Desenvolvimento de um sistema de expressão em Metarhizium anisopliae baseado no promotor homólogo do gene tef-1 α

Vetores de expressão são ferramentas moleculares úteis para investigar a função de genes tanto em sistemas procarióticos quanto eucarióticos. O fungo Metarhizium anisopliae, utilizado no controle biológico de artrópodes, é bem caracterizado em nível molecular. Genes candidatos a participar do processo de infecção de hospedeiros tem sido isolados utilizando estratégias em que o gene candidato é predefinido (enzimas hidrolíticas, por exemplo) ou estratégias mais globais como projetos de ESTs e a análise de bibliotecas de subtração. A superexpressão tem sido o método adotado para verificar a participação de genes isolados no processo de infecção. Esta estratégia tem sido baseada no promoter heterólogo PgpdA de Aspergillus nidulans. Neste trabalho, o gene que codifica o fator de alongamento de tradução tef-1 α de Metarhizium anisopliae foi clonado e a sua região promotora foi localizada e utilizada na construção de um vetor de expressão. Somente uma cópia do gene tef-1α está presente no genoma de M. anisopliae e o seu perfil de expressão foi analisado. Uma árvore filogenética foi construída baseada nos ortógos de tef-1 α e mostrou uma alta correlação com o fungo Cordyceps taii. A região de 639 pb à montante do codon de iniciação (ATG) foi utilizada com sucesso para a expressão do gene repórter sGFP e do gene bar, que confere resistência ao glifosinato de amônio, em M. anisopliae. Os transformantes construídos não apresentaram alteração na sua virulência em bioensaios com carrapatos, em relação a linhagem receptora. Além disso, demonstramos que o nível de expressão permite a detecção óptica da fluorescência de sGFP durante a infecção dos carrapatos. Desta forma, o vetor desenvolvido será uma ferramenta útil para a superexpressão em Metarhizium.

Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

Caracterização molecular dos genes PSO2 e PSO4 de Saccharomyces cerevisiae envolvidos na reparação do DNA : análise funcional e identificação de interações proteína-proteína

O alelo mutante termo-condicionalmente letal pso4-1 do gene PRP19, que codifica uma proteína associada ao spliceossoma, permitiu investigar a influência deste gene no processamento de pré-mRNA, reparação do DNA e esporulação. Fenótipos relacionados a genes portadores de introns foram correlacionados à temperatura. Sistemas repórteres para processamento de pré-mRNA e RT-PCR mostraram que eficiência de processamento de mRNA no mutante pso4-1 é inversamente correlacionada com a temperatura de crescimento. Uma mutação pontual, substituindo uma leucina por uma serina foi identificada dentro da região codificadora N-terminal do alelo Pso4-1 e afeta as propriedades bioquímicas de Pso4-1p. Entre 24 clones isolados utilizando o sistema doishíbridos, 7 foram identificados como partes dos genes RAD2, RLF2 e DBR1. RAD2 codifica uma endonuclease indispensável para a via reparação por excisão de nucleotídeos (NER), RLF2 codifica a subunidade maior do fator de montagem da cromatina I, cuja deleção resulta em sinsibilidade à radiação UVC, enquanto que DBR1 codifica uma enzima que atua sobre substratos de RNA na forma lariat, degradando estruturas lariat em introns durante o processamento de mRNA. A caracterização dos fenótipos após tratamentos com mutágenos em linhagens mutantes simples e duplos de rad2∆, rlf2∆ e pso4-1 mostraram sensibilidade aumentada para para mutantes rad2∆/pso4-1 e rlf2∆/pso4-1, sugerindo uma interferência funcional destas proteínas no processo dereparação do DNA em Saccharomyces cerevisiae. O mecanismo exato de reparação de pontes inter-cadeia (ICL) em S. cerevisiae não é ainda totalmente conhecido. Identificando novos fenótipos e isolando proteínas potencialmente capazes de interagir com Pso2p através da técnica do sistema dois-híbridos, foi possível extender a caracterização deste gene específica para reparação de pontes intercadeia. Tratamentos com acetaldeído (ACA), um metabólito natural da via glicolítica, foi mais tóxico a linhagem mutante pso2 em comparação com a linhagem selvagem e também capaz de induzir a expressão da fusão contendo o promotor de PSO2 à lacZ (PSO2-lacZ) por um fator comparável à tratamentos com outros agentes indutores de ICLs, indicando que o metabólito natural ACA pode causar danos do tipo ICL em S. cerevisiae. A utilização do sistema dois-híbridos permitiu isolar partes de proteínas codificadas por nove diferentes genes, entre eles a proteína quinase Pak1p, um supressor de mutações termosensíveis da DNA Polimerase alfa. Pak1p interage com a extremidade C-terminal conservada de Pso2p, uma região da proteína recentemente nomeada β-CASP entre v ortólogos conhecidos do gene PSO2. A integridade do domínio β-CASP é essencial para a reparaçãode DNA proficiente como demonstrado em ensaios de complementação com mutantes pso2 ∆. Comparação da sobrevivência após tratamento com agentes mutagênicos de simples mutantes pso2 ∆ e pak1 ∆ assim com o dulpo mutante pso2 ∆/pak1 ∆ revelaram que o gene PAK1 é necessário para reparação do DNA proficiente como na linhagem selvagem. A interação epistática dos dois alelos mutantes na linhagem duplo mutante sugere que Pak1p atua na mesma via de reparação a qual PSO2 pertence e que PAK1 constitui um novo locus envolvido na reparação do DNA em S. cerevisiae.

