuidade aos estudos que vem sendo realizados nesta espécie, com o interesse em estabelecê-lo como modelo experimental em estudos neurobiológicos. O neuropeptídio FMRF-amida foi o primeiro peptídio nativo de invertebrados a ser purificado e seqüenciado, a partir do extrato de gânglios cardioativos do molusco Macrocallista nimbosa. Ele atuaria sobre os receptores metabotrópicos, induzindo a abertura dos canais iônicos de K+ tipo S (sensíveis à serotonina (5HT)), hiperpolarizando a membrana celular e assim, aumentando o limiar para o desencadeamento do potencial de ação. A distribuição da imunorreatividade à FMRF-amida em M. oblongus foi investigada empregando-se a técnica imunohistoquímica com anticorpo não-marcado de Sternberger (1979). Todos os gânglios nervosos centrais apresentaram neurônios e fibras FLI (FMRF-amide-like immunoreactivity), assim como suas comissuras, conetivos e a maioria dos nervos emergentes destes gânglios. Nos cortes da musculatura pediosa observou-se também uma intensa imunorreatividade a FMRF-amida. O maior número de neurônios FLI foi encontrado nos gânglios cerebrais com seus tamanhos variando de pequeno a grande. O corpo dorsal apresentou grande quantidade de fibras viii imunomarcadas. No mesocérebro foram detectados alguns agrupamentos FLI junto ao neuropilo e à comissura cerebral e neurônios dispersos na sua porção ântero-medial. O pró-cérebro mostrou-se repleto de neurônios globulosos FLI. Vários agrupamentos foram observados nos lobos pedal, pleural e comissural do pós-cérebro. Nos gânglios pedais houve intensa imunomarcação em agrupamentos neuronais localizados principalmente nas regiões posterior e lateral dos gânglios. Na região anterior foi observado um par de neurônios gigantes FLI. Uma distribuição homogênea de neurônios FLI foi observada por toda a extensão dos gânglios pleurais, com a exceção de apenas um neurônio grande localizado no gânglio pleural esquerdo. A diferença no tamanho dos dois gânglios parietais foi constatada também em M. oblongus. No hemigânglio esquerdo, o menor, foi identificado um neurônio gigante (300 µm). O gânglio direito apresentou um número maior de neurônios FLI, de tamanhos variados. O gânglio visceral foi a estrutura que mais apresentou neurônios grandes e gigantes por toda a sua extensão, com imunorreatividades variáveis. O par de gânglios bucais possuía agrupamentos neuronais FLI médios e grandes. Os neurônios gigantes não se mostraram imunorreativos, ou foram apenas levemente imunomarcados no trofospôngio. Na musculatura pediosa foram observadas fibras nervosas de diferentes calibres nas regiões dorsal, medial e ventral e sobre as células musculares. Identificaram-se gânglios nervosos nos pontos de intersecção dos ramos nervosos e malhas nervosas que formavam plexos nervosos nas regiões ventral e dorsal da musculatura pediosa de M. oblongus.

Marcadores periféricos de dano ao sistema nervoso central : a proteína S100B e atividades ecto-nucleotidásicas

A S100B é uma proteína ligante de cálcio, de massa molecular de 21kDa, expressa principalmente por astrócitos. Esta proteína tem sido implicada em atividades funcionais tanto intra quanto extracelulares. Muitos estudos têm sugerido que intracelularmente ela está envolvida na modulação de proteínas do citoesqueleto e na regulação do ciclo celular. A proteína S100B pode ser secretada pelos astrócitos e desenvolver atividades extracelulares, que parecem depender de sua concentração. Em concentração nanomolar ela atua como fator trófico às células neurais, enquanto que em concentrações micromolar ela pode ser neurotóxica. A quantificação da proteína S100B no sangue e líquor se correlaciona com a extensão e intensidade do dano ao sistema nervoso central (SNC) o que permite sua utilização em estudos como marcador bioquímico de dano ou disfunção cerebral. Esta tese está dividida em três partes. A primeira parte propõe a utilização clínica da proteína S100B em patologias com envolvimento do SNC como a síndrome de Down, mielopatia associada ao vírus HTLV-I, lupus eritematoso sistêmico, epilepsia secundária a neurocisticercose e, além disso demonstramos a curva de ontogenia da S100B no sangue. Na segunda parte descrevemos uma atividade de nucleotidases presente em líquor de ratos, e finalmente, na terceira parte abordamos as perspectivas para futuros trabalhos. Os resultados obtidos pelo nosso grupo e por outros grupos internacionais relatam que a proteína S100B é um marcador inespecífico para evidenciar dano ou disfunção em doenças agudas e crônicas com envolvimento do SNC. Apesar de ser um marcador inespecífico, medidas dos níveis da proteína S100B tem grande sensibilidade para detectar uma resposta celular cerebral inespecífica. Além disso, demonstramos que estudos clínicos com esta proteína necessitam controles pareados por idade e sexo. A atividade nucleotidásica descrita no líquor de ratos hidrolisa preferencialmente o GDP e UDP comparado aos outros nucleotídeos. Nas perspectivas, os resultados mostrados são referentes a experimentos preliminares o que torna prematuro qualquer tipo de conclusão.

