Development and characterization of polymeric nanoparticles(NPs) made from functionalized poly (D,L- lactide) (PLA)polymers

Les nanoparticules polymériques biodégradable (NPs) sont apparues ces dernières années comme des systèmes prometteurs pour le ciblage et la libération contrôlée de médicaments. La première partie de cette étude visait à développer des NPs biodégradables préparées à partir de copolymères fonctionnalisés de l’acide lactique (poly (D,L)lactide ou PLA). Les polymères ont été étudiés comme systèmes de libération de médicaments dans le but d'améliorer les performances des NPs de PLA conventionnelles. L'effet de la fonctionnalisation du PLA par insertion de groupements chimiques dans la chaîne du polymère sur les propriétés physico-chimiques des NPs a été étudié. En outre, l'effet de l'architecture du polymère (mode d'organisation des chaînes de polymère dans le copolymère obtenu) sur divers aspects de l’administration de médicament a également été étudié. Pour atteindre ces objectifs, divers copolymères à base de PLA ont été synthétisés. Plus précisément il s’agit de 1) copolymères du poly (éthylène glycol) (PEG) greffées sur la chaîne de PLA à 2.5% et 7% mol. / mol. de monomères d'acide lactique (PEG2.5%-g-PLA et PEG7%-g-PLA, respectivement), 2) des groupements d’acide palmitique greffés sur le squelette de PLA à une densité de greffage de 2,5% (palmitique acid2.5%-g-PLA), 3) de copolymère « multibloc » de PLA et de PEG, (PLA-PEG-PLA)n. Dans la deuxième partie, l'effet des différentes densités de greffage sur les propriétés des NPs de PEG-g-PLA (propriétés physico-chimiques et biologiques) a été étudié pour déterminer la densité optimale de greffage PEG nécessaire pour développer la furtivité (« long circulating NPs »). Enfin, les copolymères de PLA fonctionnalisé avec du PEG ayant montré les résultats les plus satisfaisants en regard des divers aspects d’administration de médicaments, (tels que taille et de distribution de taille, charge de surface, chargement de drogue, libération contrôlée de médicaments) ont été sélectionnés pour l'encapsulation de l'itraconazole (ITZ). Le but est dans ce cas d’améliorer sa solubilité dans l'eau, sa biodisponibilité et donc son activité antifongique. Les NPs ont d'abord été préparées à partir de copolymères fonctionnalisés de PLA, puis ensuite analysés pour leurs paramètres physico-chimiques majeurs tels que l'efficacité d'encapsulation, la taille et distribution de taille, la charge de surface, les propriétés thermiques, la chimie de surface, le pourcentage de poly (alcool vinylique) (PVA) adsorbé à la surface, et le profil de libération de médicament. L'analyse de la chimie de surface par la spectroscopie de photoélectrons rayon X (XPS) et la microscopie à force atomique (AFM) ont été utilisés pour étudier l'organisation des chaînes de copolymère dans la formulation des NPs. De manière générale, les copolymères de PLA fonctionnalisés avec le PEG ont montré une amélioration du comportement de libération de médicaments en termes de taille et distribution de taille étroite, d’amélioration de l'efficacité de chargement, de diminution de l'adsorption des protéines plasmatiques sur leurs surfaces, de diminution de l’internalisation par les cellules de type macrophages, et enfin une meilleure activité antifongique des NPs chargées avec ITZ. En ce qui concerne l'analyse de la chimie de surface, l'imagerie de phase en AFM et les résultats de l’XPS ont montré la possibilité de la présence de davantage de chaînes de PEG à la surface des NPs faites de PEG-g-PLA que de NPS faites à partie de (PLA-PEG-PLA)n. Nos résultats démontrent que les propriétés des NPs peuvent être modifiées à la fois par le choix approprié de la composition en polymère mais aussi par l'architecture de ceux-ci. Les résultats suggèrent également que les copolymères de PEG-g-PLA pourraient être utilisés efficacement pour préparer des transporteurs nanométriques améliorant les propriétés de certains médicaments,notamment la solubilité, la stabilité et la biodisponibilité.

