Estabelecimento de um protocolo de Nested-PCR para detecção do vírus da anemia das galinhas e análise filogenética de cepas brasileiras.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.

Análise de vacinas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de marek por PCR em tempo real e cultivo celular.

A doença de Marek (MD), causada por um alfaherpesvírus, é uma enfermidade linfoproliferativa que acomete principalmente galinhas. Como não existe tratamento, a melhor forma de prevenção e controle da MD é através do uso de vacinas atenuadas, que vêm sendo usadas desde 1970. Este trabalho descreve a análise de vacinas vivas congeladas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de Marek (herpesvírus de peru – HVT) por PCR em tempo real (qPCR) e por cultivo em células de embrião de galinha. Foram avaliadas três vacinas (cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. As análises da homogeneidade inter e intra-lote apresentaram, respectivamente, média ± desvio padrão de 2,6 ± 1,7%, 2,1 ± 1,1% e 1,2 ± 0,1% e média ± desvio padrão de 1,5 ± 0,1%, 1,2 ± 0,8% e 1,0 ± 0,3% para A, B e C, respectivamente. A qPCR subestimou os títulos das vacinas concentradas 4x e superestimou os títulos das vacinas diluídas 8x, enquanto o cultivo celular superestimou os títulos das vacinas concentradas. As vacinas apresentaram quantidades diferentes de células/dose e unidade formadoras de placa/dose. Conseqüentemente, a relação PFU/célula também foi diferente, o que demonstra a necessidade de construção de curvas diferentes, para cada fabricante, para a titulação por qPCR.

Titulação de vacinas contra o sorotipo 3 do vírus da doença de marek por pcr em tempo real

A Doença de Marek é uma enfermidade linfoproliferativa das aves, causada por um alfaherpesvírus e caracterizada pela infiltração de células em nervos periféricos, gônadas, íris, vísceras, músculos e pele. Desde 1970, vacinas atenuadas têm sido utilizadas como ferramenta principal no controle da doença. Esse trabalho descreve a implantação da Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) para a titulação de vacinas contra o vírus da doença de Marek do sorotipo 3, herpesvírus dos perus (HVT). A qPCR foi comparada com a técnica tradicional de titulação, baseada no cultivo celular de fibroblastos de embrião de galinha. Foram avaliadas três vacinas vivas (congeladas, cepa FC126) provenientes de distintos fabricantes. A técnica molecular apresentou alta correlação entre os valores de threshold cycle (CT) e respectivas diluições das vacinas (R2 = 0,99), indicando que, dentro desta faixa linear testada (102 a 104 PFU/dose), a qPCR foi capaz de quantificar as vacinas disponíveis no mercado. A reprodutibilidade da titulação em cultivo celular e qPCR foi avaliada pela realização dos testes em três dias distintos a partir de ampolas de um mesmo lote da vacina. Os títulos obtidos por ambos os métodos demonstraram alta reprodutibilidade e coerência com o fornecido pelo fabricante. Caracterizou-se também a proporção de vírus livres e associados às células, onde foi observado que, pelo menos, 90% dos vírus encontravamse na forma associada. Este trabalho indicou que a qPCR é reprodutível, rápida e menos trabalhosa do que a titulação em cultivo celular tradicionalmente utilizada.

Detecção de salmonella sp. em psitacídeos de cativeiro através da reação em cadeia da polimerase (PCR)

O interesse da Medicina Veterinária nas espécies silvestres tem aumentado gradativamente, principalmente no estudo dos contextos ecológicos de saúde. Dentro desse contexto, autores realizaram estudos com o objetivo de conhecer a importância de Salmonella sp. na saúde das aves silvestres e seu potencial de transmissão para humanos e outros animais. Informações sobre a prevalência e distribuição dos sorovares de salmonelas na população de animais silvestres e domésticos são essenciais para relacionar os possíveis reservatórios que possam ser responsáveis pela transmissão dessa zoonose. Este trabalho teve como objetivo a detecção de Salmonella sp. em psitacídeos clinicamente sadios por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Foram coletados suabes cloacais de 280 psitacídeos mantidos em cativeiro no Estado do Rio Grande do Sul, pertencentes a treze espécies, provenientes de um zoológico, um criadouro conservacionista e um criadouro comercial. O DNA das amostras foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio e examinados pela PCR com a utilização de um par de iniciadores que amplifica um fragmento de 284 pb do gene invA pertencente ao gênero Salmonella, resultando em 37 amostras positivas. Não houve diferença na prevalência de salmonela entre os três plantéis nem entre as 13 espécies analizadas. Não foi possível a detecção desse patógeno pela PCR com iniciadores para a identificação de S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Pullorum e S. Gallinarum, nem através da Técnica Microbiológica Convencional nas amostras detectadas pela PCR genérica, provavelmente devido a maior sensibilidade e especificidade da PCR genérica. De acordo com a revisão bibliográfica realizada, este foi o primeiro trabalho de detecção direta de Salmonella em psitacídeos utilizando a PCR. Os resultados indicaram que aproximadamente 13,2% dos psitacídeos mantidos em cativeiro eram portadores assintomáticos ou eram transientemente infectados pelo gênero Salmonella.