Efeito da anoxia sobre o metabolismo de carboidratos no sistema nervoso central do caracol Megalobulimus oblongos (Gastropoda: Pulmonata)

No seu hábitat, muitos organismos, entre eles os caracóis, estão expostos a um grande número de variáveis ambientais como temperatura, umidade, fotoperiodicidade e disponibilidade de alimento. O caracol Megalobulimus oblongus é um gastrópode terrestre que, durante épocas de estiagem, costuma permanecer enterrado no solo. Com esse comportamento o animal evita a perda de água durante o período de seca, embora nessa condição (enterrado no solo) o animal tenha que enfrentar uma situação de disponibilidade de oxigênio reduzida (hipóxia). O metabolismo dos gastrópodes terrestres está baseado na utilização de carboidratos e as reservas desse polissacarídeo são depletadas durante situações de hipóxia/anoxia. Estudos sobre o metabolismo de moluscos frente a essas condições ambientais adversas, como a própria anoxia, têm sido realizados apenas em tecidos de reserva. Trabalhos relacionando o metabolismo do sistema nervoso durante essa situação são escassos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo estudar o metabolismo de carboidratos do sistema nervoso central do caracol Megalobulimus oblongus submetido a diferentes períodos de anoxia e recuperação aeróbia pós-anoxia. Para isso, após o período experimental foram dosadas a concentração de glicogênio e a concentração de glicose livre nos gânglios do sistema nervoso central do animal, além da concentração de glicose hemolinfática. Juntamente com essa abordagem bioquímica, foi realizado um estudo histoquímico semiquantitativo com o objetivo de verificar a atividade da forma ativa da enzima glicogênio fosforilase (GFa) nos gânglios cerebrais dos caracóis submetidos aos períodos de anoxia e recuperação. Foi verificado um aumento da concentração de glicose hemolinfática após o período inicial de 1,5h de anoxia, que se manteve elevado ao longo de todo o período anóxico. A concentração de glicogênio estava significativamente reduzida às 12h de anoxia e a concentração de glicose livre permaneceu constante ao longo de todo o período anóxico, enquanto foi observada uma redução progressiva da GFa. Não foram verificadas mudanças significativas nesses metabólitos nos animais do grupo simulação (“sham”) quando comparados ao grupo controle basal. Durante o período de recuperação aeróbia após 3h de anoxia, os valores de glicose hemolinfática foram reduzidos, retornando aos valores basais após 3h de recuperação aeróbia. A atividade GFa, reduzida durante a anoxia, também retornou aos valores do grupo controle durante a fase de recuperação. A concentração de glicose livre teve uma queda significativa no tempo de 1,5h de recuperação e existiu uma tendência à redução do glicogênio do tecido nervoso às 3h de recuperação aeróbia. A enzima GFa retornou a sua atividade basal durante o período de recuperação. Os resultados sugerem que, em função da elevada concentração de glicose hemolinfática, outros tecidos possam estar fornecendo a glicose necessária para a manutenção do tecido nervoso de Megalobulimus oblongus durante a anoxia, enquanto a redução do glicogênio do tecido nervoso verificada às 12h de anoxia deva estar relacionada ao aumento de atividade do animal durante a escotofase (o grupo 12h de anoxia foi dissecado à noite) somado ao próprio efeito da anoxia. A redução da GFa ao longo do período anóxico pode indicar uma depressão metabólica no tecido nervoso. Durante o início da fase de recuperação aeróbia pós-anoxia, a queda da concentração de glicose livre e a tendência à redução na concentração de glicogênio podem estar relacionadas ao fornecimento da energia necessária para o restabelecimento dos estoques energéticos utilizados durante às 3h iniciais de anoxia, já que a glicose hemolinfática retornou à concentração basal. Como não foi verificada qualquer redução significativa durante às 3h iniciais de anoxia nas concentrações de glicose livre e de x glicogênio nos gânglios nervosos centrais de Megalobulimus oblongus, discute-se a possibilidade de que o tecido nervoso do caracol tenha utilizado reservas de fosfogênios e ATP para satisfazer suas demandas energéticas durante as 3h iniciais de ausência de oxigênio.

