News from compositions, the R package

The R-package “compositions”is a tool for advanced compositional analysis. Its basic functionality has seen some conceptual improvement, containing now some facilities to work with and represent ilr bases built from balances, and an elaborated subsys- tem for dealing with several kinds of irregular data: (rounded or structural) zeroes, incomplete observations and outliers. The general approach to these irregularities is based on subcompositions: for an irregular datum, one can distinguish a “regular” sub- composition (where all parts are actually observed and the datum behaves typically) and a “problematic” subcomposition (with those unobserved, zero or rounded parts, or else where the datum shows an erratic or atypical behaviour). Systematic classification schemes are proposed for both outliers and missing values (including zeros) focusing on the nature of irregularities in the datum subcomposition(s). To compute statistics with values missing at random and structural zeros, a projection approach is implemented: a given datum contributes to the estimation of the desired parameters only on the subcompositon where it was observed. For data sets with values below the detection limit, two different approaches are provided: the well-known imputation technique, and also the projection approach. To compute statistics in the presence of outliers, robust statistics are adapted to the characteristics of compositional data, based on the minimum covariance determinant approach. The outlier classification is based on four different models of outlier occur- rence and Monte-Carlo-based tests for their characterization. Furthermore the package provides special plots helping to understand the nature of outliers in the dataset. Keywords: coda-dendrogram, lost values, MAR, missing data, MCD estimator, robustness, rounded zeros

Estudi d'un receptor quinasa atípic (Mark) i de les proteïnes que interaccionen amb el seu domini intracel·lular. Transducció del senyal i desenvolupament en blat de moro (Zea mays)

Aquesta tesi doctoral s'engloba dins d'un projecte general d'estudi de gens implicats en l'embriogènesi del blat de moro. L'embriogènesi del blat de moro, i en general la de totes les plantes superiors, es dóna en tres etapes: una primera etapa on es diferencien tots els diversos teixits que formaran l'embrió, una segona etapa on l'embrió acumula productes de reserva i un tercer període, la dormància, que finalitza quan les condicions ambientals són les idònies per a la germinació. En el laboratori estàvem interessats, concretament, en l'estudi de gens implicats en la primera etapa morfogenètica, on els diferents teixits i estructures embrionàries queden definides. Per tal d'estudiar gens que s'expressaven en aquest període, una de les estratègies que es va realitzar fou un crivellat diferencial entre teixit embrionari i teixit de planta adulta. D'entre els diferents clons obtinguts, un corresponia a un clon parcial que presentava similitud amb receptors quinasa i que fou objecte d'estudi. A partir d'aquest clon es va obtenir el clon complet i es va anomenar MARK (per Maize Atypical Receptor Kinase). MARK presenta una estructura típica d'un receptor quinasa amb un domini extracel.lular, que conté 6 còpies imperfectes de LRR (Leucine- Rich Repeats), un únic domini transmembrana i un domini quinasa intracel.lular. El domini quinasa de MARK presenta, però, algunes variacions en els residus aminoacídics que es consideren claus per a la funció catalítica dels dominis quinasa. En concret cinc dels aminoàcids considerats essencials per a la fosforilació es troben substituits en el domini quinasa de MARK (DK-MARK). Els experiments de fosforilació in vitro que es van realitzar al laboratori, van mostrar com MARK era incapaç de fosforilar in vitro. Aquesta característica no és, però, exclusiva de MARK. Una búsqueda en les bases de dades ens van permetre identificar altres seqüències que també presentaven els mateixos o altres canvis en aquestes posicions aminoacídiques. En les bases de dades de plantes es van identificar un conjunt de seqüències genòmiques o ESTs amb aquestes característiques i només una d'elles, la proteïna TMKL1 d'Arabidopsis, ha sigut descrita com un receptor quinasa incapaç de fosforilar in vitro. Respecte a la búsqueda de receptors