Oxidação de propeno em catalisadores de CuO suportados em CeO2/y-alumina/cordierita

No presente trabalho, procedeu-se a preparação e caracterização de catalisadores ambientais à base de óxido de cobre suportado em -alumina (suporte)/cordierita (substrato) e que tinham como promotor o óxido de cério. A argila foi conformada via eletroforese na forma de monolitos. Após queima à 1100°C, estes foram triturados, selecionado-se partículas com diâmetro entre 0,297 < Dp < 0,590 mm. Para a obtenção de -alumina e óxidos de cério e cobre sobre as partículas, utilizou-se a técnica de impregnação a seco (umidade incipiente), usando soluções de Al(OH)3, Ce(NO)3.6H2O e Cu(NO)3.3H2O, respectivamente . Após cada impregnação, os catalisadores foram secos e calcinados. A caracterização dos catalisadores foi feita através de experimentos de TPR (Redução à Temperatura Programada), microscopia eletrônica de varredura e espectrofotometria de absorção atômica, tendo como reação teste a oxidação de propeno com excesso de oxigênio. A caracterização da argila precursora da cordierita foi realizada através da difratometria de raios X . Procurou-se determinar neste trabalho os tipos de sítios de óxido de cobre (através do ensaio de TPR) e valores de ordens de reação e energia de ativação para a reação de oxidação de propeno através de estudos de cinética aplicada, relacionando-se os resultados com valores da literatura. Os valores de energia de ativação obtidos neste trabalho, para a oxidação de propeno, variaram de 82 kJ/mol à 100 kJ/mol e as ordens parciais de reação do propeno de 0,73 à 1,11. Todos os resultados acima foram obtidos em reator diferencial . O efeito da adição de óxido de cério nestes catalisadores também foi abordado neste trabalho.

Rede de apoio social e representação mental das relações de apego de meninas vítimas de violência doméstica

Este estudo teve por objetivo a investigação da rede de apoio social e afetivo e a representação mental das relações de apego de meninas vítimas e não-vítimas de violência doméstica. A amostra foi composta por 40 meninas, sendo 20 vítimas e 20 não-vítimas de violência doméstica (abuso físico), com idades entre oito e doze anos, que cursavam da primeira a quinta série do Ensino Fundamental de quatro escolas da rede pública. Os dados foram obtidos usando três instrumentos: 1) Entrevista bio-sociodemográfica; 2) Mapa dos Cinco Campos (dimensões estrutura e funcionalidade); e, 3) Desenho da Família. Os resultados foram obtidos através de análise de conteúdo da Entrevista e análises estatísticas para os demais instrumentos. Os principais resultados revelam que as meninas vítimas de violência doméstica apresentam uma rede de apoio social e afetiva que difere mais qualitativamente (função) do que quantitativamente (estrutura) das meninas não vítimas. Há inversão de papéis das meninas com suas respectivas mães no ambiente doméstico, mas apresentam criatividade, vitalidade e investimento emocional para superação de problemas. As meninas vítimas percebem o ambiente escolar como protetivo e promotor de resiliência, enquanto o ambiente doméstico é percebido com ambivalência. Apresentam, também, indicadores de vulnerabilidade mais evidentes do que as meninas não vítimas de violência doméstica.

