Fire blight (Erwinia amylovora) of rosaceous plants. Pathogen virulence and selection and characterization of biological control agents

El fuego bacteriano, causado por Erwinia amylovora, es una enfermedad muy importante a nivel comercial y económico porque afecta a plantas de la familia de las rosáceas y es especialmente agresiva en manzano (Pyrus malus) y peral (Pyrus communis), así como en plantas ornamentales (Crataegus, Cotoneaster o Pyracantha). Esta enfermedad está distribuida por todo el mundo en zonas climáticas templadas de Amércia del Norte, Nueva Zelanda, Japón, Israel, Turquí y Europa. En España, el fuego bacteriano fue detectado por primera vez en 1995 en el norte del País (Euskadi) y más tarde en nuevos focos aparecidos en otras áreas. La enfermedad puede ser controlada comercialmente mediante la aplicación de pesticidas quimicos (derivados de cobre, antibioticos). Sin embargo, muchos de los productos químicos presentan baja actividad o causan fitotoxicidad, y la estreptomicina, el producto más eficaz, esta prohibido en muchos países, incluyendo España. Por tanto, en ausencia de apropiados agentes químicos, el control biológico se contempla como una buena alternativa. En el presente trabajo, un agente de control biológico, Pseudomonas fluorescens EPS62e, ha sido seleccionada de entre 600 aislados de las especies P. fluorescens y Pantoea agglomerans obtenidos de flores, frutos y hojas de plantas de la familia de las rosáceas durante una prospección llevada a cabo en varias áreas geográficas de España. La cepa ha sido seleccionada por su capacidad de suprimir la infecciones producidas por E. amylovora frutos inmaduros, flores y brotes de peral en condiciones de ambiente controlado, presentando unos niveles de control similares a los obtenidos mediante el control químico usando derivados de cobre o antibióticos. La cepa además ha mostrado la capacidad de colonizar y sobrevivir en flores y heridas producidas en frutos inmaduros en condiciones de ambiento controlado pero también en flores en condiciones de campo. La exclusión de E. amylovora medinate la colonización de la superficie, el consumo de nutrientes, y la interacción entre las células del patógeno y del agente de biocontrol es la principal causa de la inhibición del fuego bacteriano por la cepa EPS62e. Estas características constituyen aspectos interesantes para un desarrollo efectivo de la cepa EPS62e como un agente de biocontrol del fuego bacteriano en condiciones comerciales.

Improvement of strategies for the management of fire blight (Erwinia amylovora). Evaluation and optimization of physical and chemical control methods, and use of decision support systems

El foc bacterià és una malaltia que afecta a plantes de la família de la rosàcies, causada pel bacteri Erwinia amylovora. El seu rang d'hostes inclou arbres fruiters, com la perera, la pomera o el codonyer, i plantes ornamentals de gran interès comercial i econòmic. Actualment, la malaltia s'ha dispersat i es troba àmpliament distribuïda en totes les zones de clima temperat del món. A Espanya, on la malaltia no és endèmica, el foc bacterià es va detectar per primer cop al 1995 al nord del país (Euskadi) i posteriorment, han aparegut varis focus en altres localitzacions, que han estat convenientment eradicats. El control del foc bacterià, és molt poc efectiu en plantes afectades per la malaltia, de manera que es basa en mesures encaminades a evitar la dispersió del patogen, i la introducció de la malaltia en regions no endèmiques. En aquest treball, la termoteràpia ha estat avaluada com a mètode d'eradicació d'E. amylovora de material vegetal de propagació asimptomàtic. S'ha demostrat que la termoteràpia és un mètode viable d'eradicar E. amylovora de material de propagació. Gairebé totes les espècies i varietats de rosàcies mantingudes en condicions d'humitat sobrevivien 7 hores a 45 ºC i més de 3 hores a 50 ºC, mentre que més d'1 hora d'exposició a 50 ºC amb calor seca produïa danys en el material vegetal i reduïa la brotació. Tractaments de 60 min a 45 ºC o 30 min a 50 ºC van ser suficients per reduir la població epífita d'E. amylovora a nivells no detectables (5 x 102 ufc g-1 p.f.) en branques de perera. Els derivats dels fosfonats i el benzotiadiazol són efectius en el control del foc bacterià en perera i pomera, tant en condicions de laboratori, com d'hivernacle i camp. Els inductors de defensa de les plantes redueixen els nivells de malaltia fins al 40-60%. Els intervals de temps mínims per aconseguir el millor control de la malaltia van ser 5 dies pel fosetil-Al, i 7 dies per l'etefon i el benzotiadiazol, i les dosis òptimes pel fosetil-Al i el benzotiadiazol van ser 3.72 g HPO32- L-1 i 150 mg i.a. L-1, respectivament. Es millora l'eficàcia del fosetil-Al i del benzotiadiazol en el control del foc bacterià, quan es combinen amb els antibiòtics a la meitat de la dosi d'aquests últims. Tot i que l'estratègia de barrejar productes és més pràctica i fàcil de dur a terme a camp, que l'estratègia de combinar productes, el millor nivell de control de la malaltia s'aconsegueix amb l'estratègia de combinar productes. Es va analitzar a nivell histològic i ultrastructural l'efecte del benzotiadiazol i dels fosfonats en la interacció Erwinia amylovora-perera. Ni el benzotiadiazol, ni el fosetil-Al, ni l'etefon van induir canvis estructurals en els teixits de perera 7 dies després de la seva aplicació. No obstant, després de la inoculació d'E. amylovora es va observar en plantes tractades amb fosetil-Al i etefon una desorganització estructural cel·lular, mentre que en les plantes tractades amb benzotiadiazol aquestes alteracions tissulars van ser retardades. S'han avaluat dos models (Maryblyt, Cougarblight) en un camp a Espanya afectat per la malaltia, per determinar la precisió de les prediccions. Es van utilitzar dos models per elaborar el mapa de risc, el BRS-Powell combinat i el BIS95 modificat. Els resultats van mostrar dos zones amb elevat i baix risc de la malaltia. Maryblyt i Cougarblight són dos models de fàcil ús, tot i que la seva implementació en programes de maneig de la malaltia requereix que siguin avaluats i validats per un període de temps més llarg i en àrees on la malaltia hi estigui present.

