Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discoideum

A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising α-helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.

Einfluss der Mensch-Tier-Beziehung auf die Eutergesundheit von Milchkühen

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Mensch-Tier-Beziehung sowie verschiedener Managementmaßnahmen auf die Eutergesundheit der Milchviehherden von 46 Schweizer Betrieben, die am Bestandsbetreuungsprogramm mit Schwerpunkt Eutergesundheit „pro-Q“ teilnahmen, untersucht. Für die Charakterisierung der Mensch-Tier-Beziehung wurden Melkereinstellungen mittels Fragebögen, Melker- und Kuhverhalten beim Melken und die Ausweichdistanz der Kühe im Laufstall erfasst. Die Darstellung der Eutergesundheit erfolgte anhand der Milchleistungsprüfungsergebnisse der Betriebe über ein Jahr als durchschnittlicher Somatic Cell Score (SCS) und als Neuinfektionsrate. Zudem wurde über zytobakteriologische Analysen von Viertelgemelksproben aller laktierenden Kühe der Herden zeitnah am Untersuchungstag der Mensch-Tier-Beziehungserfassung der Herdenanteil zellzahlerhöhter Viertel (>100.000 Zellen /ml), der Anteil Mastitisviertel (>100.000 Zellen /ml und bakteriologisch positiv), und der Anteil Viertel mit Staphylococcus aureus-Befund errechnet. Hinsichtlich des Managements wurden 35 Faktoren, generiert aus Fragebögen und Stall- und Melkarbeitsbewertungen, in die Auswertungen einbezogen. Nach einer univariablen Vorauswahl von Faktoren wurden multivariate Regressionsmodelle und ein Multilevel-Regressionsmodell zu Analysen der Einflüsse auf die Ausweichdistanz und die fünf Eutergesundheitsvariablen berechnet. Als signifikant mit einer geringeren Ausweichdistanz der Kühe assoziierte Faktoren zeigten sich (1) die positive Einstellung der Melker zur Bedeutung des Kontaktes zum Tier, (2) die Bedingung, dass alle Melker alle Kühe kannten, (3) die Selektion auf Umgänglichkeit als Zuchtstrategie, (4) eine großzügige Dimensionierung der Liegefläche und (5) eine längere allgemeine Kontaktzeit zum Tier innerhalb der Arbeitsroutine. Einflüsse auf die Eutergesundheitsvariablen zeigten verschiedene Kombinationen von Faktoren: Unter den Mensch-Tier-Beziehungsvariablen stellte sich der Anteil positiver Interaktionen des Melkers mit den Kühen beim Melken als häufigster Prädiktor für eine bessere Eutergesundheit (SCS sowie Anteil zellzahlerhöhter und Mastitisviertel) heraus. Zudem zeigte eine geringere Ausweichdistanz signifikante Zusammenhänge mit einem geringeren Anteil zellzahlerhöhter Viertel, aber auch, entgegen der Arbeitshypothese, mit einem höheren Anteil Viertel mit Staphylococcus aureus-Befund. Ausschlagen der Kühe im Melkstand trat signifikant häufiger in Betrieben mit einer höheren Neuinfektionsrate auf. Eine längere Kontaktzeit pro Tier und Tag in der Arbeitsroutine war mit einem geringeren Anteil von Vierteln mit Staphylococcus aureus-Befund verbunden. Darüber hinaus zeigten sich folgende Tier- und Managementfaktoren als signifikante Risikofaktoren für die Eutergesundheit: (1) Rasse, insbesondere Holstein, für SCS, Neuinfektionsrate und Anteil Mastitisviertel, (2) Alter der Kühe anhand der Laktationsnummern für SCS und Anteil Mastitisviertel, (3) Anzahl Neuinfektionen einer Kuh für den SCS, (4) Luftsaugen beim Melkzeug-Anhängen und (5) eine fehlende Separierung kranker Kühe für die Neuinfektionsrate, (6) eine großzügig dimensionierte Liegefläche für den Anteil Mastitisviertel, (7) das aktive Treiben trächtiger Rinder durch den Melkstand zur Gewöhnung und (8) die Verwendung von demselben Euterreinigungsmaterial für mehrere Kühe für den Anteil Viertel mit Staphylococcus aureus-Befund. Die Mensch-Tier-Beziehung ist somit relevant für die Eutergesundheit, insbesondere für die Höhe der Zellzahlen, während das Risiko für Neuinfektionen, die zu Euterentzündungen führen, vornehmlich durch Managementfaktoren beeinflusst wird. Folglich wäre es sinnvoll, den Themenkomplex der Mensch-Tier-Beziehung zukünftig vermehrt in die Beratung von Bestandesbetreuungsprogrammen einzubeziehen.