Critérios de projeto para escolas fundamentais bioclimáticas

Esta dissertação trata dos critérios para a elaboração de projetos para edificações escolares, em especial destinadas para a educação infantil e ensino fundamental, considerando a sua inserção no contexto ambiental, constituindo, assim, uma concepção arquitetônica bioclimática. Nessa perspectiva a implantação, a geometria, a organização espacial e os parâmetros construtivos do edifício contribuem na materialização de espaços adequados aos requisitos didático-pedagógicos e funcionais e, em especial, às exigências de conforto ambiental dos usuários, de maneira que a escola, na sua configuração física, se constitua em um elemento promotor do desenvolvimento intelectual, social e afetivo da criança. A partir da concepção global baseada nos princípios da bioclimatologia, o trabalho estabelece as necessidades para condicionamento ambiental determinadas pela caracterização climática de Passo Fundo – RS (clima subtropical úmido de altitude), explorando as estratégias solares passivas que utilizam a própria envoltória da edificação na seleção daqueles elementos ambientais externos favoráveis ao aquecimento, resfriamento, ventilação, proteção à radiação solar e iluminação, a fim de agregar aos critérios funcionais de projeto para escolas a maximização do uso desses fatores naturais e a racionalização do uso de energias não-renováveis, tendo como objetivo contribuir para um gradual desenvolvimento sustentável O trabalho aborda a legislação existente pertinente às edificações escolares, bem como apresenta exemplos de escolas solares passivas, com a aplicação de estratégias válidas para as condições locais, confrontadas com estudo de caso simplificado, a fim de que a implementação das sugestões apontadas demostre a sua viabilidade de aplicação.

Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Gestão democrática na rede municipal de educação de Porto Alegre de 1989 a 2000 : a tensão entre reforma e mudança