Imunorreatividade à proteína C-FOS após estimulação periférica nociva e tratamento com morfina no sistema nervoso central do caracol terrestre Megalobulimus abbreviatus

Utilizando as técnicas de imunoistoquímica e densitometria óptica, foi investigada a localização e a expressão da proteína c-Fos no SNC do caracol Megalobulimus abbreviatus. Neurônios imunorreativos foram encontrados nos gânglios cerebrais, pedais, parietal direito e visceral de caracóis submetidos ao estímulo térmico aversivo (50oC), e sacrificados em diferentes tempos (3, 6, 12, 18 e 24 h) após a estimulação. A análise da imunorreatividade à c-Fos através do método de medida da densidade óptica (DO) revelou uma diferença significativa no sentido de apresentar uma maior expressão (p<0,05) na área do lobo pedal do pós-cérebro do gânglio cerebral em relação às outras regiões analisadas no mesmo gânglio (mesocérebro, pró-cérebro e lobo pleural do pós-cérebro). Além disso, também houve expressão significativamente maior (p<0,05) quando comparada a densitometria da região do mesocérebro em relação ao lobo pleural do pós-cérebro nos grupos controle, 3h e 18h. O lobo pleural do pós-cérebro apresentou uma expressão significativamente menor (p<0,05) na imunorreatividade da proteína c-Fos quando comparado ao pró-cérebro em animais sacrificados 12h e 24h após e estímulo aversivo. Em relação ao grupo controle, a DO da proteína c-Fos não variou nos diferentes tempos de sacrifício quando comparada a mesma região do gânglio (cerebral, pedal, parietal direito ou visceral) ao longo do tempo na maioria das regiões. A única diferença estatisticamente significativa (p<0,05) foi encontrada no mesocérebro do gânglio de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, mostrando uma diminuição da imunorreatividade. Nos animais tratados com salina (1ml) ou morfina (20mg/kg) 15 min antes do estímulo térmico aversivo, os mesmos grupos neuronais nos gânglios do SNC de M. abbreviatus mostraram imunomarcação à proteína c-Fos. Em relação ao grupo controle, observou-se uma expressão significativamente menor (p<0,01) na DO da imunorreatividade da proteína c-Fos nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos animais sacrificados 3 h e 6 h após o estímulo térmico aversivo. No momento em que a comparação foi feita entre os grupos salina e morfina de animais sacrificados ao mesmo tempo, na grande maioria dos grupos observou-se uma diminuição na imunorreatividade da proteína c-Fos. Esta diferença, porém, mostrou-se significativa (p<0,01) no mesocérebro de animais do grupo 3h, no lobo pedal do pós cérebro de animais dos grupos 3 h, 6 h e 18 h, nos neurônios anteriores do gânglio pedal nos grupos 6 h e 12 h, nos neurônios mediais do gânglio pedal do grupo 3 h, nos neurônios posteriores do gânglio pedal do grupo 6 h, nos neurônios da região anterior do gânglio parietal direito no grupo 12 h e nos neurônios do gânglio visceral no grupo experimental 12 h. A diferença na DO da proteína c-Fos apresentou uma diminuição extremamente significativa (p<0,001) nos neurônios mediais do gânglio pedal de animais sacrificados 12 h após o estímulo térmico aversivo, nos neurônios posteriores do gânglio pedal dos animais sacrificados 12 h após o estímulo e nos neurônios do gânglio visceral dos animais do grupo experimental 6 h. A partir destes dados e da correlação com estudos realizados em M. abbreviatus para detecção de mediadores químicos envolvidos na nocicepção, podemos concluir que as áreas imunorreativas que apresentaram estas variações na densidade óptica da imunorreatividade à proteína c-Fos em diferentes tempos de sacrifício e tratamento com morfina estão envolvidas no processo nociceptivo neste caracol.