Anàlisi polifàsica de soques de "Pseudomonas fluorescens" potencials agents de biocontrol de malalties de fruiters

Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). S'han descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases. L'objectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques d'un grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat d'establir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, l'objectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores d'aquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu s'ha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. S'han realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant l'ús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en l'ús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, d'enriquiments d'aquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total s'han aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn. S'ha constituït una col·lecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de col·leccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents d'un treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la col·lecció s'hi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes. Les 72 soques s'han caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica s'ha portat a terme mitjançant la identificació a nivell d'espècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant l'ús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); l'eficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies. El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores d'IAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en l'antagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií l'antagonisme. En el cas dels fongs no s'ha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques s'ha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 d'aquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs d'inhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, s'han observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en l'híbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempelts La caracterització genotípica s'ha realitzat mitjançant l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no s'ha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri. Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol s'han caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. S'ha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En l'anàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD s'ha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no s'han pogut relacionar amb l'origen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP. Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica s'ha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions d'Spearman i de freqüències amb variables categòriques). S'ha demostrat la importància de disposar d'una tècnica que permeti depurar una col·lecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no s'ha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades.

Pèptids biarílics a partir de 4-iodofenilalanina o 3-iodotirosina per borilació i reacció de Suzuki-Miyaura en fase sòlida. Avaluació de l'activitat antimicrobiana

En aquesta tesi doctoral es va estudiar la preparació de pèptids biarílics en fase sòlida. En primer lloc, es varen borilar residus de fenilalanina o tirosina presents a la seqüència peptídica a través d’una reacció de Miyaura. A continuació, es varen arilar els boronats resultants a través d’una reacció de Suzuki-Miyaura sota irradiació de microones, utilitzant diversos halurs d’aril i haloaminoàcids. La metodologia trobada es va estendre a la preparació de pèptids biarílics cíclics. Aquesta aproximació presenta l’avantatge d’evitar la síntesi en dissolució i la purificació del boronoaminoàcid. A més, permet la preparació d’una àmplia diversitat de pèptids biarílics a partir d’un únic boronopèptid. L’avaluació de l’activitat biològica dels pèptids sintetitzats va permetre idenficar seqüències actives enfront dels bacteris Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, i Pseudomonas syringae, que són responsables de malalties greus en plantes d’interès econòmic com pereres i pomeres, i que varen resultar ser molt poc tòxics enfront cèl•lules eucariotes.

Synthesis and evaluation of cyclic cationic peptides as antimicrobial agents for use in plant protection

Aquesta tesi doctoral se centra en l'estudi de l'aplicació de pèptids antimicrobians en la lluita contra agents patògens de cultius de plantes d'interès econòmic.L'estratègia sintètica s'ha portat a terme utilitzant metodologies convencionals de síntesi de pèptids en fase sòlida com l'estratègia tridimensional ortogonal Fmoc/tBut/Allyl. Ha calgut fer la recerca de les condicions òptimes per a l'eliminació del grup Allyl i la ciclació. D'entre els pèptids cíclics de 4-10 aminoacids sintetitzats, el decapèptid c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) ha resultat ésser el més efectiu i s'ha pres com a base per al disseny d'una quimioteca de 56 pèptids. Dels resultats obtinguts s'ha sintetitzat una segona quimioteca basada en l'estructura general c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) determinada com la que posseix el millor perfil d'activitat. Els pèptids més efectius obtinguts constituixen els primers exemples de pèptids cíclics actius contra E. amylovora i poden ser considerats com a bons candidats pel desenvolupament d'agents antimicrobians efectius en protecció vegetal.