similars a MARK en les bases de dades d'animals, es van identificar també un conjunt de proteïnes que, en alguns casos, s'ha descrit que no tenen activitat quinasa in vivo. Per exemple, un dels casos més ben estudiats és el del receptor erbB3 que forma part de la família de receptors del EGF (Epidermal Growth Factor). Aquesta família de receptors està formada per 4 receptors: erbB1, erbB2, erbB3 i erbB4, dels quals només l'erbB3 no presenta activitat catalítica. S'ha descrit que erbB3 és capaç, tot i no fosforilar in vivo, de participar activament en la transducció del senyal formant heterodímers amb els altres membres de la família. Així, erbB3 és fosforilat pel seu partner i pot iniciar la cascada de transducció del senyal. La participació d'erbB3 en la transducció del senyal és essencial ja que embrions de ratolí knock-out pel gen erbB3 són inviables. Així doncs, el fet que receptors quinasa catalíticament inactius participin en les cascades de transducció del senyal, suggereix l'existència de nous mecanismes d'acció per a la transducció del senyal. Per tant, l'objectiu d'aquest treball fou l'estudi del mecanisme d'acció de MARK mitjançant la caracterització les proteïnes capaces d'interaccionar amb el seu domini quinasa. Per tal d'assolir aquest objectiu, es va realitzar un crivellat de doble-híbrid amb una llibreria de cDNA d'embrions de blat de moro de 7 DAP. D'aquest crivellat es va obtenir un conjunt de possibles clons positius que foren seqüenciats i entre els quals es van escollir per un estudi més detallat aquells que s'havien obtingut més vegades com a clons independents. Aquests clons codificaven per: una SAMDC (S-Adenosil Descarboxilasa), una eIF5 (Eukaryotic translation initiation), una hypothetical protein, una unknown protein, una gamma-adaptina i una MAP4K. Amb aquests 6 clons es van fer estudis in vitro i in vivo per tal de confirmar al seva interacció amb DK-MARK. Els estudis in vivo es van realitzar amb la soca de llevat AH109, una soca més astringent que la utilitzada en el crivellat, ja que presenta tres gens marcadors: Histidina, Adenina i Lacz. Els resultats obtinguts van mostrar que els clons codificants per SAMDC i eIF5 no van créixer en un medi selectiu per His i Ade i, per tant o es tracta de falsos positius del sistema o la seva interacció amb DK-MARK és dèbil. D'altra banda, la resta dels clons analitzats (proteïna hipotètica, una proteïna de funció desconeguda, la gamma-adaptina i una MAP4K) van créixer en medis en absència de Histidina i Adenina. Els assatjos de b-galactosidasa van ser tots positius a excepció de la proteïna hipotètica suggerint que potser aquesta interacció sigui més feble. D'altra banda també es van realitzar estudis in vitro amb la tècnica del pull-down. Els resultats obtinguts amb aquesta tècnica van recolzar els obtinguts en cèl.lules de llevat, ja que tots els clons analitzats a excepció dels codificants per SAMDC i eIF5 van donar un resultat d'interacció amb KD-MARK in vitro positiu. Davant aquests resultats ens vam centrar en l'estudi de la proteïna similar a MAP4K, doncs algunes proteïnes de la seva família s'han relacionat amb receptors de membrana. Els clons que es va obtenir del crivellat codificaven per una proteïna similar amb el domini C-terminal a les proteïnes BnMAP4Ka1 i a2 de Brassica napus. Aquestes proteïnes presenten una forta similitud de seqüència amb proteïnes de la família GCK/SPS1 que formen part d'un grup particular de MAPK relacionades amb la proteïna Ste20 (sterile 20 protein) de llevat. Ste20p activa la MAP3K de llevat Ste11 directament per fosforilació, transduint d'aquesta manera el senyal del receptor de feromones de creuament de les cèl.lules de llevat i es pot, doncs, considerar com una proteïna del tipus MAP4K (mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase). En els darrers anys, s'han identificat un gran nombre de proteïnes similars a Ste20: fins a una trentena en mamífers, en Drosophila, en Caenorhabditis elegans i en altres organismes. Segons la seva estructura aminoacídica, la família Ste20 s'ha classificat en dues subfamílies: les proteïnes STE20/PAK (p21-activated kinases) i la subfamília GCK/SPS1 (germinal center kinases). Les dues subfamílies estan formades per proteïnes que contenen un domini quinasa i un domini regulador, però, mentre que les proteïnes PAK