Freqüências de variantes alélicas de genes ligados ao sistema imunológico em uma população de indivíduos de origem japonesa no sul do Brasil

As freqüências de variantes alélicas de diferentes genes envolvidos no desenvolvimento da resposta imune foram analisadas em uma população de origem japonesa do sul do Brasil (n=119). Polimorfismos bialélicos dos genes CCR5, TNFR-II e IL-10, e dos segmentos gênicos TCRBV3S1, TCRBV13S5 e TCRBV18 foram analisados por PCR-RFLP. As freqüências alélicas foram determinadas e comparadas com as freqüências encontradas em outros grupos étnicos (caucasóides e afro-brasileiros). Nós observamos a ausência do alelo CCR5D32 na população testada. Os polimorfismos dos segmentos gênicos TCRBV3S1 e TCRBV13S5, e do gene IL-10 apresentaram freqüências alélicas significativamente diferentes das freqüências observadas em caucasóides e afro-brasileiros. O polimorfismo do segmento gênico TCRBV18 apresentou freqüências alélicas estatisticamente diferentes de caucasóides. Além disso, a comparação de duas sub-populações (definidas em nossa amostra de acordo com a origem geográfica no Japão) indicou diferenças entre as freqüências alélicas dos polimorfismos gênicos de TCRBV18 e IL-10 das mesmas. Esses dados indicam a existência de diferentes padrões imunogenéticos entre diferentes grupos étnicos. Outros polimorfismos SNPs de genes ligados ao sistema imune serão testados e comparados em nosso laboratório, utilizando as mesmas populações.

Aspectos laboratoriais do diagnóstico da deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD)

A G6PD é expressa em todos os tecidos, onde catalisa a primeira etapa da via das pentoses-fosfato. O NADPH produzido pela ação da G6PD serve como doador de elétrons na biossíntese redutora. Pelo fato de os glóbulos vermelhos não terem mitocôndria, a via das pentoses-fosfato é a única fonte de NADPH e essencial para sua proteção contra o stress oxidativo. A deficiência da G6PD é classificada como anemia hemolítica hereditária ligada ao cromossomo X, associada a manifestações clínicas heterogêneas. O gene da G6PD possui cerca de 140 variantes moleculares já descritas, muitas dessas associadas à enzimopatia. Considerando-se a alta freqüência populacional da deficiência de G6PD, a constituição da população do Rio Grande do Sul e as dificuldades diagnósticas desta deficiência, este trabalho teve como objetivo caracterizar os aspectos laboratoriais do diagnóstico da deficiência de G6PD em nosso meio. Para a quantificação da atividade da G6PD, foi utilizado o método enzimáticocolorimétrico com normalização da hemoglobina (kit intercientífica) e para as análises moleculares foram investigadas as mutações 202, 376 e 563 por PCR/RFLP. O presente estudo revelou uma prevalência combinada de 7,9% das duas formas de deficiência de G6PD (completa e parcial) no Rio Grande do Sul, com alta prevalência de pacientes parcialmente deficientes e sem correlação com origem étnica. Usando técnicas bioquímicas e moleculares, foi caracterizada a deficiência de G6PD em amostras de Porto Alegre como sendo principalmente devida às mutações G202A e A376G, representando a variante G6PD A-, confirmando uma distribuição homogênea do padrão G6PD A- no Brasil. Os resultados apresentados aqui demonstraram que as condições de estocagem (temperatura principalmente) desempenham um papel fundamental na atividade da G6PD, especialmente nas coletas em papel filtro. Na avaliação da acurácia do método enzimático de medida da atividade da G6PD as sensibilidades e especificidades calculadas para os valores de cut-off estabelecido em uma população normal foram: para 2,9 U/gHb ( 11,4% e 100%), para 8 U/g Hb (77,1% e 94,7%) e para 11,5 U/g hb (97,1% e 76,3%). Estima-se que a deficiência de ambas as formas combinadas de G6PD seja de aproximadamente 8% numa amostra do RS. A partir de uma probabilidade pré-teste de 8,0%, após a realização do ensaio enzimático, a probabilidade pós-teste de uma pessoa ser deficiente de G6PD com nível enzimático inferior a 8 U/g Hb passa a ser 55,9%. Ao passo que para níveis superiores a 11,5 U/gHb esta probabilidade de deficiência diminui para 0,37%. Pode-se concluir que o método empregado (kit Intercientífica) foi adequado para avaliar a atividade enzimática de G6PD em amostras de sangue total. É um método capaz de detectar a deficiência de G6PD, demonstrando de forma satisfatória o grau de deficiência em indivíduos que possuem mutações que causam deficiência enzimática menos severa, inclusive mulheres heterozigotas. A análise molecular pode identificar o tipo de variante mas não pode indicar o risco real para as mulheres portadoras, que é diretamente estimado pelo nível de atividade enzimática.

Identificação de genes de resistência à brusone (Magnaporthe grisea) em cultivares de arroz (Oryza sativa) utilizando marcadores moleculares

A brusone, causada por Magnaporthe grisea, é a doença mais importante do arroz. Uma vez que, o uso de cultivares resistentes é o método mais efetivo para o controle da doença, a pesquisa visa a identificação de novos genes que confiram resistência mais durável. O objetivo deste trabalho foi a identificação de cultivares que contenham os genes de resistência Pi-1, Pi-2 e Pi-11 utilizando marcadores moleculares. RG64, um marcador RFLP baseado em PCR, foi utilizado para verificar a presença do gene Pi-2 em 250 cultivares de arroz. Trinta e três cultivares apresentaram o mesmo perfil eletroforético da linha-quaseisogênica (NIL) C101A51, que contém o gene Pi-2. Verificou-se que 28 cultivares foram resistentes aos isolados inoculados, indicando que RG64 possui alta eficiência para a seleção de cultivares que contêm o gene Pi-2. Três marcadores microssatélites (RM) foram utilizados para verificar a presença do gene Pi-1 em 104 cultivares de arroz. Trinta cultivares, analisadas com RM254, apresentaram o mesmo perfil da NIL C104LAC, que contém o gene Pi-1. Verificou-se que 19 cultivares foram resistentes aos isolados inoculados. Três marcadores microssatélites foram utilizados para verificar a presença do gene Pi-11 em 104 cultivares de arroz. Oito cultivares, analisadas com RM210, apresentaram o mesmo perfil da NIL IR1529, que contém o gene Pi-11, mas somente uma foi resistente. Com exceção do RM254, os demais marcadores microssatélites tiveram baixa eficiência de seleção de cultivares com o mesmo perfil das NILs. Estes resultados indicam que o uso de marcadores moleculares pode ser útil para acelerar o processo de lançamento de cultivares com resistência à brusone. No entanto, ainda é preciso aumentar a eficiência de seleção, através de marcadores microssatélites com localização cromossomal mais próxima dos genes Pi-1 e Pi- 11. Em um futuro próximo, isto poderá ser possível com a disponibilização de mapas moleculares de maior resolução.

Detecção de salmonella sp. em psitacídeos de cativeiro através da reação em cadeia da polimerase (PCR)

O interesse da Medicina Veterinária nas espécies silvestres tem aumentado gradativamente, principalmente no estudo dos contextos ecológicos de saúde. Dentro desse contexto, autores realizaram estudos com o objetivo de conhecer a importância de Salmonella sp. na saúde das aves silvestres e seu potencial de transmissão para humanos e outros animais. Informações sobre a prevalência e distribuição dos sorovares de salmonelas na população de animais silvestres e domésticos são essenciais para relacionar os possíveis reservatórios que possam ser responsáveis pela transmissão dessa zoonose. Este trabalho teve como objetivo a detecção de Salmonella sp. em psitacídeos clinicamente sadios por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Foram coletados suabes cloacais de 280 psitacídeos mantidos em cativeiro no Estado do Rio Grande do Sul, pertencentes a treze espécies, provenientes de um zoológico, um criadouro conservacionista e um criadouro comercial. O DNA das amostras foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio e examinados pela PCR com a utilização de um par de iniciadores que amplifica um fragmento de 284 pb do gene invA pertencente ao gênero Salmonella, resultando em 37 amostras positivas. Não houve diferença na prevalência de salmonela entre os três plantéis nem entre as 13 espécies analizadas. Não foi possível a detecção desse patógeno pela PCR com iniciadores para a identificação de S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Pullorum e S. Gallinarum, nem através da Técnica Microbiológica Convencional nas amostras detectadas pela PCR genérica, provavelmente devido a maior sensibilidade e especificidade da PCR genérica. De acordo com a revisão bibliográfica realizada, este foi o primeiro trabalho de detecção direta de Salmonella em psitacídeos utilizando a PCR. Os resultados indicaram que aproximadamente 13,2% dos psitacídeos mantidos em cativeiro eram portadores assintomáticos ou eram transientemente infectados pelo gênero Salmonella.

Estabelecimento de um protocolo de Nested-PCR para detecção do vírus da anemia das galinhas e análise filogenética de cepas brasileiras.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.