Estudo da vascularização e da barreira hemolinfa-neural do sistema nervoso de Megalobulimus abbreviatus (Gastropoda, pulmonata)

A maioria dos gastrópodes apresenta um sistema nervoso central razoavelmente simples, com um número de neurônios que varia entre 50.000 a 200.000. O comportamento das espécies desse grupo apresenta complexidade intermediaria, sendo mais simples do que o de vertebrados e artrópodes, contudo mais complexo e elaborado do que os invertebrados tais como equinodermas e anelídeos. Essas características comportamentais associadas a um sistema nervoso que apresenta neurônios de grande tamanho e de fácil identificação, tornam os componentes desse grupo muito atraentes para a resolução de problemas relacionadas às neurociências. O pulmonado, terrestre da espécie Megalobulimus abbreviatus se enquadra nessas características e tem sido usado como modelo para estudos neurobiológicos. O objetivo desse trabalho foi o de estudar as interações entre o sistema nervoso central e o sistema circulatório dessa espécie. Com o propósito de estabelecer quais são as relações funcionais e anatômicas entre os dois sistemas foram feitos estudos anatômicos, histoquímicos e ultra-estruturais com um traçador eletron-denso. Para o estudo dos componentes vasculares responsáveis pelo aporte sangüíneo do sistema nervoso central foi injetada, na árvore vascular, um mistura de carmim-gelatina e, para identificação dos endotélios, foi usada a técnica histoquímica para a detecção da atividade fosfatase alcalina. O estudo da ultra-estrutura foi realizado por meio de técnica para microscopia eletrônica de transmissão e a permeabilidade foi, testada utilizando lantânio como traçador elétron-denso ou solução de azul tripán. O sistema nervoso central do caracol é irrigado pela aorta anterior, da qual se originam uma série de finas artérias que irrigam os gânglios constituintes do complexo ganglionar subesfogiano. A extremidade distal da aorta anterior origina artérias que irrigam o bulbo bucal, a porção anterior do pé, os gânglios cerebrais, a glândula corpo dorsal e a porção anterior do sistema reprodutor. Não há vasos no tecido nervoso, esses restringem-se à bainha de tecido conjuntivo perigânglionar, onde se arranjam formando alças vasculares que se alojam em interdigitações e imbricações existentes na região limítrofe entre o tecido nervoso e a bainha que envolve os gânglios. Esse arranjo permite um aumento da superfície de contato, reduzindo a distância entre as porções mais profundas dos gânglios e os vasos, otimizando assim, a área de troca. O azul tripán injetado no pé alcançou a bainha que envolve os gânglios nervosos, contudo não penetrou no tecido nervoso. O endotélio vascular, a lâmina basal de espessura variável que envolve o tecido nervoso, e os prolongamentos das células gliais constituem a zona de interface entre a hemolinfa e os neurônios. O lantânio injetado no pé alcançou o tecido conjuntivo da cápsula perineural, entretanto não penetrou no tecido nervoso parando, sua difusão, ao nível da lâmina basal. Nos gânglios preparados por imersão em solução com lantânio coloidal o traçador foi encontrado entre os processos gliais, junto ao lado neural da lamina basal. Esses achados, associados aos resultados obtidos com as injeções de azul tripan, indicam que lâmina basal presente entre a cápsula perineural e o tecido nervoso, limita o tráfego das substâncias em direção ao sistema nervoso central deste caracol.

Análise da expressão do gene do receptor do fator de crescimento epidermal em tumores pediátricos do sistema nervoso central

Introdução: Os tumores do Sistema Nervoso Central (SNC) constituem um grupo heterogêneo de neoplasias e representam o tumor sólido mais comum na infância e adolescência (DEANGELIS 2001). A tumorigênese é um processo de múltiplas etapas envolvendo alterações genéticas que levam a transformação progressiva de células normais para a formação de derivados altamente malignos (HANAHAN 2000). O receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) é um receptor transmembrana que atua num sistema de sinalização fundamental para a fisiologia normal da célula e na manutenção do estado tumorigênico (JORISSEM 2003). O EGFR e seus ligantes estão envolvidos em mais de 70% de todas as neoplasias (YARDEN 2001). Em vários tipos de tumores, incluindo os tumores cerebrais, o EGFR é expresso aproximadamente 100 vezes mais do que o número normal de receptores encontrados na superfície de células normais. A hiperexpressão do EGFR e do ErbB2, tem sido associada com neoplasias que apresentam um comportamento clínico mais agressivo (ALROY 1997). Objetivos: Analisar a expressão do gene do EGFR em tumores primários do SNC. Material e Método: Análise de 18 amostras de tumores primários do SNC em crianças de 01 a 14 anos de idade utilizando uma técnica semi-quantitativa de RT-PCR. A coleta das amostras foi feita no período de 2002 a 2004. Resultados: A amostra foi composta por: um astrocitoma grau I, três astrocitomas grau III, três astrocitomas grau IV, três carcinomas de plexo coróide, 1 craniofaringeoma, três ependimomas, um tumor neuroectodérmico primitivo e três meduloblastomas. 33% da amostra apresentou hiperexpressão de EGFR. Ao analisar-se os resultados de expressão do EGFR nas amostras de astrocitomas verificou-se um aumento na expressão do EGFR para os tumores de grau IV, com exceção de uma amostra que apresentou um índice baixo de 0.13 RNAm. Para as demais amostras de astrocitoma grau 3 a expressão do EGFR foi baixa e os pacientes apresentaram sobrevida com doença, uma vez que não foi possível realizar ressecção cirúrgica total. Conclusão:Ainda que este estudo forneça dados de uma população bastante heterogênea é possível evidenciar diferenças nítidas de expressão do EGFR entre as diversas histologias que compreendem os tumores pediátrico do SNC. Tais resultados sugerem um importante papel do EGFR nos tumores cerebrais da infância e encorajam a continuidade de investigações que elucidem a real aplicabilidade deste fator de crescimento como marcador prognóstico e alvo terapêutico.

