Funktion und Biogenese kleiner RNAs in Dictyostelium discoideum

RNA mediated gene silencing pathways are highly conserved among eukaryotes and they have been well investigated in animals and in plants. Longer dsRNA molecules trigger the silencing pathways: RNase III proteins and their dsRNA binding protein (dsRBP) partners recognize those molecules as a substrate and process 21 nucleotide long microRNAs (miRNAs) or small interfering RNAs (siRNAs). Some organisms encode RNA dependent RNA polymerases (RdRPs), which are able to expand the pool of existing siRNAs. Argonaute proteins are able to bind small regulatory RNAs and are subsequently recruited to target mRNAs by base complementary. This leads in turn to transcriptional or posttranscriptional silencing of respective genes. The Dictyostelium discoideum genome encodes two Dicer homologues (DrnA and DrnB), five Argonaute proteins (AgnA to AgnE) and three RdRPs (RrpA to RrpC). In addition, the amoeba is known to express miRNAs and siRNAs, while the latter derive mainly from the DIRS-1 retrotransposon. One part of this work focused on the miRNA biogenesis pathway of D. discoideum. It was shown that the dsRNA binding protein RbdB is a necessary component for miRNA processing in the amoeba. There were no mature miRNAs detectable by Northern blot analysis in rbdB- strains, which is also true for drnB mutants. Moreover, primary miRNA-transcripts (pri-miRNAs) accumulated in rbdB- and drnB- strains. Fluorescence microscopy studies showed a nuclear localization of RbdB. RbdB accumulated in distinct perinucleolar foci. These were reminiscent of plant dicing bodies that contain essential protein components for miRNA processing. It is well known that RNase III enzymes and dsRBPs work together during miRNA processing in higher eukaryotes. This work demonstrated that the same is true for members of the amoebozoa supergroup. In Arabidopsis the nuclear zinc finger protein Serrate (SE) is also necessary for miRNA processing. The D. discoideum homologue SrtA, however, is not relevant which has been shown by the analysis of the respective knockdown strain. MiRNAs are known to be differentially expressed in several RNAi knockout strains. The accumulation of miRNAs in agnA- strains and a strong decrease in rbdB- strains were criteria that could thus be successfully used (among others) to identify and validate new miRNAs candidates by Illumina®-RNA sequencing. In another part of this study, the silencing and amplification of the DIRS-1 retrotransposons was analyzed in more detail. It was already known that DIRS-1 transcripts and extrachromosomal DIRS-1 DNA molecules accumulated in agnA- strains. This phenotype was correlated with the loss of endogenous DIRS-1 siRNAs in the knockout strain. By deep sequencing analysis of small RNAs from the AX2 wild type and the agnA- strain, the strong decrease of endogenous DIRS-1 siRNAs in the mutant strain (accounting for 70 %) could be confirmed. Further analysis of the data revealed an unequal distribution of DIRS-1 derived siRNAs along the retroelement in the wild type strain, since only very few of them matched the inverted terminal repeats (ITRs) and the 5’- half of the first open reading frame (ORF). Besides, sense and antisense siRNAs were asymmetrically distributed, as well. By using different reporter constructs it was shown indirectly that AgnA is necessary for the RrpC mediated production of secondary DIRS-1 siRNAs. These analyses also demonstrated an amplification of siRNAs in 5’- and in 3’-direction. Further analysis of the agnA- strain revealed that not only DIRS-1 sense transcripts but also ORF2 and ORF3 encoded proteins were enriched. In contrast, the ORF1 encoded protein GAG was equally expressed in the mutant and the wild type. This might reflect the unequal distribution of endogenous DIRS-1 siRNAs along the retrotransposon. Southern Blot and PCR-analyses showed that extrachromosomal DIRS-1 DNA molecules are present in the cytoplasm of angA- strains and that they are complementary to sense transcripts of intact DIRS-1 elements. Thus, the extrachromosomal DIRS-1 intermediates are likely incomplete cDNA molecules generated by the DIRS-1 encoded reverse transcriptase. One could hypothesize that virus like particles (VLPs) are the places of DIRS-1 cDNA synthesis. At least, DIRS-1 GAG proteins interact and fluorescence microscopy studies showed that they localize in distinct cytoplasmic foci which accumulate in close proximity to the nuclei.

