Sobrevivência de Escherichia coli,Staphylococcus aureus e Salmonella Enteritidis durante o armazenamento de hambúrguer de frango

Com o objetivo de avaliar a sobrevivência ao congelamento de microrganismos potencialmente patogênicos, hambúrgueres de frango foram contaminados com Escherichia coli (ECHC), Staphylococcus aureus (SAFH) e Salmonella Enteritidis (SE86) e armazenados a -18ºC. Os mesmos microrganismos e ainda E. coli ATCC 25972, S. aureus ATCC 25923, and S. Enteritidis ATCC 13076 também foram inoculados em água peptonada 0,1% e congelados a -18ºC, a fim de avaliar um possível efeito protetor dos componentes do hambúrguer sobre os microrganismos. A quantificação dos microrganismos foi realizada nos intervalos de 0, 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 e 28 dias de congelamento. Com o propósito de estudar as alterações nos ácidos graxos das células microbianas expostas ao congelamento, foram extraídos os ácidos graxos de cada bactéria, congelada e não congelada, e estes foram analisados por cromatografia gasosa. Os resultados demonstraram que, de modo geral, houve uma redução média de menos de 1 unidade logarítmica (log10) no número de células artificialmente inoculadas em hambúrgueres de frango. As reduções obtidas para cada microrganismo em água peptonada 0,1% foram significativamente (P0,05) maiores do que as reduções observadas em hambúrguer de frango, sugerindo a existência de um efeito crioprotetor dos componentes do hambúrguer. Em todos os experimentos, as reduções mais expressivas foram observadas nas primeiras semanas de congelamento. Ocorreram alterações expressivas na composição de ácidos graxos de S. aureus (SAFH) e S. aureus ATCC 25923, o que pode indicar que estes microrganismos alteraram a composição dos seus ácidos graxos como resposta ao estresse causado pelo congelamento.

Cloro e ozônio aplicados à desinfecção de efluente hospitalar tratado em contadores biológicos rotatórios, com avaliação de efeitos tóxicos em Daphnia similis

Neste trabalho foi avaliado o desempenho do sistema de contatores biológicos rotatórios para a remoção de matéria orgânica de efluente hospitalar e a posterior inativação de coliformes totais, Escherichia coli e Enterococcus sp. com os oxidantes hipoclorito de sódio e ozônio. A toxicidade gerada nos processos de desinfecção foi avaliada em Daphnia similis. Os efluentes hospitalares podem apresentar semelhanças aos efluentes domésticos no que diz respeito à concentração de matéria orgânica, coliformes e pH e ambos são, geralmente, coletados pela rede de esgotos e enviados para mesma estação de tratamento. Contudo, a presença de substâncias como fármacos, desinfetantes e compostos químicos, bem como organismos patogênicos multirresistentes a antimicrobianos podem ocorrer em elevadas contagens nas águas residuárias hospitalares. O sistema biológico de tratamento utilizado nesta pesquisa se mostrou adequado, obtendo-se remoções de matéria orgânica na ordem de 80% em termos de DQO, sendo que no término do experimento atingiu-se 88,5% de remoção de DQO para o tempo de detenção hidráulico de 2,28 horas. Houve a inativação de 1 a 2 unidades logarítmicas para coliformes totais, de 2 a 3 unidades logarítmicas para Escherichia coli e significativa remoção de toxicidade. O desempenho dos desinfetantes hipoclorito de sódio e ozônio mostrou similaridades. Entretanto, ao comparar-se com efluentes domésticos, foram necessárias maiores dosagens para o efluente hospitalar devido ao elevado consumo de oxidante pela presença da matéria orgânica refratária ao tratamento biológico. O processo de desinfecção com hipoclorito de sódio apresentou variabilidade nos resultados, em função da concentração de matéria orgânica, nitrogênio amoniacal e pH do efluente. Para ensaios em bateladas em volumes de amostra de 1 litro, valores de C.t oscilaram entre 20 a 50 mg.min.L-1 para inativação de E. coli. A desinfecção por ozônio também sofreu variações em função da matriz complexa do efluente. A inativação dos organismos somente foi acentuada após adição de 70 a 90 mg.L-1 de ozônio, concentrações estas nas quais se observou grande decaimento na absorbância em UV 254 nm, indicando possivelmente o consumo prioritário de ozônio para outras reações de oxidação, tais como a ruptura de anéis aromáticos e/ou insaturações nas cadeias carbônicas. Efluentes de origem doméstica foram rapidamente desinfetados com ozônio. Os organismos Enterococcus sp. apresentaram decaimento ora semelhante a coliformes totais, ora semelhante a Escherichia coli e ora resistentes frente à ação do desinfetante. Após total inativação de coliformes fecais foram eventua lmente observadas contagens na ordem de 103 UFC.100mL-1 de Enterococcus sp. Dada a prevalência de organismos resistentes a antibióticos que, em função disso, apresentam maior grau de virulência, observou-se que somente o monitoramento de coliformes totais e fecais não seria adequado para a desinfecção e lançamento de efluentes hospitalares. A toxicidade aguda do efluente, verificada em Daphnia similis, aumentou após adição de cloro mas foi reduzida quando houve decloração com tiossulfato de sódio. Com adição de ozônio, verificou-se variabilidade nos resultados, mas geralmente houve aumento da toxicidade após aplicação de elevadas dosagens as quais foram necessárias para desinfecção.