Efeitos da manipulação neonatal sobre a concentração plasmática de hormônios da reprodução e a densidade de receptores de angiotensina II no sistema nervoso central de ratas adultas

A manipulação neonatal é um modelo experimental utilizado para avaliar o modo pelo qual interferências precoces na vida do animal podem alterar funções neuroendócrinas e comportamentos na vida adulta. O procedimento de manipulação neonatal, além de alterar a atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (eixo HPA) em ratos machos e fêmeas, pode causar profundas mudanças na função reprodutiva de ratas adultas. De fato, há evidências de que a manipulação neonatal diminui a atividade do eixo HPA através da redução da síntese e secreção de hormônios que são liberados quando os animais são expostos ao estresse na vida adulta e, além disso, induz à presença de ciclos anovulatórios e diminui a receptividade sexual de ratas. Considerando essas alterações induzidas pela manipulação neonatal que são relacionadas à função reprodutiva de ratas, essa tese teve por objetivo estudar as possíveis causas da alteração no comportamento sexual e ovulação induzidas pela manipulação neonatal. Para isto, além de estudar o perfil hormonal desses animais, o que incluiu os esteróides gonadais, as gonadotrofinas e a prolactina (PRL) em diferentes fases e horários do ciclo estral, o conteúdo do hormônio liberador de gonadotrofinas (LHRH) em algumas regiões do sistema nervoso central (SNC) e na eminência mediana (EM); foi avaliada a possível participação do sistema angiotensinérgico central, através da análise da densidade dos receptores de angiotensina II (Ang II) pela técnica de auto-radiografia, na mediação dos efeitos da manipulação neonatal sobre a função do eixo hipotálamo-hipófise-gônada (eixo HPG) e do eixo HPA. O presente estudo confirmou dados obtidos em nosso laboratório sobre a redução do comportamento sexual e da ovulação em ratas manipuladas no período neonatal. Na tarde do proestro, período no qual ocorrem os eventos necessários para a ovulação na próxima fase do ciclo estral, os resultados mostram que os animais do grupo manipulado têm redução significativa da concentração plasmática de estradiol, de gonadotrofinas e de PRL, assim como um aumento no conteúdo de LHRH na área pré-óptica medial (APOM). A manipulação neonatal também reduziu a concentração plasmática de progesterona analisada após o coito que pode ser decorrente da reduzida estimulação vaginocervical recebida por essas ratas, já que houve uma redução significativa da freqüência de intromissão realizada pelo macho sobre as ratas do grupo manipulado. A densidade de receptores de Ang II na APOM e no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) também foi alterada pela manipulação neonatal, pois houve redução significativa na densidade desses receptores nessas duas regiões. Em conclusão, a manipulação neonatal reduz profundamente a atividade do eixo HPG e essa alteração é causada por modificações nas concentrações de estradiol no plasma que, por sua vez, pode alterar a secreção de LHRH, de gonadotrofinas e de PRL, comprometendo dessa maneira a ovulação e a receptividade sexual. Contribuindo para os efeitos deletérios da manipulação neonatal sobre a função reprodutiva em ratas, este procedimento pode alterar a implantação do blastocisto devido à redução da secreção de progesterona observada após o coito no grupo manipulado. Alguns dos efeitos da manipulação neonatal parecem ser mediados pelo sistema angiotensinérgico central, como o aumento do conteúdo de LHRH na APOM e a diminuída resposta do eixo HPA observada em animais manipulados submetidos a situações estressantes na vida adulta.