Tipificação molecular de amostras de Brucella spp. utilização a técnica de BOX-PCR

O gênero Brucella é formado por coco-bacilos Gram negativos patogênicos ao homem e animais, sendo classificado como patógeno de grupo de risco III. A identificação dessas bactérias apresenta várias limitações como: exigência de inoculação em vários meios, tempo de incubação longo e necessidade de soros imunes e bacteriófagos. Devido à sua alta patogenicidade e ao longo tempo de exposição dos laboratoristas à bactéria, a brucelose é uma das infecções mais freqüentemente adquiridas em laboratório. Além da contaminação em laboratório, a transmissão ao homem pode ocorrer através de animais infectados e ingestão de produtos derivados, como o leite cru. A procura de métodos rápidos de identificação das espécies e biovares pode ser útil para diminuir os riscos do manuseio desta bactéria e na tomada de medidas de controle epidemiológico. O principal objetivo deste trabalho foi facilitar a classificação de cepas de referência de Brucella spp. e isoladas no Brasil utilizando a técnica de rep-PCR com oligonucleotídeos do elemento BOX, uma seqüência repetida presente no genoma de várias bactérias. Foram analisados 38 isolados representando diferentes espécies e biovares de Brucella sp. e 13 isolados de gêneros relacionados como controle da especificidade da reação. Foi realizada uma confirmação prévia dos isolados de brucela por testes bioquímicos e PCR gênero-específica. A técnica de BOX-PCR agrupou todas as espécies e biovares de Brucella em um único grupo com nível de similaridade entre 100 e 74%. Diferenças entre os isolados, quanto a presença ou ausência de bandas, puderam ser observadas. Entretanto, essas divergências não caracterizam uma espécie ou biovar. Bandas comuns a todos os isolados de Brucella sp. podem caracterizar o gênero.

Caracterização por susceptibilidade a antimicrobianos, PCR-ribotipificação e RAPD de Salmonella Enteritidis envolvidas em surtos de doenças veiculadas por alimentos ocorridas no Rio Grande do Sul, nos anos de 2001 e 2002

A Salmonella é uma das principais causas de doenças transmitidas por alimentos em todo o mundo, sendo que no Rio Grande do Sul ela tem sido apontada como o principal agente de toxinfecções alimentares nos últimos anos. Nesse trabalho, foram caracterizadas linhagens de Salmonella isoladas de alimentos envolvidos em Salmoneloses ocorridas no Rio Grande do Sul, no período de 2001 a 2002. Entre os 85 isolados investigados, 79 (93%) foram sorotipificados como S. Enteritidis, enquanto os outros seis isolados foram classificados como S. Javiana (n=1), S. Infantis (n=1), S. Agona (n=1), S. Typhimurium (n=1) e S. enterica subsp. enterica (1,4,5) (n=2). A resistência das amostras de S. Enteritidis a dez agentes antimicrobianos foi investigada. De modo geral, altas porcentagens de sensibilidade foram verificadas. As maiores porcentagens de resistência foram apresentadas em relação ao ácido nalidíxico (21,5%), à gentamicina (12,7%) e à estreptomicina (11,4%). A resistência a um ou mais antimicrobianos foi verificada em 30 amostras (37,97%), o que permitiu que os isolados fossem agrupados em 32 perfis de susceptibilidade. Apenas duas amostras apresentaram resistência múltipla a quatro drogas. Quando os isolados de S. Enteritidis foram submetidos à PCR-Ribotipificação, somente dois perfis (R1 e R2) foram identificados, sendo que o perfil R1 agrupou 92,4% dos isolados. . Os mesmos isolados também foram analisados por RAPD, sendo possível identificar quatro perfis de bandas (A a D). O perfil A agrupou 81% das amostras, enquanto os perfis B, C e D agruparam 9%, 5% e 5% dos isolados, respectivamente. Os resultados das análises de PCR-Ribotipificação e de RAPD sugerem que uma mesma linhagem de S. Enteritidis foi isolada a partir de alimentos envolvidos em Salmoneloses ocorridas em diferentes cidades do Estado durante o período de 2001 a 2002.