Seleção de isolados de Paenibacillus spp com atividade enzimática e antimicrobiana

As bactérias do gênero Paenibacillus são isolados de uma grande variedade de ambientes e tem como característica a produção e secreção de enzimas extracelulares, antimicrobianos e compostos antifúngicos inibidores de vários patógenos animais e vegetais. Os 55 isolados de 15 espécies de Paenibacillus foram testados frente a diversos substratos a fim de verificar a produção de enzimas extracelulares. Foram também testados frente a uma variedade de bactérias e fungos fitopatógenos, humanos e animais para a produção de antibióticos. Nessa triagem, P. validus, P. chibensis, P. koreensis e P. peoriae se destacaram inibindo a maioria das bactérias indicadoras. As espécies P. validus, P. chibensis e P. peoriae foram bons produtores de substancias que inibiram o crescimento de fungos, demonstrando que o gênero possui um amplo espectro de atuação. O tradicional procedimento de triagem para obterem-se novos microrganismos produtores de enzimas para fins biotecnológicos foi executado neste trabalho. As 55 linhagens foram avaliadas na sua capacidade de produzir amilase, proteases (caseinase), celulase, xantanase, xilanase, pectinase, quitinase e lipase. Os isolados se mostraram bons produtores de enzimas hidrolíticas, já que 26 apresentaram atividade xilanolítica, 17 atividade pectinolítica, 49 atividade proteolítica, 43 atividade xantanolítica, 40 atividade celulolítica, 17 atividade lipolítica, 39 atividade amilolítica em condições neutras (pH 7) e 26 atividade amilolítica em condições alcalinas (pH 10), e apenas 4 apresentaram atividade quitinolítica. Sendo assim, esses isolados são candidatos a serem utilizados como agentes biocontroladores ou podem ser explorados como produtores de antimicrobianos e de enzimas hidrolíticas de interesse.

Rinossinusite fúngica em pacientes com doença nasossinusal crônica

Resumo não disponível.

Avaliação do impacto do herbicida glifosato na microbiota do solo e biodegradação por cepas de Fusarium

Investigou-se o impacto e a biodegradação do glifosato pela microbiota do solo. O solo utilizado foi (Argissolo vermelho distrofico arênico) coletado a 30 e 60 cm de profundidade onde foi quantificado a taxa de CO2 produzido e as UFC de bactérias e fungos . Foram utilizadas 5 cepas de fungos filamentosos pertencentes do gênero Fusarium crescidos em meio de cultura Czapeck com adição de glifosato, no qual foram testadas: a utilização como substrato, a concentração máxima inibitória e a biodegradação em agitador e em biorreator. Foi observado que a introdução do herbicida no solo não apresentou efeito negativo sobre a microbiota e que a população de bactérias cultiváveis foi mais numerosa que a de fungos. Dentre as cepas testadas nenhuma foi inibida pela presença do glifosato, mesmo a altas concentrações. Todas as cepas estudadas foram capazes de biodegradá-lo e utilizá-lo como fonte de nutriente. A formação de consórcio não apresentou maior eficiência na metabolização do composto quando comparado as culturas crescidas puras, sendo a biodegradação em biorreator mais eficiente que aquela realizada em agitador horizontal.

Caracterização molecular e morfofisiológica de diferentes isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae e análise morfológica do processo de infecção em Boophilus microplus

A caracterização molecular e morfofisiológica de 28 isolados de Metarhizium ssp. foi avaliada por análises de seqüências do espaçador transcrito interno (ITS1 e ITS2), presença de elementos dsRNA e taxa de crescimento e esporulação em diferentes temperaturas e pH. A patogenicidade de 19 isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium ssp. foi avaliada para fêmeas ingurgitadas do carrapato Boophilus microplus. As alterações cronológicas durante o processo de infecção Metarhizium anisopliae isolado E6 em B. microplus foi avaliada em detalhe por microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão. O seqüenciamento do espaçador transcrito interno confirmou a identidade taxonômica dos isolados avaliados como M. anisopliae var. anisopliae ou M. anisopliae var. majus e mostrou que dois isolados (CG291 e CG423), previamente classificados como Metarhizium flavoviride, são pertencentes a M. anisopliae var. anisopliae. Os testes sobre a influência da temperatura e pH no desenvolvimento e esporulação dos isolados evidenciaram que a melhor temperatura de crescimento para a maioria desses foi 28oC e que o crescimento foi ótimo na faixa de pH entre 4 a 9. Os bioensaios mostraram que três isolados (C14, CG47 e CG97) foram altamente patogênicos para fêmeas ingurgitadas de B. microplus sendo tão virulentos quanto o isolado E6, previamente analisado, causando cerca de 90-100% de mortalidade ao 4o dia de infecção. Outros isolados foram menos virulentos ou não mostraram virulência para o carrapato. A presença de dsRNA foi avaliada em 28 isolados e detectada em 21 isolados. Vários padrões de dsRNA foram observados baseados no tamanho molecular analisado por eletroforese em gel de agarose. Nenhuma correlação foi observada entre a presença de dsRNA e a virulência do fungo. As observações microscópicas evidenciaram que o fungo M. anisopliae isolado E6 invade seu hospedeiro por penetração direta da cutícula, sendo que este processo envolveu as etapas de adesão e germinação dos conídios, formação do apressório e penetração do fungo na cutícula do hospedeiro. A adesão e germinação dos conídios na superfície da cutícula se iniciou após 24 h de infecção. Neste mesmo tempo, ocorreu diferenciação do apressório, estrutura que exerce a pressão mecânica durante o processo de penetração, sendo que este processo é facilitado pela ação de enzimas hidrolíticas secretadas pelo fungo. A penetração de algumas hifas ocorreu até 24 h após a infecção do fungo, embora, neste mesmo tempo de infecção, a maioria dos conídios ainda estivesse em processo de germinação. A penetração em massa do fungo foi observada 72 h após a infecção e, após 96 h, as hifas emergiram na superfície da cutícula para originarem novos conídios e assegurarem a perpetuação do fungo. A intensa invasão das hifas nos tecidos adjacentes confirmou a eficácia do isolado E6 na infecção do carrapato B. microplus.

Aspectos clínicos e patológicos da circovirose suína no Rio Grande do Sul.

Este estudo incluiu 523 suínos, entre três e quatro meses de idade, com sinais clínicos sugestivos de circovirose. A maioria (471) desses animais foi recebida viva no Setor de Patologia Veterinária – SPV/UFRGS, onde foram avaliados clinicamente, eutanasiados e necropsiados. Os principais sinais observados foram caquexia, crostas eritematosas circulares na pele, alterações articulares, palidez ou icterícia de mucosas, diarréia, sinais respiratórios e sinais nervosos. Os principais achados macroscópicos foram linfadenomegalia, pulmões não colapsados, consolidações pulmonares, hiperqueratose do quadrilátero esofágico, esplenomegalia, rins pálidos ou amarelados com pontos brancos, ascite, hidropericárdio e hidrotórax. Fragmentos de pele, linfonodo inguinal, linfonodo mesentérico, tonsila, baço, íleo, cólon, fígado, rim, pulmão, coração e cérebro foram coletados e processados convencionalmente para histologia. As principais alterações microscópicas incluíram infiltrado linfoistiocitário e depleção centrofolicular em órgãos linfóides, infiltrado linfoistiocitário nos intestinos, pneumonia intersticial, hepatite portal mononuclear, nefrite intersticial e hiperplasia centrofolicular, edema e dilatação de vasos linfáticos dos intestinos e linfonodos. Amostras de cólon e íleo de 111 suínos que apresentavam conteúdo de consistência fluida foram coletadas e processadas para bacteriologia. Em 27 desses animais foram detectados agentes bacterianos patogênicos. E. coli foi o mais prevalente, mas Salmonella sp. e Brachyspira sp. também foram detectadas. Cortes de linfonodos mesentéricos, pulmões, rins e intestinos de 56 animais foram submetidos à imunoistoquímica com anticorpo policlonal anti-PCV2. Destes, amostras de 50 foram positivas. Os achados clínicos e macroscópicos desses animais foram compatíveis com circovirose, mas a associação de lesões histológicas características da doença com a presença do PCV2, demonstrada imunoistoquímicamente, foi diagnóstica.

Qualidade bacteriológica de leite bovino de mistura, in natura e beneficiado, e detecção sorológica de Brucelose em rebanhos da Região Metropolitana de Porto Alegre

O leite é uma fonte excelente de nutrientes tornando-se um meio de cultura ideal para o crescimento de microrganismos potencialmente patogênicos. Estes microrganismos podem comprometer a qualidade e segurança do leite e seus derivados e podem contaminar o homem através da ingestão do leite in natura ou beneficiado contaminados. Para estimar a qualidade microbiológica do leite in natura, foram coletadas 116 amostras em 42 propriedades leiteiras nos municípios de Esteio, Glorinha, Gravataí, Sapucaia do Sul e Viamão, no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. A presença de coliformes fecais e E. coli foi confirmada em 24 isolados, referentes a oito propriedades. Neste trabalho não foi possível detectar a presença de Salmonella sp. As amostras testadas estavam dentro dos padrões exigidos pela legislação para microrganismos mesófilos e psicrotróficos, porém alguns autores citam que contagens acima de 3 log.ufc.ml-1 podem ser prejudiciais ao processamento do produto. Para detecção de anticorpos específicos de Brucella sp. foi utilizado o Teste de Anel de Leite, em 181 amostras (116 amostras coletadas acrescidas de 65 fornecidas pela indústria de beneficiamento), sendo encontradas dez amostras positivas em três propriedades. A qualidade higiênico-sanitária nas propriedades analisadas demostrou ser adequada, porém foi evidenciada a presença microrganismos patogênicos em algumas amostras representando um risco à saúde pública.

Caracterização de genes de quitanases do entomopatógeno e acaricida Metarhizium anisopliae

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.