Efeito da ingestão crônica de cafeína na atividade de enzimas antioxidantres, peroxidação de lipídeos e na produção de radicais livres em diferentes regiões do sistema nervoso central de ratos adultos

Estresse oxidativo é um desequilíbrio entre a geração de radicais livres e a capacidade de defesa do sistema antioxidante endógeno. Sabe-se também que o acúmulo extracelular de aminoácidos excitatórios leva a uma exacerbada estimulação de seus receptores, provocando insultos oxidativos no cérebro e pode levar a uma série de eventos que podem ser os causadores de diversas patologias como isquemia e doenças neurodegenerativas. A adenosina, ao ligar-se aos seus receptores, age como neuromoduladora da liberação desses neurotransmissores, protegendo as células contra o estresse oxidativo. Alem disso, sabe-se que a ativação de receptores de adenosina promove um aumento da atividade de enzimas antioxidantes. A Cafeína tem sua principal ação farmacológica através do antagonismo não seletivo dos receptores de adenosina, causando o bloqueio dos mesmos, e neste caso leva ao acúmulo de neurotransmissores no meio extracelular. Entretanto em altas concentrações, ela pode, por si só, ter ação antioxidante, “seqüestrando” radicais livres e, desta maneira, protegendo a célula do dano oxidativo. Por outro lado, alguns estudos demonstram que ela também pode ter ação pró-oxidante, quando em presença de altas concentrações de íons cobre e pode ter ação pró-apoptótica, via ativação da caspase 3. O objetivo deste trabalho foi a caracterização do efeito da ingestão crônica de cafeína (1g/L) por 7dias, sobre a atividade de enzimas de defesa antioxidantes (CAT, GSH-Px, SOD) em homogenato de hipocampo, cerebelo e estriado de ratos Wistar adultos. Nós também medimos a produção de radicais livres e a peroxidação de lipídeos Os resultados obtidos demonstraram que cafeína, administrada cronicamente, causa um aumento na peroxidação dos lipídeos de membranas e uma diminuição nas atividades das enzimas antioxidantes SOD e GSH-Px, nas três estruturas analisadas quando comparadas ao controle, porém não foi observada alteração na atividade da catalase. Além disso, não encontramos alteração nos níveis de produção de radicais livres. Portanto, embora alguns trabalhos demonstrem que a ingestão crônica de cafeína pode ter uma ação neuroprotetora, em nosso trabalho nós demonstramos que cafeína pode potencialmente provocar dano celular em estruturas cerebrais através da diminuição das enzimas antioxidantes. Provavelmente, esse efeito seja devido a uma diminuição da expressão e/ou número de receptores de adenosina (A1 ou A2) ou a cafeína está agindo somente como antagonista competitivo, bloqueando a ação da adenosina endógena. Outros experimentos são necessários para comprovar esta hipótese.

Angiotensina II bloqueia a consolidação e a evocação de memórias aversivas

O sistema renina - angiotensina tem um papel importante e bem descrito na modulação do sistema cardiovascular. Sua participação em processos cognitivos tem sido assunto de diversos trabalhos. É de particular interesse a modulação da memória pela ação de seus metabólitos funcionais, angiotensina II (AII) e IV (AIV), no sistema nervoso central. Apesar dos diversos trabalhos abordando o assunto, o papel da AII no processamento da memória continua controverso. Para tentar aprofundar essa questão utilizamos o paradigma da esquiva inibitória de uma única sessão em conjunto com a infusão intra-hipocampal de AII, AIV, e antagonistas AT1 ou AT2. Ratos foram implantados com cânulas na região CA1 do hipocampo dorsal, alguns dias depois da cirurgia foram treinados em uma tarefa de esquiva inibitória e, em tempos diferentes após o treino, foram infundidos com veículo ou uma das drogas descritas acima. Os animais foram testados 3 ou 24 h após o treino; no primeiro caso para avaliar memória de curta duração (STM) e para avaliar memória de longa duração (LTM) no segundo. Verificou-se um efeito amnésico para a AII na consolidação da LTM e STM quando infundida imediatamente ou 30 min pós-treino, e na evocação da LTM quando infundida 15 min antes do teste. O efeito amnésico da AII parece ser modulado exclusivamente por sua ação em receptores AT2, não tendo participação nem receptores AT1, nem sua conversão endógena em AIV. A AII endógena não parece ter qualquer participação na formação da memória de esquiva inibitória.