Competências distintivas dos produtores integrados de aves no vale do Taquari

O contínuo aperfeiçoamento e a busca de melhores resultados deve fazer parte de todas as cadeias de produção. É parte do processo de gerenciamento de qualquer atividade. A busca por melhores posicionamentos mercadológicos torna imperioso que todos os elos da cadeia produtiva gerenciem seus processos, controlem custos e, sobretudo, sejam rentáveis. No entanto no setor da avicultura de corte, mais especificamente no nível do produtor rural, a realidade mostra que existem grandes diferenças nos resultados, principalmente, nos financeiros. Isto instiga a crer que existam maneiras, competências ou estratégias diversas na condução da atividade e que isto seja determinante dos resultados. Neste contexto, o objetivo geral deste estudo foi identificar as competências distintivas ou estratégicas dos produtores integrados de aves no Vale do Taquari, Rio Grande do Sul, que obtêm resultados financeiros comparativamente superiores em relação aos de baixa performance. A análise teórica se baseou na abordagem de cadeias de produção ou filière, que evidencia uma análise estrutural e funcional da atividade, bem como sua interdependência num sistema integrado. Também é referenciada na noção de competência distintiva ou posicionamento estratégico como habilitadores de vantagens ou melhores resultados. É ainda descrita a atividade de produção de frangos de corte bem como sua inserção no setor em vários cenários, que permite uma melhor contextualização em relação ao seu mercado. Após é apresentado o método utilizado, que é uma pesquisa descritiva com coleta de dados primários, junto aos produtores integrados através de um questionário, numa amostragem por julgamento para posterior análise. A análise das respostas permitiu verificar os dados pessoais dos produtores, sua capacitação tecnológica, operacional e gerencial e, ainda, suas opiniões a respeito da atividade. Finalizando pôde se concluir que não existe um padrão ou modelo único a ser seguido para garantir os melhores resultados. Cada produtor deve descobrir e conhecer o que é essencial no processo de produção, ou seja, conhecer e usar da melhor maneira seus equipamentos, seus potenciais e suas limitações e em cima disso construir seu posicionamento estratégico. Isto são competências que distinguirão os produtores de alta performance dos demais.

Estrutura espacial e sazonal da avifauna e considerações sobre a conservação de aves aquáticas em uma área úmida no Rio Grande do Sul, Brasil

Mosaicos de áreas úmidas fornecem hábitats para uma ampla gama de espécies de aves, que raramente se distribuem uniformemente dentro das mesmas. O cenário mundial atual do estudo de aves em áreas úmidas deixa bem claro que as metodologias para estudos quantitativos de aves em áreas úmidas ainda estão sendo criadas ou aperfeiçoadas. O mosaico formado pelas áreas úmidas do Banhado dos Pachecos é de reconhecida importância para a conservação de aves aquáticas, constituindo-se numa área ideal para estudos da avifauna. A presente dissertação tem como objetivo avaliar a estrutura espacial e sazonal da avifauna do Banhado dos Pachecos, tecer considerações sobre a conservação das aves aquáticas sob uma perspectiva de paisagem e testar a viabilidade de se utilizar amostragens matinais e vespertinas para análises de distribuição e abundância da avifauna. O Banhado dos Pachecos, juntamente com o Banhado Grande, formam o Sistema Banhado Grande. A amostragem da avifauna foi conduzida através de levantamentos qualitativos e quantitativos de modo a cobrir quatro estações climáticas: verão, outono, inverno e primavera. As amostragens qualitativas foram realizadas através de deslocamentos ad libitum entre e durante as amostragens quantitativas em todas as fisionomias. As amostragens quantitativas foram realizadas através de pontos de contagem, transecções e contagens totais. Riqueza, grupos funcionais de forrageio, grupos funcionais de nidificação, aves aquáticas, situação de ocorrência no Rio Grande do Sul, espécies ameaçadas de extinção e abundância foram os descritores utilizados para a caracterização da avifauna. A estatística empregada na análise dos dados multivariados baseou-se em métodos não-paramétricos de reamostragem através de aleatorização e “bootstrap”. Análises de agrupamentos foram realizadas para determinar a formação de grupos de fisionomias e análises de coordenadas principais foram realizadas para determinar se existia algum padrão de associação entre as diferentes fisionomias. Registraram-se 209 espécies de aves, vinte e e três grupos funcionais de forrageio, sete grupos funcionais de nidificação e 60 espécies de aves aquáticas e 11 espécies ameaçadas de extinção. Trinta e duas espécies apresentaram evidências discordantes da situação de ocorrência conhecida para o estado. Alguns fatores que poderiam ser fontes de viés para a interpretação das análises na presente dissertação foram abordados. A constância encontrada no conjunto de espécies da área de estudo pode refletir uma maior estabilidade ambiental. O alto número de grupos funcionais de forrageio e de nidificação registrados para a área de estudo sugere uma grande diversidade de recursos, reflexo da heterogeneidade entre as diferentes fisionomias. A origem de algumas espécies que se mostraram efetivamente migratórias, pois usaram a área de estudo em um período estacional bem definido, se mostra uma incógnita. Somente estudos extensivos e abrangentes poderão responder essas perguntas e propor medidas eficientes para a conservação tanto das áreas úmidas como das espécies que delas dependem. A restauração de um corredor de áreas úmidas entre o banhado dos Pachecos e o banhado Grande, juntamente com um manejo rotativo de cultivos de arroz parece ser a alternativa mais viável e conciliatória entre pontos de vista econômico e conservacionista para possibilitar o aumento da conectividade no Sistema Banhado Grande.