Caracterização parcial de um fragmento e detecção por RT-PCR de Rice Stripe Necrosis Virus

O enrolamento do arroz é uma doença viral emergente no Brasil causada pelo Rice stripe necrosis virus (RSNV) que é transmitido pelo protozoário Polymyxa graminis. RSNV é um membro do gênero Benyvirus com genoma dividido em 4 RNAs de fita simples no sentido positivo (ssRNA +). Em função da falta de conhecimento sobre a seqüência de nucleotídeos do seu genoma, a detecção de RSNV através de métodos moleculares não é utilizada. O objetivo deste trabalho foi identificar seqüências do genoma de RSNV que possibilitassem sua detecção em plantas de arroz através da técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). As seqüências do genoma foram identificadas a partir de clones de uma biblioteca de cDNAs obtidos de uma amostra do vírus parcialmente purificado. Os clones que hibridizaram com sondas sintetizadas a partir de RNA de plantas infectadas com RSNV foram seqüenciados e comparados às seqüências do GenBank. Um fragmento de 957 nt da extremidade 3’ da fita de um dos 4 RNAs genômicos de RSNV foi obtido. A análise da seqüência nucleotídeos desse fragmento não revelou qualquer similaridade com seqüências conhecidas, tampouco indicou uma possível função. Um par de oligonucleotídeos iniciadores foi desenhado a partir de um clone que potencialmente contém uma seqüência de RSNV. A especificidade e a sensibilidade da RT-PCR utilizando esse par de oligonucleotídeos iniciadores, bem como sua eficiência na detecção do vírus em diferentes partes da planta de arroz, foram avaliadas. Os resultados indicam que a RT-PCR é específica para RSNV e pode detectar o vírus em tecido oriundo das raízes, do colo e de folhas com distorção. Comparada ao diagnóstico da doença através da observação de sintomas e de estruturas do vetor, a RT-PCR é uma ferramenta confiável para a diagnose do enrolamento do arroz.

Análise de vacinas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de marek por PCR em tempo real e cultivo celular.

A doença de Marek (MD), causada por um alfaherpesvírus, é uma enfermidade linfoproliferativa que acomete principalmente galinhas. Como não existe tratamento, a melhor forma de prevenção e controle da MD é através do uso de vacinas atenuadas, que vêm sendo usadas desde 1970. Este trabalho descreve a análise de vacinas vivas congeladas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de Marek (herpesvírus de peru – HVT) por PCR em tempo real (qPCR) e por cultivo em células de embrião de galinha. Foram avaliadas três vacinas (cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. As análises da homogeneidade inter e intra-lote apresentaram, respectivamente, média ± desvio padrão de 2,6 ± 1,7%, 2,1 ± 1,1% e 1,2 ± 0,1% e média ± desvio padrão de 1,5 ± 0,1%, 1,2 ± 0,8% e 1,0 ± 0,3% para A, B e C, respectivamente. A qPCR subestimou os títulos das vacinas concentradas 4x e superestimou os títulos das vacinas diluídas 8x, enquanto o cultivo celular superestimou os títulos das vacinas concentradas. As vacinas apresentaram quantidades diferentes de células/dose e unidade formadoras de placa/dose. Conseqüentemente, a relação PFU/célula também foi diferente, o que demonstra a necessidade de construção de curvas diferentes, para cada fabricante, para a titulação por qPCR.

Titulação de vacinas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de marek por pcr em tempo real

A Doença de Marek é uma enfermidade linfoproliferativa das aves, causada por um alfaherpesvírus e caracterizada pela infiltração de células em nervos periféricos, gônadas, íris, vísceras, músculos e pele. Desde 1970, vacinas atenuadas têm sido utilizadas como ferramenta principal no controle da doença. Esse trabalho descreve a implantação da Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) para a titulação de vacinas contra o vírus da doença de Marek do sorotipo 3, herpesvírus dos perus (HVT). A qPCR foi comparada com a técnica tradicional de titulação, baseada no cultivo celular de fibroblastos de embrião de galinha. Foram avaliadas três vacinas vivas (congeladas, cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. A técnica molecular apresentou alta correlação entre os valores de threshold cycle (CT) e respectivas diluições das vacinas (R2 = 0,99), indicando que, dentro desta faixa linear testada (102 a 104 PFU/dose), a qPCR foi capaz de quantificar as vacinas disponíveis no mercado. A reprodutibilidade da titulação em cultivo celular e qPCR foi avaliada pela realização dos testes em três dias distintos a partir de ampolas de um mesmo lote da vacina. Os títulos obtidos por ambos os métodos demonstraram alta reprodutibilidade e coerência com o fornecido pelo fabricante. Caracterizou-se também a proporção de vírus livres e associados às células, onde foi observado que, pelo menos, 90% dos vírus encontravamse na forma associada. Este trabalho indicou que a qPCR é reprodutível, rápida e menos trabalhosa do que a titulação em cultivo celular tradicionalmente utilizada.