Guanosina : uma nova abordagem do sistema purinérgico

Durante as últimas décadas os estudos do sistema purinérgico concentraram seu foco de atenção nas ações dos derivados da adenina (como adenosina e o ATP). Seus efeitos, receptores, agonistas e antagonistas encontram-se muito bem estabelecidos dentro do sistema nervoso central. Os resultados obtidos com os diversos estudos dos derivados da guanina trazem uma nova perspectiva para o estudo do sistema purinérgico. Os nucleotídeos derivados da guanina são classicamente associados ao sistema de transmissão de sinal transmembrana via proteínas G. Além disto, suas ações extracelulares sobre o sistema nervoso central, especificamente sobre o sistema glutamatérgico, têm tornado essa classe de moléculas uma nova fronteira no estudo da neuroproteção. Estas moléculas também são capazes de promover processos trófico e mitóticos nas células do SNC, promover a liberação de fatores de crescimento e estimular o influxo de cálcio nos astrócitos. Entretanto, suas ações sobre o sistema glutamatérgico são o alvo principal deste trabalho. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico. O aumento provocado na captação de glutamato parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Assim a guanosina acaba assumindo um papel importante na neuroproteção contra os efeitos de concentrações extracelulares tóxicas de glutamato no SNC. Nosso trabalho demonstra que a guanosina também é a real efetora do efeito anticonvulsivante apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de inibidores da conversão de GMP para guanosina leva a uma diminuição do seu efeito. Ainda, a guanosina aumenta a Vmax da captação de glutamato em fatias, o que indicaria um maior contingente de transportadores presentes na membrana da célula ou uma menor taxa de turnover dos mesmos. Esse efeito nos transportadores parece permanecer mesmo depois que a guanosina é retirada do meio de incubação. Os efeitos demonstrados pela guanosina in vitro foram confirmados em experimentos ex vivo. Além disso, a concentração de purinas no liquor dos ratos tratada não demonstrou aumentos significativos após a administração i.c.v. de guanosina ou GMP. Essa ação pode indicar que a guanosina dispara algum mecanismo que aumente o tônus glutamatérgico por um período maior do que o tempo de exposição a ela. Essas ações da guanosina devem ser desempenhadas através de seu receptor. Nossos resultados apontam para um novo receptor no sistema purinérgico, sensível à guanosina e adenosina, mas não antagonizado por cafeína e ATP. Esse receptor parece ter proteínas G acopladas, uma vez que o GTP-N foi capaz de inibir a união de guanosina ao receptor. Esse receptor deve responder de acordo com a purina que estiver ligada a ele, pois a adenosina e a guanosina têm ações diversas e muitas vezes contrárias no SNC. O sitio de união parece ser preferencialmente astrocitário, o que ajudaria a explicar as ações encontradas para a guanosina na captação de glutamato. Somando-se todas as ações já descobertas para a guanosina e as suas mais variadas formas de proteger o cérebro de excesso de glutamato extracelular, é impossível tratar a guanosina apenas como uma molécula coadjuvante no sistema purinérgico.

Efeitos do estresse agudo e a participação do sistema angiotensinérgico sobre a função reprodutiva em ratas : comportamento sexual, ovulação e lactação

A função reprodutiva constitui-se em um dos diversos estados no qual o estresse pode atuar exercendo efeitos deletérios que colocam em risco a integridade individual e a manutenção da espécie. Dentre os diversos peptídeos que atuam controlando os processos reprodutivos, a angiotensina II (Ang II) possui um papel destacado pela sua atuação no controle de hormônios hipofisários, além de uma importante participação na regulação das respostas ao estresse. Considerando a importância dos mecanismos que controlam as funções reprodutivas e as evidências da influência do estresse sobre esses processos, esta tese teve como objetivo estudar os possíveis efeitos do estresse agudo sobre diferentes aspectos da função reprodutiva em fêmeas e a participação do sistema angiotensinérgico nesses mecanismos. Para isso, foi avaliada a resposta ao estresse de diversos hormônios com funções reprodutivas como a prolactina, o hormônio luteinizante e a progesterona em diferentes fases do processo reprodutivo. A participação do sistema angiotensinérgico foi avaliada através da utilização de antagonistas da Ang II e da quantificação da densidade de receptores de Ang II em núcleos do sistema nervoso central como o núcleo arqueado, o locus coeruleus, o núcleo pré-óptico mediano e o órgão subfornicial em modelos experimentais com diferentes concentrações de estradiol e progesterona. O presente estudo demonstrou que o estresse agudo provoca uma redução na concentração plasmática de prolactina em ratas ovariectomizadas tratadas com estradiol e progesterona e lactantes, sendo esta resposta mediada pelos receptores AT1 de Ang II no núcleo arqueado. Os esteróides gonadais aumentam a densidade destes receptores de Ang II no núcleo arqueado e a progesterona parece ser a principal moduladora desta regulação. Além disso, esse aumento também ocorre no locus coeruleus, núcleo pré-óptico mediano e órgão subfornicial, já que o tratamento de ratas ovariectomizadas com estradiol e progesterona provoca um aumento na densidade de receptores de Ang II nestes núcleos. Já o estresse agudo na manhã do proestro provocou uma redução nas concentrações plasmáticas de hormônio luteinizante, progesterona e prolactina na tarde do proestro, juntamente com uma redução na ovulação, sendo estes efeitos mediados pelos receptores AT1 de Ang II. A aplicação de um estresse agudo por contenção durante 1 hora na tarde do proestro provocou uma redução no comportamento sexual, porém esses efeitos não são mediados pelo sistema angiotensinérgico. Em conjunto, esses resultados permitem concluir que o estresse agudo provoca alterações em diferentes aspectos do processo reprodutivo em fêmeas, incluindo efeitos deletérios sobre a lactação, o comportamento sexual, a geração dos picos hormonais pré-ovulatórios e a ovulação. O sistema angiotensinérgico tem uma participação efetiva em diversos mecanismos envolvidos na resposta ao estresse e parece ser um importante regulador dessas respostas.