Doença infecciosa bursal: avaliação da patogenicidade de vacinas comercializadas no Brasil em aves livres de patógenos específicos.

A doença infecciosa bursal ( DIB ) é uma enfermidade viral, que acomete galinhas provocando imunodepressão sendo, economicamente, importante para a indústria avícola. O controle da DIB é realizado através de diferentes vacinas assim como programas de vacinação. No presente trabalho, a patogenicidade de três vacinas intermediárias ( I1, I2 e I3 ), duas intermediárias mais patogênicas ( IP1, IP2 ) e três vacinas contendo vírus forte ( F1, F2 e F3 ) foi avaliada. Aves vacinadas com IP1, IP2, F1, F2 e F3 apresentaram tamanho da bolsa de Fabrício, significativamente, menor em relação ao grupo controle e aos animais vacinados com I1, I2 e I3. Por outro lado, a vacina I3 produziu título de anticorpos semelhante ao grupo controle diferindo de todas as demais vacinas. Porém I1 e I2 induziram títulos de anticorpos maiores que o grupo controle, sendo que I1 promoveu a formação de título de anticorpos semelhante à IP1, IP2, F1, F2 e F3. Os escores de lesão histopatológica mostraram que I1, I2 e I3 induziram graus similares de lesão da bolsa, sendo que I2 e I3 não diferiram do grupo controle, enquanto I1 apresentou diferença. As vacinas intermediárias mais patogênicas, assim como as vacinas“fortes“ promoveram escores de lesão, significativamente, maiores que as demais vacinas testadas. Esses resultados sugerem que as vacinas intermediárias mais patogênicas e as vacinas “fortes“ são capazes de causar severos danos na bolsa de Fabrício. Também foi possível inferir que a bursometria pode ser inadequada para a avaliação vacinal, porém pode ser utilizada na escolha da vacina para programas de vacinação. Além disso, observou-se que as vacinas “fortes“ induziram a formação de títulos de anticorpos mais altos que as demais vacinas, porém algumas vacinas intermediárias são capazes de promover títulos semelhantes.

Tipificação molecular de amostras de Brucella spp. utilização a técnica de BOX-PCR

O gênero Brucella é formado por coco-bacilos Gram negativos patogênicos ao homem e animais, sendo classificado como patógeno de grupo de risco III. A identificação dessas bactérias apresenta várias limitações como: exigência de inoculação em vários meios, tempo de incubação longo e necessidade de soros imunes e bacteriófagos. Devido à sua alta patogenicidade e ao longo tempo de exposição dos laboratoristas à bactéria, a brucelose é uma das infecções mais freqüentemente adquiridas em laboratório. Além da contaminação em laboratório, a transmissão ao homem pode ocorrer através de animais infectados e ingestão de produtos derivados, como o leite cru. A procura de métodos rápidos de identificação das espécies e biovares pode ser útil para diminuir os riscos do manuseio desta bactéria e na tomada de medidas de controle epidemiológico. O principal objetivo deste trabalho foi facilitar a classificação de cepas de referência de Brucella spp. e isoladas no Brasil utilizando a técnica de rep-PCR com oligonucleotídeos do elemento BOX, uma seqüência repetida presente no genoma de várias bactérias. Foram analisados 38 isolados representando diferentes espécies e biovares de Brucella sp. e 13 isolados de gêneros relacionados como controle da especificidade da reação. Foi realizada uma confirmação prévia dos isolados de brucela por testes bioquímicos e PCR gênero-específica. A técnica de BOX-PCR agrupou todas as espécies e biovares de Brucella em um único grupo com nível de similaridade entre 100 e 74%. Diferenças entre os isolados, quanto a presença ou ausência de bandas, puderam ser observadas. Entretanto, essas divergências não caracterizam uma espécie ou biovar. Bandas comuns a todos os isolados de Brucella sp. podem caracterizar o gênero.