Contribution des protéines issues du liquide synovial dans la protection et la survie des PMN humains : chimioprotection : étude comparative des mécanismes d’action impliqués par rapport au GM-CSF

Les polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) représentent une arme primordiale dans la défense contre divers agents pathogènes; notamment les bactéries, les champignons, les cellules tumorales de même que les cellules infectées par des virus. Cependant, certaines pathologies reliées à l’inflammation chronique soulèvent l’implication des neutrophiles notamment dans l’arthrite rhumatoïde. La réponse inflammatoire persistante générée par l’activation et la survie des neutrophiles engendre une destruction des tissus environnants suite à la sécrétion non contrôlée de leurs produits cytotoxiques. Même si l’activation chronique des neutrophiles est néfaste dans plusieurs pathologies, elle pourrait s’avérer un bon outil en cas de neutropénie, comme c’est souvent le cas les patients ayant reçu des traitements de chimiothérapie. Ce projet fait suite aux travaux doctoraux de Lagraoui (1999). Il vise à identifier le(s) facteur(s) du liquide synovial qui augmente la survie des neutrophiles ainsi que le mécanisme d’action impliqué dans ce processus. Similairement au facteur semi-pur isolés par Lagraoui (1999), le milieu conditionné concentré (MCC) augmente la survie des PMNs de 75% (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01). Suivant le séquençage du MCC parallèlement au facteur semi-pur actif, deux protéines ont été identifiées à la fois dans le MCC et dans le facteur semi-pur soient : l’albumine et la fétuine. Notre projet vise donc à comparer les effets de l’albumine et de la fétuine à ceux du GM-CSF dans l’optique d’une thérapie alternative au GM-CSF en tant qu’adjuvant de chimiothérapie. La présence d’albumine, de fétuine ou de GM-CSF chez les PMNs incubés 24 heures avec la Mutamycin® induit une diminution du nombre de cellules en apoptose par rapport à la Mutamycin® (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). L’effet de l’albumine dépend de la voie de la kinase PI3 mais également celle la kinase ERK, alors que celle de la fétuine dépend de la kinase PI3. Similairement l’EPO, l’albumine et la fétuine supporte la différentiation des HSCs en précurseurs érythrocytaires de type BFU-E. Dans un modèle murin de chiomioprotection, l’albumine augmente la concentration cellulaire rapport au groupe contrôle des leukocytes de la rate (66 ±8 x106c/ml vs 81 ±16 x106c/ml) et du sang (3.6 ±0.4 x106c/ml vs 5.7 ±2.3 x106c/ml). Donc, in vitro, l’albumine et la fétuine sont comparables au GM-CSF au niveau fonctionalité et mécansimes d’action. Cependant, vu leur manque de spécificité, l’application thérapeutique en tant qu’adjuvant de chiomiothérapie de l’albumine et la fétuine est peu prometteuse. Par contre, les maladies dégénératives et les évènements ischémiques pourraient s’avérer de bonnes cibles thérapeutiques, principalement pour l’albumine.

Étude fonctionnelle de l’opéron fimbriaire stg de Salmonella enterica sérovar Typhi

La bactérie Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) provoque la fièvre typhoïde chez les humains et constitue un problème de santé publique important. La majorité de nos connaissances sur la pathogenèse de cette bactérie provient du modèle de fièvre entérique chez la souris causée par le sérovar Typhimurium. Peu d’études se sont penchées sur les facteurs de virulence uniques au sérovar Typhi, ni sur la possibilité que les pseudogènes retrouvés dans son génome puissent être fonctionnels. Le fimbria stg, unique au sérovar Typhi, renferme un codon d’arrêt TAA prématuré dans le gène stgC qui code pour le placier responsable de l’assemblage des sous-unités fimbriaires à la surface de la bactérie. Ainsi, le fimbria stg a été classifié dans la liste des pseudogènes non-fonctionnels. Les objectifs de cette étude étaient d’évaluer l’implication du fimbria stg lors de l’interaction avec les cellules humaines, puis de vérifier l’importance du pseudogène stgC lors de la biogenèse fimbriaire. Dans une première partie, la transcription de stg a été évaluée à l’aide d’une fusion lacZ. Malgré des niveaux d’expression observés généralement faibles en milieu riche, la croissance en milieu minimal a favorisé la transcription de l’opéron. La délétion complète de l’opéron fimbriaire stgABCD du génome de S. Typhi a été réalisée par échange allélique, puis a été complémentée sur un plasmide. Il a été démontré que la présence de stg chez S. Typhi, S. Typhimurium et E. coli contribue à une adhérence accrue sur les cellules épithéliales humaines. De plus, ce fimbria semble agir comme une structure anti-phagocytaire lors de l’interaction avec des macrophages humains. Ainsi, l’opéron stg semble fonctionnel, malgré son codon d’arrêt prématuré, puisque des phénotypes ont été observés. La seconde partie de cette étude consistait à vérifier le rôle joué par le pseudogène stgC dans la biogenèse du fimbria. Différentes variantes de l’opéron ont été générées, clonées dans un vecteur inductible à l’arabinose, puis transformées dans la souche afimbriaire d’E. coli ORN172. La translocation de la sous-unité fimbriaire StgD à la surface de la bactérie a été évaluée chez ces différents mutants par immunobuvardage de type Western. Cette expérience a permis de démontrer que le pseudogène stgC est essentiel pour l’exportation de la sous-unité StgD à la surface. L’ajout d’une étiquette de 6-histidines en C-terminal de StgC a permis de confirmer la traduction complète du gène, malgré le codon d’arrêt TAA prématuré. Le séquençage peptidique a révélé l’insertion d’une tyrosine à ce codon. Une fusion traductionnelle avec la protéine verte fluorescente a révélé qu’environ 0.8% de l’ARNm peut être traduit et permet la production complète du placier. Ce projet a permis la caractérisation d’un facteur de virulence unique à S. Typhi et constitue une étape de plus vers la compréhension de ses mécanismes de pathogenèse. Il s’agit de la première démonstration chez les bactéries de la fonctionnalité d’un gène interrompu prématurément par un codon d’arrêt TAA.

Rôle de la péroxydation lipidique dans le développement de l'athérosclérose

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude de l’infection au Cryptococcus chez la souris transgénique exprimant le génome du VIH-1

Cryptococcus neoformans var. grubii est responsable de la majeure partie des infections au Cryptococcus chez les individus infectés au VIH-1. Cryptococcus gattii infecte généralement les personnes immunocompétentes. Afin de comprendre les mécanismes responsables de la susceptibilité différentielle de ces espèces lors de l’infection au VIH-1, nous avons établi et caractérisé un modèle novateur de la cryptococcose chez des souris transgéniques (Tg) CD4C/HIVMutA exprimant des gènes du VIH-1, et qui développent une maladie similaire au SIDA. Les objectifs sont de démontrer une différence significative au niveau de la survie, de la réponse inflammatoire et du recrutement cellulaire pulmonaire en fonction de la présence du transgène et de l’espèce de Cryptococcus inoculée. Des analyses de survie, d’histopathologie et de cytométrie en flux sur les populations cellulaires pulmonaires ont été effectuées. Les souris Tg infectées avec C. neoformans H99 ou C23 ont démontré une survie réduite et une augmentation de la dissémination comparativement aux souris non-Tg, contrairement aux souris Tg infectées au C. gattii R265 ou R272. L’examen histopathologique des poumons de souris Tg infectées au H99 a montré une faible réponse inflammatoire, contrairement aux souris non-Tg. Pour la souche R265, il y avait une très faible réponse inflammatoire chez les deux types de souris. Enfin, l’étude des populations cellulaires du poumon a révélé chez les souris Tg une augmentation des pourcentages de macrophages interstitiels et de cellules polymorphonucléaires, ainsi qu’une diminution des lymphocytes T CD4+ et CD8+, indépendamment de l’infection au Cryptococcus. Ce modèle novateur représente donc un outil très pertinent pour l’étude de l’immunopathogenèse de la cryptococcose dans le contexte du VIH.

Implication de DC-SIGN et DC-SIGNR dans la transmission mère-enfant du VIH-1

La transmission mère-enfant du VIH-1 (TME) représente le principal mode d’infection chez l’enfant et se produit durant la grossesse (in utero, IU), l’accouchement (intrapartum, IP) ou l’allaitement (postpartum, PP). Les mécanismes qui sous-tendent le passage du VIH-1 à travers le placenta et les muqueuses intestinales du nouveau-né sont encore très peu décrits. « Dendritic cell-specific ICAM-grabbing non-integrin » (DC-SIGN) et son homologue DC-SIGN « related » (DC-SIGNR) sont des récepteurs d’antigènes exprimés au niveau du placenta et capables de capter et de transmettre le VIH-1 aux cellules adjacentes. Ils pourraient donc participer au passage trans placentaire du VIH-1 et le polymorphisme génétique affectant l’expression ou modifiant l’interaction avec le virus aurait une influence sur la TME du VIH-1. Afin d’explorer cette hypothèse, nous avons procédé à une analyse exhaustive du polymorphisme de DC-SIGN et DC-SIGNR dans la population du Zimbabwe. Par la suite, nous avons déterminé l’association entre le polymorphisme de DC-SIGN et DC-SIGNR et la TME du VIH-1 dans une cohorte d’enfants nés de mères VIH-positives à Harare, au Zimbabwe. Enfin, nous avons défini l’impact fonctionnel des mutations associées. Les enfants homozygotes pour les haplotypes H1 et H3 dans le gène de DC-SIGNR sont 4 à 6 fois plus à risque de contracter le VIH-1 par voie IU et IP. H1 et H3 contiennent la mutation du promoteur p-198A et la mutation de l’intron 2, int2-180A, et des études fonctionnelles nous ont permis de démontrer que p-198A diminue l’activité transcriptionnelle du promoteur de DC-SIGNR et l’expression des transcrits d’ARNm dans le placenta, alors que int2-180A modifie le répertoire d’isoformes de DC-SIGNR vers une proportion diminuée d’isoformes membranaires. Les enfants porteurs des haplotypes H4 et H6 de DC-SIGN sont 2 à 6 fois plus à risque de contracter le VIH-1 par voie IU. Ces haplotypes contiennent deux mutations du promoteur (p-336T/C et p-201C/A) et quatre mutations codant pour un changement d’acide aminé dans l’exon 4 (R198Q, E214D, R221Q ou L242V) associées à un risque augmenté de transmission IU, IP et PP du VIH-1. Des études fonctionnelles ont démontré que les mutations du promoteur diminuent l’expression de DC-SIGN dans les macrophages placentaires. Toutefois, l’exposition IU au VIH-1 module le niveau d’expression de DC-SIGN, résultant en des niveaux d’expression similaires entre les macrophages des porteurs des allèles sauvages et mutés. Les mutations de l’exon 4 augmentent l’affinité de DC-SIGN pour le VIH-1 et sa capacité à capturer et à transmettre le virus aux lymphocytes T, favorisant possiblement la dissémination du VIH-1 à travers le placenta. L’association entre les mutations de DC-SIGN et la transmission IP et PP du VIH-1 suggèrent qu’il aurait aussi un rôle à jouer dans les muqueuses intestinales de l’enfant. Notre étude démontre pour la première fois l’implication de DC-SIGN et DC-SIGNR dans la TME du VIH-1. L’augmentation des capacités de capture et de transmission de DC-SIGN résulte en une susceptibilité accrue de l’enfant à l’infection au VIH-1 et concorde avec un rôle dans la dissémination transplacentaire. Toutefois, la diminution préférentielle des transcrits membranaires de DC-SIGNR au placenta augmente la TME du VIH-1 et laisse croire à son implication via un autre mécanisme. Ces mécanismes pourraient aussi s’appliquer à d’autres pathogènes reconnus par DC-SIGN et DC-SIGNR et transmis de la mère à l’enfant.

Modulation de la réponse immunitaire dans le cerveau par la barrière hémato-encéphalique : implication en sclérose en plaques

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration périvasculaire de cellules mononucléaires, telles que les lymphocytes T CD4+ et CD8+, les lymphocytes B ainsi que les cellules myéloïdes qui comprend les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs). Ce phénomène d’infiltration est dû à une fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’entrée des cellules immunitaires au SNC va mener à la destruction de la gaine de myéline et donc à l’apparition de plaques de démyélinisation. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la migration des divers sous-types de cellules immunitaires du sang périphérique à travers la BHE est contrôlée par des mécanismes moléculaires distincts et spécifiques à chaque type cellulaire. Afin de répondre à cette hypothèse, quatre différentes études ont été mises sur pieds. En premier lieu, nous démontrons un effet bénéfique des statines sur la BHE en SEP, en diminuant la migration des lymphocytes T et des monocytes, et en diminuant la diffusion de marqueurs moléculaire soluble. Ce phénomène s’opère via la suppression du processus d’isoprenylation, et en empêchant probablement la contraction des cellules endothéliales de la BHE. De plus, nous démontrons que les monocytes qui migrent au SNC en condition inflammé sont en mesures de se différencier en DCs et d’induire une réponse inflammatoire de la part des lymphocytes T CD4+. La migration des monocytes à travers la BHE est contrôlée par une nouvelle molécule d’adhérence nommée Ninjurin-1. Le blocage de Ninjurin-1 conduit à une inhibition spécifique de la migration des monocytes in vitro, ainsi qu’à une amélioration des signes cliniques du modèle animal de la SEP, soit l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Finalement, nous démontrons que la migration des lymphocytes T CD8+ au SNC s’effectue via l’intégrine alpha-4. De plus, la majorité des lymphocytes T CD8+ que l’on retrouve dans le liquide céphalo-rachidien de patients SEP, dans le SNC de souris EAE ainsi que dans le SNC de souris infectée au virus de l’hépatite murine portent un phénotype effecteur mémoire. Ces données pourraient expliquer l’émergence de leucoencéphalopathie multifocale progressive observée chez certains patients SEP traités au natalizumab, un anticorps dirigé contre l’intégrine alpha-4. En conclusion, notre étude a permis de démontrer l’importance des monocytes provenant de la périphérie dans le processus inflammatoire prenant part au SNC en SEP. L’inhibition d’entrée de ces cellules pourrait s’avérer bénéfique en SEP tout en permettant l’immuno-surveillance du cerveau, ce que l’anti-alpha-4 intégrine ne permet pas. Les statines pourraient s’avérer une autre option intéressante puisqu’elles agissent sur les processus inflammatoires impliqués dans la SEP.

Application du SPR dans le criblage des ligands synthétiques du CD36 et sa validation

Le CD36 est un récepteur de type éboueur de classe B exprimé à la surface de nombreux types cellulaires dont les macrophages, les cellules endothéliales de la microvasculature et les plaquettes. Ce récepteur multiligand est impliqué dans plusieurs processus pathologiques notamment l’athérosclérose, l’angiogénèse et la malaria via la liaison spécifique de ligands comme les lipoprotéines oxydées de basse densité, la thrombospondine-1 et la protéine PfEMP-1, respectivement. Les peptides de la relâche de l’hormone de croissance (GHRP) ont été identifiés comme les premiers ligands synthétiques du CD36. Afin de développer de nouveaux ligands synthétiques du CD36, l’établissement d’une méthode de criblage est essentiel pour découvrir des composés avec une liaison de haute affinité pour ce récepteur. Pour y parvenir, nous avons surexprimé le domaine extracellulaire du CD36 humain dans les cellules d’insectes Sf9. La protéine soluble purifiée par chromatographie d’affinité fut immobilisée à la surface d’une plaque de résonance de plasmons de surface (SPR) pour les études de liaison. La méthodologie développée a permis de caractériser les ligands du CD36 en déterminant leurs constantes de dissociation (KD), et d’établir une relation structure-activité des ligands de la famille des azapeptides, des composés dérivés du GHRP-6. Afin de valider la méthode par spectroscopie SPR, une corrélation a été établie entre les valeurs de KD obtenues en SPR et les valeurs d’CI50 de courbes d’inhibition de la phosphorylation des MAP kinases JNK1/2 induite par un phospholipide oxydé, le POVPC, en présence de concentrations croissantes de ligands du CD36 dans les macrophages RAW 264.7.

Implication des gènes de Salmonella enterica sérovar Typhi dans les différentes étapes d'infection

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Caractérisation et délétion de tous les systèmes d'adhésion connus de Salmonella enterica sérovar Typhi

Les fimbriae sont des structures protéiques extracellulaires retrouvées chez une vaste diversité de bactéries. Ces structures ont fait l’objet de nombreuses études et sont maintenant reconnus pour leur implication dans l’adhésion et l’invasion aux cellules eucaryotes, mais aussi dans la production de biofilms. Ils sont groupés selon leur voie de sécrétion. Certains utilisent une machinerie spécifique et individuelle, c’est le cas des pili de type IV, tandis que d’autres utilisent la voie de sécrétion générale suivit d’une voie spécifique telle que la voie du chaperon-placier (« Chaperon Usher Pathway ») (fimbriae CUP) ou la voie de nucléation précipitation (« nucleation precipitation pathway ») (Curli). Malgré toutes les connaissances actuelles concernant les fimbriae, très peu d’informations sont disponibles quant aux fimbriae de Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi). Ce pathogène unique à l’homme est l’agent étiologique de la fièvre typhoïde. Puisque les fimbriae sont reconnus pour être impliqués dans l’adaptation à l’hôte, nous avons décidé d’étudier davantage l’arsenal fimbriaire de S. Typhi, dans l’espoir d’identifier des facteurs de virulence uniques à S. Typhi et impliqués dans la ségrégation de l’hôte. La souche S. Typhi ISP1820 possède 14 opérons codant pour des systèmes d’adhésion, mais plusieurs contiennent des pseudogènes et leur expression n’a jamais été observée in vitro. Afin d’étudier les systèmes d’adhésion de S. Typhi, nous avons supprimé chaque opéron du génome individuellement et cumulativement à l’aide une technique de mutagénèse par échange allélique. Ainsi, nous avons testé chaque mutant individuel et la souche mutante pour tous les systèmes d’adhésion dans plusieurs essais tels que des infections de cellules épithéliales et de macrophages, de mobilité et de formation de biofilm. Nous avons aussi évalué l’expression des fimbriae lors de différentes conditions de croissance en laboratoire par RT-PCR. Tous les tests réalisés nous ont permis de découvrir que plusieurs opérons fimbriaires de S. Typhi sont opérationnels et utilisés pour différentes fonctions par la bactérie.

Impact du statut de différenciation des cellules promyélocytaires HL-60 sur l’efficacité anticancéreuse et antiinflammatoire de l’EGCG

L’altération de la barrière hématoencéphalique (BHE) par les cellules tumorales et les cellules immunes circulantes peut mener à la neuroinflammation. Les cellules leucémiques promyélocytaires HL-60 sont un excellent modèle pour étudier et comprendre les mécanismes de signalisation moléculaires qui caractérisent le développement tumoral et métastatique. La cancérogenèse peut s’accompagner de modulations de l’expression de biomarqueurs tels que la cyclooxygénase-2 et la métalloprotéase-9. Les recherches décrites dans ce mémoire relatent l’analyse des biomarqueurs inflammatoires et invasifs régulés lors de la différenciation induite par le PMA des cellules HL-60 en macrophages. Le statut de différenciation cellulaire pourrait avoir un impact sur les gènes cibles de la voie NF-κB. Nous émettons l’hypothèse que le PMA active la voie NF-κB et que cette signalisation peut être renversée par l’(-)-épigallocatéchine-gallate (EGCG). En effet, une régulation à la hausse de l’expression de plusieurs gènes combinée à la diminution de l’expression d’IκB mettent en évidence l’implication de la voie NF-κB dans l’activation des mécanismes pro-inflammatoires et pro-invasifs. Les mêmes observations sont faites dans les cellules différenciées appelées «macrophages-like». L’EGCG, un polyphénol dérivé du thé vert, a un potentiel chimiopréventif. Il est capable d’inhiber la signalisation moléculaire passant par la voie NF-κB dans les cellules HL-60 traitées simultanément par l’EGCG et le PMA, mais pas dans les cellules «macrophages-like». Cette différence peut s’expliquer par une modulation de l’expression du récepteur de surface cellulaire de l’EGCG, le récepteur à la laminine de 67 kDa, et de son précurseur de 37 kDa. Collectivement, nos résultats montrent que le statut de différenciation des cellules promyélocytaires HL-60 concorde avec l’activation des mécanismes favorisant le développement d’un cancer et des métastases. Cet effet peut être prévenu par l’utilisation d’agents naturels tel l’EGCG. Le ciblage de biomarqueurs liés au statut de différenciation des cellules tumorales impliquées dans la perturbation de la barrière hématoencéphalique qui cause la neuroinflammation permettrait l’avancement des connaissances dans la prévention de la cancérogenèse.

Le rôle et la régulation du pyroglutamylated RF-amide peptide dans le tissu adipeux lors de l’obésité

L’obésité est définie comme un surplus de masse adipeuse. Cette condition représente un problème de santé publique devenu pandémique dans les pays industrialisés. Elle prédispose à des maladies potentiellement mortelles comme le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires et la stéatose hépatique non-alcoolique. L’accumulation du tissu adipeux intra-abdominal, formé d’adipocytes, est corrélée avec la résistance à l’insuline. L’augmentation de la masse adipeuse se fait par l’hyperplasie des préadipocytes, la différenciation des préadipocytes en adipocytes et l’hypertrophie des adipocytes. La différenciation des préadipocytes se fait selon l’adipogenèse qui est régulée par une multitude de facteurs, mais qui est inhibée pas les stimuli inflammatoires qui sont aussi responsables de la résistance à l’insuline et de l’apparition des problèmes de santé liés à l’obésité. Nous avons identifié un nouveau système de régulation autocrine/paracrine de l’adipogenèse dans les cellules du tissu adipeux. Le pyroglutamylated RF-amide peptide (QRFP), qui était connu pour son rôle dans la régulation de l’appétit, est un activateur de l’adipogenèse par l’activation de son récepteur, le G protein-coupled receptor 103 (GPR103). Le QRFP est exprimé dans les macrophages et les adipocytes alors que le GPR103 de sous-type b est exprimé dans les adipocytes seulement. Un traitement des adipocytes avec le QRFP augmente le captage des acides gras, l’accumulation de lipides ainsi que l’expression et l’activité de l’enzyme LPL. Le QRFP augmente aussi l’expression des gènes des transporteurs d’acides gras CD36 et FATP1, de l’enzyme activatrice d’acides gras ACSL1 et des facteurs de transcription PPAR-γ et C/EBP-α, qui sont tous impliqués dans l’adipogenèse. En plus de ses effets sur l’adipogenèse, le QRFP possède aussi un effet inhibiteur sur l’activité lipolytique induite par les catécholamines. Nous avons montré que l’expression du QRFP est diminuée dans le tissu adipeux des souris obèses. Selon nos résultats, cette diminution pourrait être expliquée par une augmentation des endotoxines circulantes chez les obèses, appelée endotoxémie métabolique, qui agirait, entre autres, par l’induction des interférons dans les macrophages. Les voies de signalisation de ces effets ont aussi été identifiées. Nous avons montré un autre exemple de stimulus inflammatoire qui régule les signaux adipogènes à la baisse.

Expression et rôle de PD-1 et de ses ligands dans le contexte de la sclérose en plaques

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante et neurodégénérative du système nerveux central (SNC). Les cellules T activées qui expriment le PD-1 sont inhibées via l’interaction avec l’un des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des études effectuées chez le modèle murin de la SEP, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), ont démontré que l’interaction du PD-1 avec ses ligands contribue à atténuer la maladie. Toutefois, le rôle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogenèse de la SEP chez l’humain et dans le modèle murin n’a pas été complètement élucidé. Nous avons déterminé que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de façon significative cette expression en réponse à des cytokines inflammatoires. Le blocage de l’expression du PD-L1 par les astrocytes à l’aide de siRNA spécifiques mène à l’augmentation significative des réponses des cellules T CD8+ (prolifération, cytokines, enzymes lytiques). Nos résultats établissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les réponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus cérébraux post-mortem par immunohistochimie démontre que dans les lésions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus élevés que dans les tissus de témoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moitié des lymphocytes T CD8+ ayant infiltré des lésions de SEP n’expriment pas le récepteur PD-1. Au cours du développement de l’EAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprimé par les cellules T dès le début des symptômes, mais son intensité diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoyé par le PD-L1. Nous avons observé que les cellules endothéliales humaines formant la barrière hémato-encéphalique (BHE) expriment de façon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que l’expression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprimés par les cellules endothéliales ont la capacité de freiner l’activation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration à travers la BHE. L’endothélium du cerveau des tissus normaux et des lésions SEP n’exprime pas des taux détectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moitié de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lésions SEP. Nos travaux démontrent que l’entrée des cellules T activées est contrôlée dans des conditions physiologiques grâce à la présence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, l’expression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lésions SEP nuit au contrôle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ étant dépourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprimé par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester activées.

Immunopathogenèse de la cryptococcose chez la souris transgénique exprimant le génome du VIH-1

La cryptococcose chez les patients atteints du VIH-1 est principalement causée par Cryptococcus neoformans var. grubii tandis que Cryptococcus gattii infecte surtout les personnes immunocompétentes. Afin d’élucider les mécanismes causant la susceptibilité différentielle à l’égard de ces deux espèces de Cryptococcus dans le contexte de l’infection au VIH-1, nous avons utilisé un modèle novateur de la cryptococcose chez la souris transgénique CD4C/HIVMutA, qui exprime les gènes nef, env et rev du VIH-1. L’expression du transgène VIH-1 a augmenté le recrutement pulmonaire des macrophages alvéolaires mais a diminué celui des lymphocytes T CD4+ et CD8+ en réponse à l’infection par le C. neoformans ou le C. gattii. La production pulmonaire des chimiokines MCP-1 (CCL2) et RANTES (CCL5) était également réduite chez les souris transgéniques infectées par l’une ou l’autre de ces espèces de Cryptococcus. La production pulmonaire de MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TGF-β, IL-2, IL-4 et IL-13 était augmentée chez la souris infectée au C. neoformans comparativement à C. gattii. In vitro, les macrophages alvéolaires prélevés chez la souris Tg et stimulés par des agonistes ont produit davantage de MIP-1β, alors que les chimiokines MCP-1 et RANTES n’ont pas été détectées.

Les cytokines inflammatoires modulent la prolifération et la différenciation in vitro des cellules souches/progénitrices de la moelle épinière.

La moelle épinière (MÉ) est essentielle pour relier les informations motrices et sensorielles entre le cerveau et la périphérie. Malheureusement, elle peut facilement être endommagée suite à un traumatisme médullaire (TM) ou des pathologies comme la sclérose en plaques. Chez les vertébrés inférieurs, tels les amphibiens, la MÉ lésée se régénère via ses cellules souches endogènes, alors que celle des mammifères démontre une très faible habileté régénératrice post-traumatique. Des travaux récents ont démontré que la MÉ des mammifères contient des cellules souches neurales latentes correspondant aux cellules épendymaires du canal central. D’autres études ont prouvé qu’à la suite d’un TM, les cellules souches épendymaires (cSÉ) prolifèrent, migrent vers le site de la lésion et se différencient principalement en cellules gliales. Promouvoir la régénération de la MÉ endommagée via la modulation des cellules souches endogènes devient donc une voie thérapeutique intéressante. Isolant des cellules souches/progénitrices de la MÉ via la culture de neurosphères (NS), nos études in vitro, en présence de cytokines inflammatoires ou de milieu conditionné auxmacrophages, suggèrent que la réponse inflammatoire influence fortement la prolifération et la différentiation des cSÉ. Dans l’objectif de définir le programme génétique relié à l’activation des cSÉ de la MÉ, nous avons débuté l’élaboration d’un protocole d’isolement des cSÉ à l’aide d’un modèle de souris transgénique.