Intervenções no sistema adenosinérgico : avaliação de aspectos neuroquímicos, locomotores e nociceptivos

A adenosina está presente em todos os tipos celulares exercendo um papel homeostático. Em sistema nervoso central e periférico seu papel neuromodulador é observado. A presença de adenosina no meio extracelular permite a ativação de receptores adenosinérgicos específicos, classificados em: A1, A2A, A2B e A3. A ativação dos receptores A1 e A2A, receptores de alta afinidade, está diretamente envolvida com o papel neuromodulador, visto que a sua ativação produz inibição e facilitação da liberação de neurotransmissores, respectivamente. A seleção de qual receptor será ativado, visto que exibem co-expressão em muitas regiões neurais, pode ser feita de acordo com os sítios de liberação ou produção de adenosina extracelular. Desta forma, receptores A1 seriam preferencialmente ativados pela adenosina liberada através dos transportadores bidirecionais de nucleosídeos e os receptores A2A preferencialmente ativados pela adenosina proveniente da degradação do ATP realizada por uma cascata enzimática. A hidrólise de ATP a adenosina é realizada pelas enzimas ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases e ecto-5’-nucleotidase. Em ratos, a ativação do sistema adenosinérgico exerce seus efeitos neuromoduladores desde fases iniciais de desenvolvimento embrionário, alcançando o padrão adulto mesmo antes do nascimento. A ativação de receptores de adenosina na fase fetal e neonatal foi demonstrada ter como conseqüência o retardo no desenvolvimento global dos animais, bem como, ventriculomegalia e perda de massa cerebral branca. Esta informação levanta a questão da suscetibilidade do cérebro imaturo a certas drogas, tais como a cafeína. A cafeína é uma metilxantina com efeitos estimulantes, a qual exibe como base para seus efeitos o bloqueio inespecífico dos receptores de adenosina. No presente estudo, avaliou-se o efeito da administração de cafeína em diversos parâmetros. A administração aguda de cafeína, mas não a crônica, em ratos adultos foi capaz de alterar significativamente as atividades de hidrólise de ATP no hipocampo e de ADP no estriado. Este resultado poderia estar relacionado com a capacidade plástica do sistema adenosinérgico em restabelecer seu tônus em ratos adultos tratados cronicamente com cafeína. Além disto, verificou-se que a ação direta da cafeína afetou a produção de adenosina. A administração crônica de cafeína na água de beber de ratas mães durante a fase gestacional e lactacional alterou o padrão de hiperlocomoção induzido por MK-801, um antagonista de receptores NMDA glutamatérgicos, nos ratos filhotes aos 21 dias de vida, mesmo quando o acesso a cafeína foi retirado sete dias antes do teste. Além disto, o mesmo tratamento não alterou o limiar de dor de filhotes aos 14 e 50 dias de vida, bem como a analgesia induzida nestes animais aos 50 dias. Entretanto, quando os animais ainda recebiam cafeína no dia do teste, foi observado efeito analgésico somente nos ratos de 14 dias. A análise dos efeitos do tratamento sobre a degradação de acetilcolina e sobre a degradação de nucleotídeos em hipocampo de ratos jovens demonstrou que ambas as atividades foram alteradas. O conjunto de resultados desta tese indica que a intervenção no sistema adenosinérgico durante as fases gestacional e neonatal é capaz de desenvolver adaptações, provavelmente relacionadas ao aumento da expressão de receptores para adenosina, na tentativa de restabelecer o controle modulador adenosinérgico, considerada a importância dos sistemas avaliados para a manutenção do organismo.