Esta dissertação de mestrado tem como objetivo a análise da gestão democrática da educação na rede municipal de Porto Alegre, no período de 1989 a 2000, enfocando nesse movimento os aspectos de reforma – introdução de inovações que garantem a continuidade de determinadas práticas sociais – e mudança – estabelecimento de rupturas geradoras de práticas sociais inéditas, considerando os diferentes agentes sociais envolvidos, dentre eles o Estado e suas políticas públicas. Trata-se de uma investigação qualitativa, a partir da análise de material escrito (legislação instituinte dos instrumentos de gestão democrática, textos de enunciado político produzidos pela Secretaria Municipal de Educação e outros agente sociais e documentos das escolas) e oral (depoimentos de atores envolvidos no processo: assessores da Secretaria Municipal de Educação; membros de Conselhos Escolares das escolas municipais, representantes dos segmentos pais, alunos, professores e funcionários; presidente do Conselho Municipal de Educação; diretor de escola; dirigente da Associação de Trabalhadores em Educação). A pesquisa focalizou questões sobre as práticas e as relações (regulatórias e emancipatórias) dos diferentes agentes sociais presentes nesse cenário, incluindo, para além dos movimentos sociais, o Estado como um importante e singular promotor nesse processo; sobre os discursos produzidos por estes diferentes agentes nos distintos tempos e espaços; e sobre a constituição de projetos e instrumentos de gestão democrática e os efeitos de sentido produzidos a partir deles em nível local (escola) A construção das referências teóricas para a análise foi realizada através da revisão bibliográfica sobre como figuraram historicamente os elementos constitutivos da gestão democrática (democratização do acesso, da permanência na escola e do saber; e democratização da gestão) no contexto da educação, no bojo do debate mais amplo da questão democrática na sociedade; e da trama dos conceitos: reforma, mudança, democracia, gestão, gestão democrática, participação, poder e Estado, a partir de Popkewitz e outros autores, bem como inspirada na análise do discurso proposta por Pêcheux. O conceito de gestão democrática proposto nesta dissertação está associado ao estabelecimento de mecanismos institucionais e à organização de ações que desencadeiem processos de participação social: na formulação de políticas educacionais; na determinação de objetivos e fins da educação; no planejamento; nas tomadas de decisão; na definição sobre alocação de recursos e necessidades de investimento; na execução de deliberações; nos momentos de avaliação Este conceito se opõe às proposições ligadas a concepções empresariais em educação, cuja finalidade é a obtenção de mais resultados com um mínimo de investimentos, interpelando os agentes sociais à mera execução de planejamentos centralizados e captação de recursos, bem como aquelas que concebem a educação como um campo científico especializado e neutro, que deve ser dirigido por especialistas e agentes do Estado, no qual a participação da população deve ser restrita ao planejamento e execução de tarefas de apoio ao processo pedagógico. À primeira concepção está ligado o conceito de mudança e à segunda o conceito de reforma.A gestão democrática deve ser produtora de uma nova qualidade social na educação, que atenda às aspirações dos agentes envolvidos e contribua no desenvolvimento da sociedade mais ampla, no sentido de estabelecer relações mais justas e igualitárias. Os mecanismos de gestão democrática necessitam, portanto, garantir a plena participação dos sujeitos envolvidos em nível de deliberação dos planos de gestão educacional, bem como na escolha dos seus dirigentes e representantes, além do acompanhamento, execução e avaliação de planejamentos e ações. A eleição direta para diretores, a presença de conselhos escolares como órgão máximo no nível da escola, compostos por representantes de todos os segmentos escolares (pais, professores, alunos e funcionários) articulados com suas bases, a descentralização de recursos financeiros, garantindo condições de funcionamento às escolas, são instrumentos apontados como os mais indicados na democratização da gestão, dentre os construídos na experiência educacional brasileira. Juntamente com estes mecanismos, práticas dialógicas e participativas no cotidiano do espaço escolar, desde os espaços micro (salas de aula) ao espaço mais amplo, são constituintes da gestão democrática Na experiência analisada, qual seja, a experiência de gestão democrática na rede municipal de educação de Porto Alegre de 1989 a 2000, foi possível observar: a instituição dos instrumentos de gestão democrática descritos anteriormente (eleição direta de diretor, conselhos escolares e descentralização de recursos); a ação propositiva de diferentes agentes sociais – trabalhadores em educação, vereadores, militantes políticos, estudantes, lideranças comunitárias, pais de alunos - na constituição e consolidação destes instrumentos; a elaboração de projetos pelo Estado, visando produzir a democratização da gestão no espaço escolar e na elaboração de diretrizes educacionais em nível de rede escolar, bem como a utilização de mecanismos regulatórios a fim de manter a direção deste processo; a diversidade de experiências e temporalidades a partir do encontro entre a política pública global e os processos singulares em cada escola. Dentre as singularidades do processo analisado, destaca-se: a confluência de diferentes forças na constituição da gestão democrática (a atuação da Associação dos Trabalhadores em Educação, de vereadores da Câmara Municipal, dos movimentos sociais, das escolas e do próprio Estado); a presença do Partido dos Trabalhadores em todos estes espaços, através de seus militantes, buscando legitimar as propostas de gestão democrática produzidas no pensamento pedagógico progressista, inseridas no projeto global de democratização do Estado no âmbito da administração municipal; a força da tradição, movimentada por professores que atuam para manter sua posição de domínio na gestão escolar, e pela incorporação dos mecanismos de democracia representativa em detrimento da democracia participativa; o dilema do Estado, que embora proponha a gestão democrática como política pública, muitas vezes aciona seu poder regulador para efetivar suas propostas de reorganização curricular; a diversidade de cenários entre as escolas, com a produção de singularidades locais inseridas nessa experiência de rede municipal. O contexto facilitador da cidade, ensejado por quatro administrações consecutivas do Partido dos Trabalhadores, em conjunção com o movimento dos diferentes agentes sociais, está produzindo movimentos significativos de mudança, construindo em nível local uma transformação no significado do conceito de democracia, tornando-a, em nível de gestão educacional, mais democrática e participativa.