presenten el domini quinasa en la part C-terminal, les GCKs el presenten en la regió N terminal. Les proteïnes GCK presenten una elevada diversitat estructural en el domini regulador permetent la seva classificació en 6 subfamílies. Mitjançant la tècnica del RACE es va obtenir el clon de cDNA complet que es va anomenar MIK (MARK Interacting Kinase). Amb la tècnica del Southern blot es va poder determinar que el gen MIK és un gen de còpia única en el genoma de blat de moro. Per tal d'analitzar la possible interacció entre DK-MARK i MIK, es va estudiar tant el patró d'expressió d'ambdós gens com el seu patró d'acumulació d'ambdues proteïnes durant l'embriogènesi del blat de moro. El patró d'expressió, analitzat per Northen blot va mostrar uns patrons coincidents al llarg de l'embriogènesi des del seu inici fins als 20 DAP amb una acumulació màxima de mRNA en embrions de 15 DAP. D'altra banda per tal d'estudiar el patró d'acumulació de la proteïna MIK així com per comparar-lo amb el de MARK, es van realitzar estudis de Westerns blot. Els resultats també van mostrar una coincidència en el temps de l'acumulació de les proteïnes MARK i MIK durant l'embriogènesi de blat de moro amb una major acumulació en embrions de 15 i 20 DAP. Es van dur a terme també estudis d'immunolocalitzacions sobre embrions de blat de moro de 15 DAP per tal d'estudiar en quins teixits s'acumulaven ambdues proteïnes. Les immunolocalitzacions van mostrar una major acumulació tant de MARK com de MIK en les zones meristemàtiques i en el teixit vascular sobretot del coleòptil on s'aprecia una forta co-localització de MARK i MIK. Totes aquestes dades són compatibles, doncs, amb una possible interacció de les proteïnes MARK i MIK, tot i que no la demostren. Per tal de demostrar la interacció es van realitzar experiments d'immunoprecipitació in vivo a partir d'extractes d'embrions. Malauradament, els resultats no són clars i en aquests moments en el laboratori s'estan posant a punt aquests experiments. També es van realitzar estudis comparatius de seqüència amb diferents proteïnes de la família GCK, mostrant una major similitud amb les proteïnes de la subfamília GCK-III. La subfamília GCK-III ha estat molt poc estudiada i en formen part un conjunt de proteïnes amb funcions molt diverses des de l'apoptosi, la citoquinesi o l'anòxia cel.lular. Per tant, la similitud de seqüència possiblement fa referència a una conservació en el mecanisme d'acció més que no pas a una conservació funcional. La possible interacció de MARK amb el domini C-terminal de MIK (el domini regulador) podria activar aquesta última iniciant una cascada de transducció del senyal en un model en el que una proteïna del tipus GCK-III faria de lligam directa entre un receptor de membrana i una cascada de senyalització intracel.lular. Aquest tipus de lligam entre un recepctor de membrana i mòduls intracel.lulars de senyalització s'ha descrit per a altres proteïnes GCK, si bé no directament sinó a través de proteïnes adaptadores. D'altra banda, la interacció directa de MARK, un receptor quinasa atípic que no té activitat catalítica, amb MIK suggereix un mecanisme on receptors atípics podrien interaccionar en la transducció del senyal activant la via de les MAPK.

Estudi estructural, ultraestructural i histoquímic de les glàndules sexuals accessòries del mascle reproductor porcí (Sus domesticus)

El present treball analitza al microscopi òptic i al microscopi electrònic de transmissió les glàndules sexuals accessòries de Sus domesticus (raça Landrace - varietat anglesa) a partir de mascles reproductors porcins adults i sans. Un millor coneixement dels patrons estructural i ultraestructural normals de las glàndules sexuals accessòries permetrà diagnosticar amb facilitat quina ha estat l'estructura o la funció glandular afectada en mascles en els que s'observa una disminució de la qualitat del semen. Per altra banda, els estudis anatomopatològics s'han de complementar amb tècniques histoquímiques que generalment permeten confirmar o excloure un diagnòstic histopatològic previ. Les glàndules sexuals accessòries del mascle reproductor porcí estan molt desenvolupades i inclouen les glàndules vesiculars, la pròstata i les glàndules bulbouretrals. L'epiteli secretor de les glàndules vesiculars està format per cèl·lules columnars, cèl·lules basals i