Comunidades fúngicas endofítica, epifítica e rizosférica em diferentes ecossistemas

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de três ecossistemas sobre, a ocorrência de fungos rizosféricos, endofíticos e epifíticos. As áreas de estudo estão localizadas em uma propriedade rural, situada na cidade de Venâncio Aires, RS. Os fungos endofíticos e epifíticos foram isolados de amostras de raízes de guajuvira, (Patagonula americana L.), coletadas na mata (área 1), de uva-do-japão (Hovenia dulcis Thunb.), na área intermediária (área 2) e de fumo ou de milho, na lavoura (área 3) e, os fungos rizosféricos isolados de solo coletado junto as raízes dos vegetais citados. As amostras foram coletadas nos meses de janeiro, maio, setembro e novembro de 2004 e 2005. Os fungos foram identificados segundo características morfológicas com auxílio de chaves de identificação. As áreas 2 e 3 foram mais similares com relação aos fungos rizosféricos e epifíticos, enquanto, que, as áreas 1 e 2 foram mais similares com relação aos fungos endofíticos. A diversidade dos fungos isolados das três áreas não diferiu ao longo dos dois anos de coleta. A presença de Fusarium spp., em vegetais sem sintomas de doença indica que, as mesmas podem ser raças avirulentas ou patógenos latentes em equilíbrio com o hospedeiro e o ambiente. A presença de fungos antagonistas, principalmente Trichoderma spp. também, são responsáveis por esse equilíbrio, o qual ocorre nas três áreas.

Espécies de Hypholoma (Fr.) P. Kumm. e Stropharia (Fr.) Quél. (Strophariaceae,Agaricales) no Rio Grande do Sul, Brasil

Espécimes de Hypholoma (Fr.) P. Kumm. e Stropharia (Fr.) Quél., ambos pertencentes à família Strophariaceae Singer & A.H. Sm., de ocorrência no estado do Rio Grande do Sul foram estudados. O estudo baseou-se em coletas realizadas pelo autor no período entre março de 2004 e setembro de 2005, e também na revisão do material depositado em herbários do estado, Brasil e exterior. As análises macro e microscópica dos basidiomas foram realizadas segundo metodologia usual para estudo de fungos agaricóides, e todo o material coletado encontra-se preservado no Herbário do Departamento de Botânica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (ICN). Neste estudo, concluiu-se que o gênero Hypholoma está representado no Rio Grande do Sul pelas seguintes espécies: H. aurantiacum (Cooke) Faus, H. ericaeum (Pers.: Fr.) Kühner, e H. subviride (Berk. & M.A. Curtis) Dennis. Da mesma forma, o gênero Stropharia encontra-se representado no estado por: S. acanthocystis Cortez & R.M. Silveira, S. aeruginosa (Curtis: Fr.) Quél., S. alcis var. austrobrasiliensis Cortez & R.M. Silveira, S. apiahyna (Speg.) Cortez & R.M. Silveira, S. araucariae Cortez & R.M. Silveira, S. coronilla (Bull.: Fr.) Quél., S. dorsipora Esteve-Rav. & Barrasa, S. earlei Norvell & Redhead, S. rugosoannulata Farl. ex Murrill e S. semiglobata (Batsch: Fr.) Quél. Dentre estas, Stropharia acanthocystis, S. alcis var. austrobrasiliensis e S. araucariae, são descritos como novos táxons para a ciência; S. apiahyna é proposta como uma nova combinação; S. dorsipora, S. aeruginosa e S. earlei são citadas, respectivamente, pela primeira vez para a América do Sul, Brasil e Rio Grande do Sul. São apresentadas chaves de identificação, descrições e ilustrações macro e microscópicas de todas as espécies estudadas.