Ermittlung geeigneter Methoden zur Differenzierung und Qualitätsbeurteilung unterschiedlicher Milchqualitäten aus verschiedenen on-farm-Experimenten

Zusammenfassung: Ziel der Arbeit war ein Methodenvergleich zur Beurteilung der Milchqualität unterschiedlicher Herkünfte. Am Beispiel von Milchproben aus unterschiedlicher Fütterung sowie an Milchproben von enthornten bzw. horntragenden Kühen wurde geprüft, welche der angewendeten Methoden geeignet ist, die Vergleichsproben zu unterscheiden (Differenzierungsfähigkeit der Methoden) und inwieweit eine Qualitätsbeurteilung möglich ist (hinsichtlich Milchleistung, Fett-, Eiweiß-, Lactose- (=F,E,L), Harnstoff-gehalt und Zellzahl (=SCC), Säuerungseigenschaften (=SE), Fettsäuremuster (=FS-Muster), Protein- und Metabolit-Zusammensetzung (=Pr&M), Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie-Eigenschaften (=FAS) und Steigbild-Merkmalen). Zusätzlich wurde vorab die Steigbildmethode (=SB-M) für das Produkt Rohmilch standardisiert und charakterisiert, um die Reproduzierbarkei der Ergebnisse sicherzustellen. Die Untersuchungen zur SB-M zeigten, dass es Faktoren gibt, die einen deutlichen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung aufweisen. Dazu gehören laborseitig die Klimabedingungen in der Kammer, die Verdünnungsstufe der Probe, die Standzeiten der Vorverdünnung (Reaktionen mit der Luft, Alterung usw.), und tagesspezifisch auftretende Effekte, deren Ursache unbekannt ist. Probenseitig sind sehr starke tierindividuelle Effekte auf die Bildmerkmals-Ausprägung festzustellen, die unabhängig von Fütterung, Alter, Laktationsstadium und Genetik auftreten, aber auch Fütterungsbedingungen der Kühe lassen sich in der Bildmerkmals-Ausprägung wiederfinden. Die Art der Bildauswertung und die dabei berücksichtigten Bildmerkmale ist von großer Bedeutung für das Ergebnis. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten 46 Probenpaare (aus den Fütterungsvergleichen (=FV) und zur Thematik der Hörner) konnten in 91% der Fälle korrekt gruppiert werden. Die Unterschiede konnten benannt werden. Drei FV wurden auf drei biologisch-dynamischen Höfen unter Praxis-Bedingungen durchgeführt (on-farm-Experimente). Es wurden jeweils zwei vergleichbare Gruppen à mindestens 11 Kühen gebildet, die im Cross-Over-Design gefüttert wurden, mit Probennahme am 14. und 21. Tag je Periode. Es wurden folgende FV untersucht: A: Wiesenheu vs. Kleegrasheu (=KG-Heu), B: Futterrüben (=FuR) vs. Weizen (Ergänzung zu Luzernegrasheu ad lib.), C: Grassilage vs. Grasheu. Bei Versuch A sind die Futtereffekte am deutlichsten, Gruppeneffekte sind gering. Die Milch der Wiesenheu-Variante hat weniger CLA’s und n3- FS und mehr mittellangkettige FS (MCT-FS), das Pr&M-Muster weist auf „Gewebereifung und Ausdifferenzierung“ vs. bei KG-Heu „Nährstoff-fülle, Wachstum und Substanz-Einlagerung und die SB zeigen fein ausdifferenzierte Bildmerkmale. Bei Versuch B sind die Futtereffekte ähnlich groß wie die