Emprego da sulfatação na recuperação de metais de lodos galvânicos

Este trabalho relata um estudo de sulfatação, em escala laboratorial, com objetivo de propor um tratamento para a recuperação seletiva de determinados metais presentes em lodos galvânicos (LG). Os metais de interesse são cobre, zinco e níquel e o agente promotor da sulfatação é a pirita, obtida de rejeitos de carvão mineral. A particularidade deste tratamento é o emprego simultâneo de dois resíduos perigosos como matériasprimas. Estes resíduos são gerados em grande quantidade em sítios de extração de carvão (rejeito piritoso) e empresas galvânicas (lodo galvânico). Os resíduos foram caracterizados por fluorescência de raios X (XRF), distribuição granulométrica e percentual de umidade. A caracterização química apresentou lodos com alta concentração de cobre, maior do que 14% (base seca). Na etapa de sulfatação, o lodo galvânico foi misturado com o rejeito piritoso e os parâmetros avaliados foram: razão lodo galvânico/rejeito piritoso, temperatura de sulfatação e tempo de patamar. Depois da sulfatação, o produto da reação foi lixiviado com água, em temperatura ambiente, por 15 min. Nesta etapa hidrometalúrgica, os parâmetros variáveis foram tempo de lixiviação e concentração de sólidos na polpa.As condições que melhor refletem o compromisso de recuperar os metais de interesse e a viabilidade econômica do processo foram alcançados com a razão 1:0,4 lodo galvânico/rejeito piritoso, 90 min de patamar e 550ºC de temperatura de sulfatação, para a etapa pirometalúrgica e 15 min de lixiviação e 14g.L-1 de sólidos em polpa como condições hidrometalúrgicas. Estas condições propiciaram a recuperação de 60% de zinco, 49% de níquel e 50% de cobre.

A vanilina como um agente modulador da genotoxicidade : risco ou benefício?

