Ninjurin-1 est une molécule d'adhérence de la barrière hémato-encéphalique impliquée dans le recrutement de monocytes au sein du système nerveux central

La sclérose en plaques (SEP) est caractérisée par des infiltrations périvasculaires de cellules immunitaires et par de la démyélinisation au sein du système nerveux central (SNC). Ces deux paramètres de la maladie sont associés à la fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). En ce sens, le recrutement des cellules présentatrices d’antigène (CPA) myéloïdes, telles que les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques, dans le SNC à travers la BHE, est une étape cruciale dans l’initiation et la persistance de l’inflammation cérébrale. Nerve injury-induced protein (Ninjurin)-1 est une nouvelle molécule d’adhérence qui médie une interaction de type homophilique et dont l’expression sur l’endothélium vasculaire de la BHE humaine fut identifiée grâce à une analyse protéomique des protéines associées à la BHE. Les résultats présentés dans ce mémoire montrent que l’expression de Ninjurin-1 augmente dans un contexte inflammatoire dans les cultures primaires de cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et sur les CPA myéloïdes humaines ex vivo et générées in vitro. De plus, les CPA infiltrantes retrouvées dans les lésions cérébrales de patients atteints de SEP et dans le SNC des souris atteintes d’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), le modèle murin de la SEP, expriment de hauts niveaux de Ninjurin-1. À l’aide du modèle in vitro de la BHE, la neutralisation de Ninjurin-1 restreint spécifiquement la migration des monocytes à travers les CE-BHE sans affecter le recrutement des lymphocytes, ni la perméabilité des CE-BHE. Enfin, les souris atteintes d’EAE et traitées avec un peptide bloquant dirigé contre Ninjurin-1 présentent une maladie moins sévère ainsi qu’une diminution des CPA infiltrant le SNC et ce comparé au groupe contrôle. Ces résultats suggèrent que Ninjurin-1 est une molécule d’adhérence de la BHE impliquée dans le recrutement de CPA myéloïdes au sein du SNC et qu’elle peut être considérée comme une cible thérapeutique potentielle en SEP.

Rôle de l’enzyme PAS kinase dans la régulation du facteur de transcription PDX-1 dans la cellule bêta pancréatique.

Le diabète de type 2 (DT2) se caractérise par une production insuffisante d'insuline par le pancréas ainsi qu'une résistance des tissus périphériques à l'action de l'insuline. Dans les cellules bêta pancréatiques, le glucose stimule la production de l'insuline en induisant la transcription de son gène et la traduction ainsi que la sécrétion de sa protéine. Paradoxalement, une exposition prolongée et simultanée de ces cellules à de hautes concentrations de glucose en présence d'acides gras conduit à la détérioration de la fonction bêta pancréatique et au développement du DT2. Toutefois, les mécanismes moléculaires responsables de ces effets du glucose ne sont que partiellement connus. L'objectif du travail décrit dans cette thèse est d'identifier les mécanismes responsables de la régulation de la transcription du gène de l'insuline. PDX-1 (de l’anglais pour pancreatic and duodenal homeobox 1) est un facteur de transcription majeur et essentiel tant pour le développement du pancréas que pour le maintien de sa fonction à l'état adulte. En réponse au glucose, PDX-1 se lie au promoteur du gène de l'insuline et induit sa transcription. Ceci est inhibé par l'acide gras palmitate. Dans la première partie des travaux effectués dans le cadre de cette thèse, nous avons identifié deux mécanismes de régulation de la transcription du gène de l'insuline: le premier via ERK1/2 (de l'anglais pour extracellular-signal-regulated protein kinases 1 and 2) et le second par l’enzyme PASK (pour per-arnt-sim kinase). Nous avons également mis en évidence l'existence d'un troisième mécanisme impliquant l'inhibition de l'expression du facteur de transcription MafA par le palmitate. Nos travaux indiquent que la contribution de la signalisation via PASK est majeure. L'expression de PASK est augmentée par le glucose et inhibée par le palmitate. Sa surexpression dans les cellules MIN6 et les îlots isolés de rats, mime les effets du glucose sur l'expression du gène de l'insuline ainsi que sur l'expression de PDX-1 et prévient les effets délétères du palmitate. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons identifié un nouveau mécanisme par lequel PASK augmente la stabilité protéique de PDX-1, soit via la phosphorylation et l'inactivation de la protéine kinase GSK3 bêta (de l'anglais pour glycogen synthase kinase 3 beta). Le glucose induit la translocation de PDX-1 du cytoplasme vers le noyau, ce qui est essentiel à sa liaison au promoteur de ses gènes cibles. L'exclusion nucléaire de PDX-1 a été observée dans plusieurs modèles ex vivo et in vivo de dysfonction de la cellule bêta pancréatique. Dans le dernier volet de cette thèse, nous avons démontré l'importance de l'utilisation de cellules primaires (îlots isolés et dispersés) pour étudier la translocation nucléaire de PDX-1 endogène étant donné que ce mode de régulation est absent dans les lignées insulino-sécrétrices MIN6 et HIT-T15. Ces études nous ont permis d'identifier et de mieux comprendre les mécanismes régulant la transcription du gène de l'insuline via le facteur de transcription PDX-1. Les cibles moléculaires ainsi identifiées pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement du diabète de type 2. Mots-clés : Diabète, îlots de Langerhans, cellule bêta pancréatique, gène de l'insuline, PDX-1, PASK, GSK3 bêta, ERK1/2, PKB, glucose, palmitate.

Modulation de l'expression de Sirt-1 induite par l'endothéline-1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires

Au cours des maladies cardiovasculaires (MCV), il peut se produire divers problèmes de santé, telle que l’insuffisance cardiaque ou encore l’HTA. Ces phénomènes se caractérisent, entre autres, par une augmentation de synthèse d’endotheline-1 (ET-1), un neuropeptide synthétisé par les cellules endothéliales ayant un effet vasoconstricteur sur les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Ainsi, la surexpression de ce vasopeptide, mène à terme, au maintien de l’HTA aggravée des sujets, précédée ou concomitante à l’athérosclérose ou à la resténose, cliniquement illustrées par une prolifération et une migration anormale des CMLV de la media vers l’intima des vaisseaux sanguins. Parallèlement, il a été observé que la protéine sirtuine-1 (Sirt-1), membre de la famille des protéines histones déacétylases (HDAC), présente des propriétés anti-athérosclérotiques par sa capacité d’atténuer la prolifération et la migration des CMLV. Des travaux récents ont aussi montré qu’au cours de l’HTA la protéine Sirt-1 est faiblement exprimée dans les CMLV. Son implication dans le développement des pathologies vasculaires semble apparente, mais des études demeurent nécessaires pour décrire son rôle exact dans la pathogenèse des MCV. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’observer la variation d’expression de Sirt-1 dans les CMLV, isolées de l’aorte ascendante de rat, en réponse à l’ET-1. On a remarqué qu’une heure de stimulation des CMLV avec l’ET-1 induit une diminution de l’expression de Sirt-1 via l’activation des récepteurs ETA. