Involvements of the Plant 3'-5' Exonuclease ERL1 in Chloroplast Ribosomal RNA Biogenesis and RNA Silencing Pathways

ERI-1 und ihm homologe Proteine sind 3‘-5‘ Exoribonukleasen mit konservierten Funktionen in der Regulation von RNA Silencing sowie der Prozessierung ribosomaler RNA. Caenorhabditis elegans ERI-1 (Enhanced RNAi 1) enthält eine konservierte ERI-1_3’hExo_like EXOIII-Domäne, die siRNAs in vitro bindet und degradiert, und deren Inaktivierung eine RNAi-Hypersensitivität zur Folge hat. ERI-1 ist phylogenetisch konserviert, und homologe Proteine wurden Reiche-übergreifend in einer Vielzahl von Modellorganismen identifiziert. RNA-Silencing-reprimierende Eigenschaften dieser Proteine wurden in einigen Fällen charakterisiert. Zusätzlich wurde für eine Untergruppe ERI-1-homologer Proteine eine Funktion in der Biogenese der 5.8S ribosomalen RNA aufgezeigt: Katalyse des letzten Prozessierungsschritts während der Reifung des 5.8S rRNA 3‘-Endes. Diese Doppelfunktion ERI-1-homologer Proteine schlägt eine interessante Brücke zwischen evolutionär weit entfernten auf nicht-codierender RNA basierenden Mechanismen. In dieser Arbeit werden Ergebnisse präsentiert, die Charakteristika des pflanzlichen ERI-1-Homologs ERL1 in verschiedenen regulatorischen Zusammenhängen zum Gegenstand haben. ERL1 lokalisiert in Chloroplasten und zeigt keinerlei messbare Aktivität in Bezug auf die Regulierung von RNA Silencing. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass ERL1 eine wichtige Rolle während der Reifung der chloroplastischen 5S rRNA spielt. ERL1-supprimierende bzw. -überexprimierende transgene Pflanzen, zeigen unterschiedliche phänotypische Aberrationen. Diese beinhalten vielfarbige Blätter, reduziertes Wachstum und Fruchtbarkeit, sowie den Verlust Photosynthese-kompetenter Chloroplasten in gebleichten Sektoren. Diese Defekte werden dadurch verursacht, dass die Plastid-Entwicklung in einem frühen Stadium blockiert wird. Dies führt zu defekten Plastiden, die keine kanonischen internen Strukturen, einschließlich Grana, bilden können. Die gestörte Plastid-Entwicklung ist ein Resultat fehlerhafter Prozessierung ribosomaler RNAs und dem daraus folgenden Verlust plastidärer Transkription und Translation. Wenn ERL1 runterreguliert oder überexprimiert ist, akkumulieren 3‘-elongierte 5S rRNA-Moleküle, was Störungen in der Produktion der Ribosomen hervorruft. Die Reifung der 5S rRNA ist leit langem als Prozess bekannt, der viele aufeinander folgende endonukleolytische Spaltungen sowie exonukleolytische Rezessionen beinhaltet. Bis dato war die Gesamtheit der Exonukleasen während dieser Reifung jedoch nur lückenhaft bekannt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ERL1 eine wichtige Rolle in der Plastid-Entwicklung spielt, indem ERL1 den finalen Reifungsschritt des 5S rRNA 3‘-Endes katalysiert.

Studies of cap-independent mRNA translation in Drosophila melanogaster

Control of protein synthesis is a key step in the regulation of gene expression during apoptosis and the heat shock response. Under such conditions, cap-dependent translation is impaired and Internal Ribosome Entry Site (IRES)-dependent translation plays a major role in mammalian cells. Although the role of IRES-dependent translation during apoptosis has been mainly studied in mammals, its role in the translation of Drosophila apoptotic genes has not been yet studied. The observation that the Drosophila mutant embryos for the cap-binding protein, the eukaryotic initiation factor eIF4E, exhibits increased apoptosis in correlation with up-regulated proapoptotic gene reaper (rpr) transcription constitutes the first evidence for the existence of a cap-independent mechanism for the translation of Drosophila proapoptotic genes. The mechanism of translation of rpr and other proapoptotic genes was investigated in this work. We found that the 5 UTR of rpr mRNA drives translation in an IRES-dependent manner. It promotes the translation of reporter RNAs in vitro either in the absence of cap, in the presence of cap competitors, or in extracts derived from heat shocked and eIF4E mutant embryos and in vivo in cells transfected with reporters bearing a non functional cap structure, indicating that cap recognition is not required in rpr mRNA for translation. We also show that rpr mRNA 5 UTR exhibits a high degree of similarity with that of Drosophila heat shock protein 70 mRNA (hsp70), an antagonist of apoptosis, and that both are able to conduct IRES-mediated translation. The proapoptotic genes head involution defective (hid) and grim, but not sickle, also display IRES activity. Studies of mRNA association to polysomes in embryos indicate that both rpr, hsp70, hid and grim endogenous mRNAs are recruited to polysomes in embryos in which apoptosis or thermal stress was induced. We conclude that hsp70 and, on the other hand, rpr, hid and grim which are antagonizing factors during apoptosis, use a similar mechanism for protein synthesis. The outcome for the cell would thus depend on which protein is translated under a given stress condition. Factors involved in the differential translation driven by these IRES could play an important role. For this purpose, we undertook the identification of the ribonucleoprotein (RNP) complexes assembled onto the 5 UTR of rpr mRNA. We established a tobramycin-affinity-selection protocol that allows the purification of specific RNP that can be further analyzed by mass spectrometry. Several RNA binding proteins were identified as part of the rpr 5 UTR RNP complex, some of which have been related to IRES activity. The involvement of one of them, the La antigen, in the translation of rpr mRNA, was established by RNA-crosslinking experiments using recombinant protein and rpr 5 UTR and by the analysis of the translation efficiency of reporter mRNAs in Drosophila cells after knock down of the endogenous La by RNAi experiments. Several uncharacterized proteins were also identified, suggesting that they might play a role during translation, during the assembly of the translational machinery or in the priming of the mRNA before ribosome recognition. Our data provide evidence for the involvement of La antigen in the translation of rpr mRNA and set a protocol for purification of tagged-RNA-protein complexes from cytoplasmic extracts. To further understand the mechanisms of translation initiation in Drosophila, we analyzed the role of eIF4B on cap-dependent and cap-independent translation. We showed that eIF4B is mostly involved in cap-, but not IRES-dependent translation as it happens in mammals.

Untersuchungen zum Vorkommen und molekularen Mechanismus der Biofilm-Bildung bei Enterokokken aus verschiedenen klinischen Bereichen

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine größere Anzahl an E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen, erstmals insbesondere von Patientinnen, die an Bakterieller Vaginose litten, untersucht und mit E. faecalis Stämme aus verschiedenen anderen klinischen Bereichen auf das Vorkommen von Virulenzfaktoren verglichen. Weiterhin wurden Korrelationen zwischen bestimmten Faktoren und der Menge an produziertem Biofilm erstellt, um mögliche Zusammenhänge zum Mechanismus der Biofilm-Bildung zu erfassen. Mittels statistischer Analysen konnte hinsichtlich der 150 untersuchten E. faecalis Isolate nachgewiesen werden, dass keine signifikanten Unterschiede der Inzidenzen von Virulenzfaktoren (esp, asa1, gelE, GelE, cylA, β-Hämolyse) zwischen den Stämmen der verschiedenen Herkunftsbereiche bestanden. In Bezug auf das Auftreten von Biofilm-Bildung zeigte sich ein erhöhtes Vorkommen bei Stämmen aus Urin sowie invasiver Herkunft (insgesamt jeweils ca. 70 % mäßige und starke Biofilm-Bildner) im Vergleich zu E. faecalis Isolaten aus Wunden oder Faeces (je ca. 40 %). Statistische Auswertungen bzgl. des Zusammenhangs eines oder einer Kombination von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm wiesen darauf hin, dass Isolate, die das esp Gen besaßen, in erhöhtem Maße zur Biofilm-Bildung befähigt waren. Dies zeigte einen gewissen Einfluss des Zellwandproteins auf die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis. Allerdings wurden stets auch Stämme identifiziert, die die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung trotz des Fehlens der jeweils untersuchten genetischen Determinante bzw. der Determinanten aufwiesen, so dass auf das Vorhandensein weiterer, unbekannter Einflussfaktoren auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung bei E. faecalis geschlossen werden konnte. Unter 78 untersuchten E. faecium Isolaten aus verschiedenen klinischen Bereichen konnte lediglich ein Stamm (1,3 %) als mäßiger Biofilm-Bildner charakterisiert werden, so dass die Fähigkeit bei dieser Spezies in der hier untersuchten Region unter diesen Bedingungen kaum nachgewiesen werden konnte. Einen Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Untersuchung zum Vorkommen von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen. Bzgl. des Auftretens von Virulenzfaktoren und Biofilm-Produktion konnte kein Unterschied zwischen Stämmen assoziiert mit Bakterieller Vaginose und Isolaten einer Vergleichsgruppe festgestellt werden. Allerdings zeigte eine Gegenüberstellung mit den untersuchten E. faecalis Stämmen aus anderen klinischen Bereichen, dass die 80 Isolate aus Vaginalabstrichen eine ähnlich hohe Inzidenz bestimmter Virulenzfaktoren wie Stämme aus Faeces, Urin, Wunden oder invasiver Herkunft sowie eine mit den Isolaten aus Urin und invasiver Herkunft vergleichbar hohe Fähigkeit zur Biofilm-Bildung aufwiesen (ca. 75 % mäßige und starke Biofilm-Bildner). Dies deutete auf eine Verbreitung der Biofilm-Bildungsfähigkeit bei E. faecalis Stämmen der Vaginalflora und somit auf eine große Bedeutung der Eigenschaft für Isolate dieser Herkunft hin. Die statistische Auswertung der Korrelationen von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm lieferte ähnliche Ergebnisse wie die Analysen bzgl. der 150 E. faecalis Isolate aus anderen klinischen Bereichen und untermauerte die Annahme, dass zusätzliche Faktoren zu den hier untersuchten Determinanten bei E. faecalis vorhanden sein müssen, die Einfluss auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung nehmen. Deshalb konzentrierte sich ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit auf die Herstellung und Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Spontanmutanten, um bisher noch ungeklärte Mechanismen oder neue Faktoren zu erkennen, die Einfluss auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis nehmen. Die Untersuchung einer Mutante (1.10.16) und ihres Wildtypstamms lieferte erstmals den phänotypischen Nachweis des HMW-Komplexes der drei Bee-Proteine sowie die Identifizierung konservierter Pili-Motive dieser Proteine. Des Weiteren schien die in diesem Cluster ebenfalls codierte Sortase-1 dasjenige Enzym zu sein, das höchstwahrscheinlich die Bindung des Proteins Bee-2 innerhalb dieses HMW-Komplexes katalysiert. Insofern lieferten diese Untersuchungen neue, konkrete Hinweise zur Rolle des bee Genclusters bei der Pili-Biogenese und Biofilm-Bildung von E. faecalis. Darüber hinaus stellen Erkenntnisse aus der Charakterisierung von zwei weiteren hergestellten Biofilm-Spontanmutanten viel versprechende Ausgangspunkte für zukünftige Untersuchungen dar, die ein weitergehendes Verständnis der molekularen Mechanismen der Biofilm-Bildung bei E. faecalis erzielen könnten.

Funktion und Biogenese kleiner RNAs in Dictyostelium discoideum

RNA mediated gene silencing pathways are highly conserved among eukaryotes and they have been well investigated in animals and in plants. Longer dsRNA molecules trigger the silencing pathways: RNase III proteins and their dsRNA binding protein (dsRBP) partners recognize those molecules as a substrate and process 21 nucleotide long microRNAs (miRNAs) or small interfering RNAs (siRNAs). Some organisms encode RNA dependent RNA polymerases (RdRPs), which are able to expand the pool of existing siRNAs. Argonaute proteins are able to bind small regulatory RNAs and are subsequently recruited to target mRNAs by base complementary. This leads in turn to transcriptional or posttranscriptional silencing of respective genes. The Dictyostelium discoideum genome encodes two Dicer homologues (DrnA and DrnB), five Argonaute proteins (AgnA to AgnE) and three RdRPs (RrpA to RrpC). In addition, the amoeba is known to express miRNAs and siRNAs, while the latter derive mainly from the DIRS-1 retrotransposon. One part of this work focused on the miRNA biogenesis pathway of D. discoideum. It was shown that the dsRNA binding protein RbdB is a necessary component for miRNA processing in the amoeba. There were no mature miRNAs detectable by Northern blot analysis in rbdB- strains, which is also true for drnB mutants. Moreover, primary miRNA-transcripts (pri-miRNAs) accumulated in rbdB- and drnB- strains. Fluorescence microscopy studies showed a nuclear localization of RbdB. RbdB accumulated in distinct perinucleolar foci. These were reminiscent of plant dicing bodies that contain essential protein components for miRNA processing. It is well known that RNase III enzymes and dsRBPs work together during miRNA processing in higher eukaryotes. This work demonstrated that the same is true for members of the amoebozoa supergroup. In Arabidopsis the nuclear zinc finger protein Serrate (SE) is also necessary for miRNA processing. The D. discoideum homologue SrtA, however, is not relevant which has been shown by the analysis of the respective knockdown strain. MiRNAs are known to be differentially expressed in several RNAi knockout strains. The accumulation of miRNAs in agnA- strains and a strong decrease in rbdB- strains were criteria that could thus be successfully used (among others) to identify and validate new miRNAs candidates by Illumina®-RNA sequencing. In another part of this study, the silencing and amplification of the DIRS-1 retrotransposons was analyzed in more detail. It was already known that DIRS-1 transcripts and extrachromosomal DIRS-1 DNA molecules accumulated in agnA- strains. This phenotype was correlated with the loss of endogenous DIRS-1 siRNAs in the knockout strain. By deep sequencing analysis of small RNAs from the AX2 wild type and the agnA- strain, the strong decrease of endogenous DIRS-1 siRNAs in the mutant strain (accounting for 70 %) could be confirmed. Further analysis of the data revealed an unequal distribution of DIRS-1 derived siRNAs along the retroelement in the wild type strain, since only very few of them matched the inverted terminal repeats (ITRs) and the 5’- half of the first open reading frame (ORF). Besides, sense and antisense siRNAs were asymmetrically distributed, as well. By using different reporter constructs it was shown indirectly that AgnA is necessary for the RrpC mediated production of secondary DIRS-1 siRNAs. These analyses also demonstrated an amplification of siRNAs in 5’- and in 3’-direction. Further analysis of the agnA- strain revealed that not only DIRS-1 sense transcripts but also ORF2 and ORF3 encoded proteins were enriched. In contrast, the ORF1 encoded protein GAG was equally expressed in the mutant and the wild type. This might reflect the unequal distribution of endogenous DIRS-1 siRNAs along the retrotransposon. Southern Blot and PCR-analyses showed that extrachromosomal DIRS-1 DNA molecules are present in the cytoplasm of angA- strains and that they are complementary to sense transcripts of intact DIRS-1 elements. Thus, the extrachromosomal DIRS-1 intermediates are likely incomplete cDNA molecules generated by the DIRS-1 encoded reverse transcriptase. One could hypothesize that virus like particles (VLPs) are the places of DIRS-1 cDNA synthesis. At least, DIRS-1 GAG proteins interact and fluorescence microscopy studies showed that they localize in distinct cytoplasmic foci which accumulate in close proximity to the nuclei.