Há cerca de 20 anos a vanilina vem sendo descrita como uma substância moduladora capaz de inibir eventos relacionados à indução e promoção do processo carcinogênico. Este comportamento associado ao seu consumo elevado despertou o nosso interesse científico - resultando na publicação do primeiro trabalho associando a VA a acréscimos expressivos em eventos recombinacionais mitóticos, acompanhados de decréscimos na freqüência de mutações pontuais e cromossômicas. Entretanto, quando a antimutagênese e a co-recombinogênese foram avaliadas simultaneamente, a ação final da VA refletiu-se não como proteção, mas sim como um efeito potencializador expresso como um aumento de cerca de 200 vezes na genotoxicidade total da MMC. Na procura de respostas adicionais concernentes à ação da VA como moduladora de diferentes espectros de lesões no DNA utilizamos o Teste para Detecção de Mutação e Recombinação Somática em Drosophila melanogaster (SMART) com o intuito de avaliar o comportamento deste flavorizante em relação à genotoxicidade dos agentes químicos: N-methyl-N-nitrosourea (MNU), N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), ethylmethanesulphonate (EMS) e bleomicina (BLEO), em dois protocolos de administração do modulador – pós e co-tratamento. Pós-tratamento Os dados obtidos através do sistema de pós-tratamento evidenciaram que a VA não altera a mutagenicidade e a recombinogenicidade do ENU e MNU - o que sugere a não interferência deste flavorizante sobre os mecanismos envolvidos na correção das lesões induzidas por estes alquilantes. Ao contrário, a toxicidade genética do EMS foi significativamente aumentada em valores compreendidos entre 7,79 a 29,79%, representando a expressão final de dois efeitos antagônicos: (i) sinergismo em recombinação mitótica e (ii) proteção em relação à mutagênese. Tais achados sugerem que diferenças entre o espectro dos danos induzidos por estes agentes alquilantes, podem afetar os caminhos de reparação a serem priorizados. Como conseqüência, o efeito potencializador da VA sobre recombinação homóloga (HR) está restrito ao EMS – o único dos agentes alquilantes monofuncionais estudados cujas lesões são processadas, em Drosophila melanogaster, por ambos mecanismos de reparo: excisão de nucleotídeos e pós-replicativo. A VA também causou drásticos incrementos na genotoxicidade da BLEO - 120 a 178% - que estão limitados a aumentos em recombinação, uma vez que não foram observadas alterações na sua potência mutacional. Como a genotoxicidade da BLEO resulta basicamente da indução de quebras duplas corrigidas por mecanismos de reparação dependentes de recombinação - que podem ocorrer tanto entre cromossomos homólogos (HR) como não-homólogos (end joining -NHEJ) – e como o teste SMART privilegia a detecção de recombinação homóloga, os nossos dados indicam que a ação potencializadora de VA em relação a BLEO deve-se especificamente a incrementos em reparo dependente de HR. Ainda relevante é o fato de que estes acréscimos não estão associados a decréscimos em mutação, como anteriormente observado para a MMC.Todos estes dados indicam que a modulação da VA está restrita ao seu efeito sinérgico sobre recombinação somática – promovendo especificamente a recombinação homóloga em células proliferativas de Drosophila. Co-tratamento Através deste procedimento ficou claro que a VA diminui significativamente a toxicidade genética total dos alquilantes MNU e ENU e do agente intercalante bleomicina. Os decréscimos observados tanto para o MNU quanto para o ENU são basicamente atribuídos ao seu papel promotor sobre o processo de detoxificação - que leva a diminuição no número de metilações e etilações induzidas respectivamente pelo MNU e pelo ENU. Adicionalmente, a caracterização da VA como um potente captador de radicais livres, especialmente em função do seu efeito sobre os danos oxidativos induzidos pela BLEO – explica a sua ação desmutagênica em relação a este agente intercalante. Todos estes dados referentes ao efeito modulador da VA não permitem a quantificação da relação risco-benefício do seu consumo, especialmente pela dificuldade prática de se medir o quanto a sua presença concomitante com as genotoxinas – representado por efeito benéfico, via interferência no potencial genotóxico – ou a sua ação após a indução dos danos genéticos, através da promoção de reparo recombinacional e conseqüente aumento em HR, contribuem para a expressão final do seu efeito modulador. Entretanto, o papel fundamental da recombinação homóloga na gênese de inúmeras doenças genéticas, incluindo o câncer, e a preponderante ação recombinogênica da VA são um sinal de alerta.

Caracterização de genes de quitanases do entomopatógeno e acaricida Metarhizium anisopliae

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.

Desenvolvimento de ferramentas moleculares para indução de tolerância imunológica em transplante

As vacinas de DNA têm sido utilizadas para a indução de imunidade contra antígenos virais e bacterianos. A aplicação de modelos experimentais tem sido explorada visando a indução de tolerância imunológica através da expressão de genes cujos produtos podem modular o sistema imune para um estado de não responsividade. A terapia gênica oferece a possibilidade de manipulação do sistema imune do receptor, através de um sistema de administração de genes específicos sob condições pré-definidas. Sua eficácia depende dos níveis de expressão e da natureza do antígeno, da via de administração assim como de sua distribuição nos tecidos (a qual às vezes depende do promotor utilizado). Porém, sua aplicação clínica é limitada em parte devido aos baixos níveis de expressão obtidos in vivo. A VP22 é uma proteína do tegumento do vírus Herpes simples tipo 1, que tem a propriedade de fazer tráfego intercelular. Estudos recentes têm demonstrado a alta eficiência desta molécula no transporte de proteínas heterólogas como VP22-p53, VP22-β galactosidase e VP22-proteína verde fluorescente. Para a indução de tolerância imunológica, tem sido demonstrado que a persistência do antígeno, pelo menos por algum período, é muito importante. Moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) têm sido utilizadas para induzir tolerância a nível central ou periférico, em diferentes protocolos. Dentre estas, as moléculas da classe I do camundongo, Kb, têm sido utilizadas com sucesso. O objetivo desse trabalho foi de construir duas vacinas recombinantes: pVP22::Kb e pCIneo::Kb. A primeira contém dois genes clonados na mesma pauta de leitura: a cadeia pesada de classe I Kb e VP22. O cDNA que codifica para o Kb foi obtido pela extração de RNA total de baço de um camundongo C57BL/6 (haplótipo H-2b) seguido de transcrição reversa. Este produto foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Esta molécula também foi obtida pela amplificação direta do gene Kb previamente clonado no sítio EcoR I do plasmídeo pBluescriptIISK (Stratagene®). Ambos os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cegas no plasmídeo pCRBluntII (Invitrogen®). Foram obtidos dezenove plasmídeos recombinantes, denominados pCRBluntII::Kb, e um deles foi escolhido e digerido com as enzimas de restrição Spe I e Xba I e defosforilado com a enzima fosfatase alcalina (CIAP). O fragmento digerido foi clonado nos plasmídeos pVP22-myc/His (Invitrogen®) e pCIneo (Promega®) previamente digeridos com a enzima Xba I. Os novos plasmídeos pVP22::Kb e pCIneo::Kb foram utilizados para transfectar a linhagem celular eucariótica CHO. A expressão do mRNA para o Kb foi confirmada pela transcrição reversa e PCR e a expressão da proteína por imunofluorescência e citometria de fluxo.