Cognitive Component Skills of Reading Comprehension in Developing Readers

Die Fähigkeit, geschriebene Texte zu verstehen, d.h. eine kohärente mentale Repräsentation von Textinhalten zu erstellen, ist eine notwendige Voraussetzung für eine erfolgreiche schulische und außerschulische Entwicklung. Es ist daher ein zentrales Anliegen des Bildungssystems Leseschwierigkeiten frühzeitig zu diagnostizieren und mithilfe zielgerichteter Interventionsprogramme zu fördern. Dies erfordert ein umfassendes Wissen über die kognitiven Teilprozesse, die dem Leseverstehen zugrunde liegen, ihre Zusammenhänge und ihre Entwicklung. Die vorliegende Dissertation soll zu einem umfassenden Verständnis über das Leseverstehen beitragen, indem sie eine Auswahl offener Fragestellungen experimentell untersucht. Studie 1 untersucht inwieweit phonologische Rekodier- und orthographische Dekodierfertigkeiten zum Satz- und Textverstehen beitragen und wie sich beide Fertigkeiten bei deutschen Grundschüler(inne)n von der 2. bis zur 4. Klasse entwickeln. Die Ergebnisse legen nahe, dass beide Fertigkeiten signifikante und eigenständige Beiträge zum Leseverstehen leisten und dass sich ihr relativer Beitrag über die Klassenstufen hinweg nicht verändert. Darüber hinaus zeigt sich, dass bereits deutsche Zweitklässler(innen) den Großteil geschriebener Wörter in altersgerechten Texten über orthographische Vergleichsprozesse erkennen. Nichtsdestotrotz nutzen deutsche Grundschulkinder offenbar kontinuierlich phonologische Informationen, um die visuelle Worterkennung zu optimieren. Studie 2 erweitert die bisherige empirische Forschung zu einem der bekanntesten Modelle des Leseverstehens—der Simple View of Reading (SVR, Gough & Tunmer, 1986). Die Studie überprüft die SVR (Reading comprehension = Decoding x Comprehension) mithilfe optimierter und methodisch stringenter Maße der Modellkonstituenten und überprüft ihre Generalisierbarkeit für deutsche Dritt- und Viertklässler(innen). Studie 2 zeigt, dass die SVR einer methodisch stringenten Überprüfung nicht standhält und nicht ohne Weiteres auf deutsche Dritt- und Viertklässler(innen) generalisiert werden kann. Es wurden nur schwache Belege für eine multiplikative Verknüpfung von Dekodier- (D) und Hörverstehensfertigkeiten (C) gefunden. Der Umstand, dass ein beachtlicher Teil der Varianz im Leseverstehen (R) nicht durch D und C aufgeklärt werden konnte, deutet darauf hin, dass das Modell nicht vollständig ist und ggf. durch weitere Komponenten ergänzt werden muss. Studie 3 untersucht die Verarbeitung positiv-kausaler und negativ-kausaler Kohärenzrelationen bei deutschen Erst- bis Viertklässler(inne)n und Erwachsenen im Lese- und Hörverstehen. In Übereinstimmung mit dem Cumulative Cognitive Complexity-Ansatz (Evers-Vermeul & Sanders, 2009; Spooren & Sanders, 2008) zeigt Studie 3, dass die Verarbeitung negativ-kausaler Kohärenzrelationen und Konnektoren kognitiv aufwändiger ist als die Verarbeitung positiv-kausaler Relationen. Darüber hinaus entwickelt sich das Verstehen beider Kohärenzrelationen noch über die Grundschulzeit hinweg und ist für negativ-kausale Relationen am Ende der vierten Klasse noch nicht abgeschlossen. Studie 4 zeigt und diskutiert die Nützlichkeit prozess-orientierter Lesetests wie ProDi- L (Richter et al., in press), die individuelle Unterschiede in den kognitiven Teilfertigkeiten des Leseverstehens selektiv erfassen. Hierzu wird exemplarisch die Konstruktvalidität des ProDi-L-Subtests ‚Syntaktische Integration’ nachgewiesen. Mittels explanatorischer Item- Repsonse-Modelle wird gezeigt, dass der Test Fertigkeiten syntaktischer Integration separat erfasst und Kinder mit defizitären syntaktischen Fertigkeiten identifizieren kann. Die berichteten Befunde tragen zu einem umfassenden Verständnis der kognitiven Teilfertigkeiten des Leseverstehens bei, das für eine optimale Gestaltung des Leseunterrichts, für das Erstellen von Lernmaterialien, Leseinstruktionen und Lehrbüchern unerlässlich ist. Darüber hinaus stellt es die Grundlage für eine sinnvolle Diagnose individueller Leseschwierigkeiten und für die Konzeption adaptiver und zielgerichteter Interventionsprogramme zur Förderung des Leseverstehens bei schwachen Leser(inne)n dar.