Biologia do gene pheA de Mycobacterium tuberculosis : clonagem, seqüenciamento e superexpressão do seu produto - a proteína prefenato desidratase

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

Avaliação da eficiência de co-transformação de soja (Glycine max (L.) Merrill) via bombardeamento de partículas utilizando um gene de seleção e um gene de interesse em plamídeos diferentes

Visando aumentar a resistência a moléstias fúngicas, o presente trabalho teve como objetivo introduzir um gene (chit1) que codifica uma quitinase do fungo Metarhizium anisopliae em cultivares de soja [Glycine max (L.) Merrill]. A co-transformação foi a estratégia escolhida, visando a obtenção de plantas livres de transgenes marcadores na progênie das plantas transformadas. A co-transformação foi realizada via biolística, tendo como tecido-alvo conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5. O plasmídeo pGusHyg, que contém o gene repórter gusA e o gene marcador hpt, foi bombardeado concomitantemente com o plasmídeo pMOG463chit1, que porta o gene chit1. Os conjuntos de embriões bombardeados foram transferidos para meio seletivo contendo higromicina, visando a obtenção de material estavelmente transformado. Os conjuntos embriogênicos higromicina-resistentes foram transferidos seqüencialmente para meios de proliferação D-20 (sem higromicina), maturação e regeneração. No total, foram obtidos 387 e 380 embriões histodiferenciados das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5, respectivamente. Plantas transgênicas adultas e férteis foram regeneradas. Para avaliar a eficiência da estratégia de cotransformação, foram realizadas análises moleculares de embriões histodiferenciados e de plantas regeneradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram o cálculo da taxa de co-transformação de 44% para os embriões histodiferenciados da cultivar MG/BR46 Conquista e de 50% para plantas de IAS-5. Não existem, até o momento, relatos de trabalhos em soja utilizando embriões somáticos globulares em proliferação como alvo para estudos de co-transformação.

O estado da arte das sementes crioulas no Rio Grande do Sul com ênfase em sementes crioulas de melão (Cucumis melo L.)

Este estudo objetivou avaliar o ‘estado da arte’ das sementes ‘crioulas’ no Rio Grande do Sul, possibilitando uma discussão sobre a biodiversidade de plantas cultivadas mantidas por agricultores que ainda utilizam sementes próprias, o diagnóstico sobre as causas da preferência por tais sementes, as dificuldades para sua manutenção e as estratégias desenvolvidas nas diferentes realidades locais para promoção do uso de tais recursos. Para levantar subsídios sobre tecnologia de sementes usadas pelos agricultores, avaliou-se sementes de seis acessos de melões crioulos (Cucumis melo L.) comparados a uma cultivar comercial (T), utilizando-se parâmetros oficiais de tecnologia de sementes. Para o delineamento do “estado da arte” realizou-se um estudo etnográfico baseado em amostragem não probabilística. Entre maio de 2004 e dezembro de 2005 foram contatadas instituições que desenvolvem trabalhos de pesquisa e promoção do uso de sementes tradicionais. A partir da indicação de algumas das instituições, localizou-se agricultores de diferentes regiões como informantes-chave. Como resultados, o estudo diagnosticou 39 espécies vegetais mantidas através de sementes próprias e muitas variedades de plantas consideradas ‘crioulas’, em 13 propriedades amostradas de oito municípios do estado (Porto Alegre, Ipê, Antônio Prado, Palmares do Sul, Santo Antônio do Palma, Bom Retiro, Arroio do Meio e Canguçu), trazendo evidências concretas da agrobiodiversidade mantida pelos ‘agricultores-sementeiros’. As principais vantagens na utilização de sementes próprias, segundo os agricultores, são a adaptabilidade, o sabor e a qualidade das variedades tradicionais, bem como o baixo custo de produção. O desinteresse das novas gerações e a dificuldade em trocar e obter sementes foram registrados como as principais dificuldades enfrentadas. As estratégias locais encontradas para garantir a promoção do uso das sementes crioulas sinalizam criatividade e também a carência de apoio governamental. O estudo com sementes de melão crioulo evidenciou a boa qualidade das sementes amostradas de todos os acessos. As sementes apresentaram em média germinabilidade superior a 80%, além de bons resultados quanto ao vigor. Os testes fitossanitários não indicaram a presença de vírus ou bactérias, mas dois acessos apresentaram contaminação por fungos.