Política externa, protecionismo e grupos de pressão : uma análise das salvaguardas Norte-Americanas ao aço

Discute-se, na presente dissertação, a política comercial dos Estados Unidos da América, por meio do estudo da imposição de salvaguardas às suas importações de aço em 05 de março de 2002. A análise se dá a partir de variáveis sistêmicas, como a caracterização da posição do país em relação ao sistema internacional; e domésticas, pela descrição dos grupos de pressão da indústria siderúrgica norte-americana e dos mecanismos que utilização para influenciar a decisão do Presidente George W. Bush. Por meio da utilização do modelo de Helen Milner da associação entre níveis internacionais e interno de análise, pretende-se esclarecer as razões que levaram o Estado que foi o principal promotor da construção do regime internacional de comércio a adotar uma postura protecionista em relação ao seu setor siderúrgico. Nesse sentido, foi constatado que, mesmo diante do fortalecimento do referido regime após a criação do OMC, a imposição da medida se deu preponderantemente por questões internas, tais como as pressões e o alto nível de organização do lobbies do produtores de aço, as características específicas do mercado siderúrgico estadunidense, e os interesses políticos dos governantes daquele país. Pela conjunção desses e de outros fatores, os grupos de pressão do aço obtiveram bons resultados com suas iniciativas lobísticas, em detrimento dos interesses dos países exportadores de aço e dos consumidores norte-americanos, que passaram a pagar mais por alguns bens de consumo.

Redes neurais aplicadas ao reconhecimento de regiões promotoras na família Mycoplasmataceae

Este trabalho apresenta o estudo, investigação e realização de experimentos práticos, empregados na resolução do problema de reconhecimento de regiões promotoras em organismos da família Mycoplasmataceae. A partir disso, é proposta uma metodologia para a solução deste problema baseada nas Redes Neurais Artificiais. Os promotores são considerados trechos de uma seqüência de DNA que antecedem um gene, podem ser tratados como marcadores de uma seqüência de letras que sinalizam a uma determinada enzima um ponto de ligação. A posição onde se situa o promotor antecede o ponto de início do processo de transcrição, onde uma seqüência de DNA é transformada em um RNA mensageiro e, este potencialmente, em uma proteína. As Redes Neurais Artificiais representam modelos computacionais, inspirados no funcionamento de neurônios biológicos, empregadas com sucesso como classificadores de padrões. O funcionamento básico das Redes Neurais está ligado ao ajuste de parâmetros que descrevem um modelo representacional. Uma revisão bibliográfica de trabalhos relacionados, que empregam a metodologia de Redes Neurais ao problema proposto, demonstrou a sua viabilidade. Entretanto, os dados relativos à família Mycoplasmataceae apresentam determinadas particularidades de difícil compreensão e caracterização, num espaço restrito de amostras comprovadas. Desta forma, esta tese relata vários experimentos desenvolvidos, que buscam estratégias para explorar o conteúdo de seqüências de DNA, relativas à presença de promotores. O texto apresenta a discussão de seis experimentos e a contribuição de cada um para consolidação de um framework que agrega soluções robustas consideradas adequadas à solução do problema em questão.