Gruppeneffekte. Bei vergleichbarer Milchleistung weist die Milch der FuR-Variante höhere F- und E-Gehalte auf, sie säuert schneller und mehr, das FS-Muster weist auf eine „intensive“ Fütterung mit vermehrt MCT- FS, und die Pr&M-Untersuchungen charakterisieren sie mit „Eisentransport und Fetttröpfchenbildung“ vs. bei Weizen „mehr Abwehr-, Regulations- und Transportfunktion“ /. „mehr Lipidsynthese“. Die SB charakterisieren mit „große, kräftige Formen, verwaschen“ vs. „kleine, ausdifferenzierte Bildmerkmal“ für FuR vs. Weizen. Die FAS charakterisiert sie mit „Saftfutter-typisch“ vs. „Samentypisch“. Versuch C weist die geringsten Futtereffekt auf, und deutliche Gruppen- und Zeiteffekte. Milchleistung und F,E,L-Gehalte zeigen keinen Futtereffekt. Die Milch der Heu-Variante säuert schneller, und sie weist mehr SCT und MCT- FS auf. Pr&M-Untersuchungen wurden nicht durchgeführt. Die SB charakterisieren bei Heumilch mit „fein, zart, durchgestaltet, hell“, bei Silagemilch mit „kräftig, wäßrig-verwaschen, dunkler“. Die FAS kann keine konsistenten Unterschiede ermitteln. Der Horn-Einfluß auf die Milchprobe wurde an 34 Probenpaaren untersucht. Von 11 Höfen wurden je zwei möglichst vergleichbare Gruppen zusammengestellt, die sich nur im Faktor „Horn“ unterscheiden, und im wöchentlichen Abstand drei mal beprobt. F,E,L, SCC und SE der Proben sowie die FAS-Messungen weisen keine konsistenten signifikanten Unterschiede zwischen den Horn-Varianten auf. Pr&M weisen bei den untersuchten Proben (von zwei Höfen) auf Horneffekte hin: bei Eh eine Erhöhung von Immun-Abwehr-Funktionen, sowie einer Abnahme phosphorylierter C3- und C6-Metabolite und Beta-Lactoglobulin. Mit den SB ließen sich für die gewählten Merkmale (S-Größe und g.B.-Intensität) keine Horneffekte feststellen. FS, Pr&M-Muster sowie Harnstoffgehalt und SB (und z.T. Milchleistung) zeigten je FV ähnliche Effekt-Intensitäten für Futter-, Gruppen- und Zeiteffekte, und konnten die Cross-Over-Effekte gut wiedergeben. F- und E-Gehalte konnten neben tierindividuellen Effekten nur in FV B auch Futtereffekte aufzeigen. In FV C zeigten die SE der Proben den deutlichsten Futtereffekt, die anderen Methoden zeigten hier vorrangig Gruppen-Effekte, gefolgt von Futter- und Zeiteffekten. Die FAS zeigte den SB vergleichbare Ergebnisse, jedoch weniger sensibel reagierend. Die Interpretation von Qualitätsaspekten war bei konsistent differenzierbaren Proben (FV A, B, C) am fundiertesten mit Hilfe der FS möglich, da über die Synthese von FS und beeinflussende Faktoren schon vielfältige Erkenntnisse vorliegen. Das Pr&M-Muster war nach einer weiteren Methodenentwicklung bei der Deutung von Stoffwechselprozessen sehr hilfreich. Die FAS konnte z.T. eine zu der Fütterungsvariante passende Charakterisierung liefern. Für die SB-M fehlt es noch an Referenzmaterial, um Angaben zu Qualitätsaspekten zu machen, wenngleich Probenunterschiede aufgezeigt und Proben-Eigenschaften charakterisiert werden konnten.