Development of molecular monitoring methods and assessment of the environmental fate of the biological control agent of fire blight Pseudomonas fluorescens EPS62e

Pseudomonas fluorescens EPS62e es va seleccionar com a agent de biocontrol del foc bacterià per la seva eficàcia en el control de Erwinia amylovora. En aquest treball es van desenvolupar mètodes de traçabilitat que van permetre la seva detecció específica i quantificació. Mitjançant les tècniques RAPD i U-PCR es van obtenir fragments d'amplificació diferencial per EPS62e que es van seqüenciar i caracteritzar com marcadors SCAR per dissenyar una PCR en temps real. La PCR a temps real es va utilitzar simultàniament amb mètodes microbiològics per estudiar l'adaptabilitat epifítica de EPS62e en pomera i perera. L'ús combinat de mètodes microbiològics i moleculars va permetre la identificació de tres estats fisiològics de EPS62e: la colonització activa, l'entrada en un estat de viable però no cultivable, i la mort cel·lular. Aquest treball mostra que EPS62e està ben adaptada a la colonització de flors a camp, encoratjant la seva utilització dins d'una estratègia de control biològic contra el foc bacterià.

Genotypic comparison of Pantoea agglomerans plant and clinical strains

Pantoea agglomerans strains are among the most promising biocontrol agents for a variety of bacterial and fungal plant diseases, particularly fire blight of apple and pear. However, commercial registration of P. agglomerans biocontrol products is hampered because this species is currently listed as a biosafety level 2 (BL2) organism due to clinical reports as an opportunistic human pathogen. This study compares plant-origin and clinical strains in a search for discriminating genotypic/phenotypic markers using multi-locus phylogenetic analysis and fluorescent amplified fragment length polymorphisms (fAFLP) fingerprinting. Results: Majority of the clinical isolates from culture collections were found to be improperly designated as P. agglomerans after sequence analysis. The frequent taxonomic rearrangements underwent by the Enterobacter agglomerans/Erwinia herbicola complex may be a major problem in assessing clinical associations within P. agglomerans. In the P. agglomerans sensu stricto (in the stricter sense) group, there was no discrete clustering of clinical/biocontrol strains and no marker was identified that was uniquely associated to clinical strains. A putative biocontrol-specific fAFLP marker was identified only in biocontrol strains. The partial ORF located in this band corresponded to an ABC transporter that was found in all P. agglomerans strains. Conclusion: Taxonomic mischaracterization was identified as a major problem with P. agglomerans, and current techniques removed a majority of clinical strains from this species. Although clear discrimination between P. agglomerans plant and clinical strains was not obtained with phylogenetic analysis, a single marker characteristic of biocontrol strains was identified which may be of use in strain biosafety determinations. In addition, the lack of Koch's postulate fulfilment, rare retention of clinical strains for subsequent confirmation, and the polymicrobial nature of P. agglomerans clinical reports should be considered in biosafety assessment of beneficial strains in this species

Characterization and mechanism of action of the biological control agent Pantoea agglomerans EPS125

La soca EPS125 ha mostrat ser un efectiu agent de control biològic de diferents patògens fúngics de postcollita en diferents fruits. Degut a la seva elevada eficàcia, es va plantejar desenvolupar aquesta soca comercialment i per aquest motiu en el present treball es plantejà complementar la informació necessària pel seu registre. D'acord amb els resultats obtinguts mitjançant proves fenotípiques i genotípiques, la soca EPS125 queda inclosa dins l'espècie Pantoea agglomerans (Enterobacter agglomerans-Erwinia herbicola). En relació a la utilització de fonts de carboni, en el perfil i contingut d'àcids grassos cel·lulars i en el polimorfisme en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica (MRFLP), la soca EPS125 mostrà trets característics que la diferencien d'altres soques. Els dos marcadors moleculars (125.2 i 125.3) específics per la soca EPS125 dissenyats en el present treball mostraren ser semiespecífics per la seva detecció mitjançant la tècnica PCR i Real Time PCR. Quedant pendent l'anàlisi d'especificitat de l'ús combinat dels dos marcadors moleculars en una reacció PCR multiplex. P. agglomerans EPS125 ha mostrat ser molt efectiva en el control de Penicillium expansum en poma amb una dosi efectiva mitjana de 2.7x105 a 7x105 ufc/ml, i una ratio de 25-101 cèl·lules de la soca EPS125 per inactivar una espora del patogen segons el model de saturació hiperbòlica. Segons les aproximacions fenotípiques i estudis genotípics realitzats, sembla que els mecanismes de biocontrol utilitzats per la soca EPS125 contra P. expansum en poma estan directament relacionats amb la capacitat de formació de biofilm per aquesta soca.