mastòcits. Les cèl·lules columnars es caracteritzen per presentar tres morfologies diferents que es consideren diferents estadis d'un mateix tipus cel·lular: les cèl·lules principals, les cèl·lules clares i les cèl·lules denses. Les cèl·lules principals secreten activament glicoproteïnes N- i O- glicosilades amb residus d'α-L-fucosa, α(16)fucosa, α-D-mannosa, α-D-glucosa, α- i -D-N-acetilgalactosamina, -D-galactosa-(13)-D-N-acetilgalactosamina, α-D-galactosa, galactosa-(14)-N-acetilglucosamina, D-N-acetilglucosamina i àcid neuramínic. Aquestes glicoproteïnes afavoreixen les interaccions entre l'espermatozoide i l'occit i regulen la permeabilitat de la membrana espermàtica. La pròstata està formada per dues porcions glandulars, el cos de la pròstata (BP) y la pròstata disseminada (DP), entre las quals s'observen diferencies estructurals, ultraestructurals, histoquímiques i funcionals. En ambdues porcions, l'epiteli secretor està constituït per cèl·lules columnars principals, denses i cèl·lules basals, i també per cèl·lules cúbiques en el BP i per cèl·lules mucoses en la DP. En ambdues porcions glandulars, se sintetitzen i secreten N- i O- glicoproteïnes neutres i àcides. Aquestes glicoproteïnes s'alliberen mitjançant un mecanisme regulat en el BP y mitjançant un mecanisme regulat i un constitutiu en la DP. Les glucoproteïnes luminals del BP contenen residus de fucosa, mannosa, α- i -D-N-acetilgalactosamina, galactosa-(14)-N-acetilglucosamina, D-N-acetilglucosamina i àcid neuramínic. En la DP les glicoproteïnes presenten, a més, -D-galactosa-(13)-D-N-acetilgalactosamina i α-D-galactosa. Les glicoproteïnes secretades en el BP i en la DP per via regulada, participen en el control de l'estabilitat del plasmalemma dels espermatozoides, eviten la resposta immune uterina i l'aglutinació dels espermatozoides i afavoreixen la seva motilitat progressiva. Les glicoproteïnes secretades per via constitutiva en la DP protegeixen i lubrifiquen la uretra pelviana. L'epiteli secretor de les glàndules bulbouretrals està format per cèl·lules piramidals principals i denses. Les cèl·lules principals sintetitzen i secreten principalment O-glicoproteïnes àcides carboxilades i sulfatades amb residus glicosídics d'N-acetilgalactosamina, -D-galactosa-(13)-D-N-acetilgalactosamina, α-D-galactosa, D-N-acetilglucosamina i àcid neuramínic. Aquests residus proporcionen resistència a la proteolisi a les O-glicoproteïnes secretades, les quals participen en la lubrificació y protecció de l'epiteli, i intervenen en el control de la permeabilitat del plasmalemma dels espermatozoides i en el transport d'ions al seu través.

Mecanismes cel·lulars en la curació de ferides a Hirudo medicinalis

S'estudia la histologia normal de la paret corporal d'Hirudo medicinalis i els canvis morfogenètics que es donen durant el procés de cicatrització de ferides per incisió, cauterització i nitrat de plata. El procés de curació de ferides a Hirudo medicinalis consta d'una fase de formació d'un tap cel·lular, el pseudoblastema, d'un procés de reepitelització i de la formació d'un teixit cicatricial, com en els altres hirudinis estudiats (Myers, 1935; LeGore i Sparks, 1971; Cornec, 1984). Hem observat també el fenomen de la contracció de la ferida que permet l'acostament dels marges de la ferida. Formació i evolució del pseudoblastema El pseudoblastema, a diferència d'altres espècies estudiades, està format per un sol tipus cel·lular: les cèl·lules vasocentrals, provinents del teixit vasofibrós, una especialització del teixit connectiu. Aquestes cèl·lules estan capacitades per realitzar les diferents funcions que en espècies rincobdèl·lides realitzen diferents tipus cel·lulars. En concret: taponament de la ferida a través de la formació del pseudoblastema, fagocitosi dels teixits necrosats i regeneració, almenys d'una part, de la matriu connectiva cicatricial. També són responsables de la contracció de la ferida. Les cèl·lules vasocentrals en el seu estadi de repòs es troben en el teixit vasofibrós formant agrupacions coherents, però sense mostrar unions intercel·lulars especialitzades visibles en ME. La coherència del grup queda assegurada per les interdigitacions entre les cèl·lules vasocentrals i probablement per unions tipus adherens o especialitzades. Les unions amb la matriu són de tipus adherens. Aquestes cèl·lules vasocentrals presenten feixos de filaments d'actina força conspicus. En produir-se una ferida les cèl·lules vasocentrals s'activen, desconnecten les unions intercel·lulars i amb la matriu i migren cap a la zona afectada, on s'acumulen. El pseudoblastema actua com un tap cel·lular que funciona de forma eficient per tancar la ferida en un plaç de temps relativament curt. El pseudoblastema forma un teixit coherent amb unions intercel·lulars tipus adherens, caracteritzades per material electrodens en la cara intracitoplasmàtica, feixos de filaments d'actina que hi convergeixen i espais intercel·lulars petits, de 17-20 mm, atravessats per petites fibril·les. Un cop finalitzat el procés de reepitelització, es produeix una contracció de la ferida. Es produeix per la retracció del pseudoblastema cap a l'interior de l'animal. El pseudoblastema disminueix la seva amplària i arrossega els teixits contigus provocant un tancament. La força motriu que provoca la retracció i l'arrossegament dels teixits vindria donada per la presència dels filaments d'actina a les cèl·lules del pseudoblastema, els quals durant aquesta fase es tornen mes conspicus. La presència d'unions intercel·lulars especialitzades característiques de la fase de contracció, està relacionada amb la transmissió de la força de tensió. Aquestes unions connecten els feixos de filaments d'actina de les cèl·lules amb la matriu o d'una cèl·lula a altre a través d'espais intercel·lulars força amples en els que s'observa material electrodens. Reepitelització L'epitelització s'inicia quan el pseudoblastema està consolidat i segueix el mateix patró que la reepitelització de ferides en epitelis monoestratificats de vertebrats (Stem i DePalma, 1983, és a dir, per migració de tota la capa per sobre del substrat, segons l'anomenat model de lliscament. Les glàndules unicel·lulars mucoses del tegument degeneren abans de produir-se la migració epitelial i posteriorment, un cop consolidat l'epiteli a sobre de la ferida, es diferencien a partir de les cèl·lules epitelials. Durant l'epitelització es produeixen canvis importants en el citosquelet i les unions basals de les cèl·lules epitelials. En canvi, el complex d'unió lateral es manté durant tot el procés. En iniciar-se la migració els tonofilaments es desconnecten dels hemidesmosomes cuticulars i dèrmics i es reagrupen al voltant del nucli, a la vegada que els hemidesmosomes dèrmics es desconnecten de la làmina basal. Un cop acabada la migració, les cèl·lules epitelials estableixen unions basals amb les cèl·lules del pseudoblastema. Aquestes unions no són hemidesmosomes sinó que presenten el mateix aspecte que les unions intercel·lulars del pseudoblastema. Els hemidesmosomes no es tornen a formar fins que les cèl·lules epitelials han restablert la membrana basal. La regeneració de la membrana basal no s'inicia fins que no s'ha començat a regenerar matriu connectiva a la zona cicatricial. Regeneració de la cicatriu Al mateix temps que es dona el fenomen de contracció, s'observa regeneració de la matriu connectiva entre les cèl·lules del pseudoblastema. Aquestes cèl·lules són responsables almenys del recobriment fibrós que presenten en aquest estadi, durant el qual mostren sàculs del reticle endoplasmàtic rugós molt dilatats, característics de cèl·lules que secreten constituents de la matriu. A més, s'observa infiltració de matriu connectiva i processos citoplasmàtics dels fibròcits en els marges del pseudoblastema. En la matriu del teixit connectiu normal s'observen fibres que estan constituïdes per un còrtex de fibril·les col·làgenes organitzades al voltant dels processos citoplasmàtics dels fibròcits. Les fibres del teixit connectiu peridigestiu, d'uns 1,2-1,9 mm de diàmetre, presenten el còrtex prim, amb les fibril·les organitzades paral·lelament a l'eix de la fibra. En canvi, les fibres de la dermis i teixit connectiu intramuscular, d'uns 2,5-7,1 mm de diàmetre, tenen el còrtex gruixut, amb fibril·les que s'organitzen paral·lelament en la zona proximal a la medul·la i de forma desorganitzada en la part més distal. Als 8 mesos la cicatriu encara és detectable. La matriu cicatricial presenta fibres connectives del tipus prim i força material fibril·lar desorganitzat disposat laxament. S'observa colonització per part de fibròcits, cromatòfors, petites fibres musculars i nervis.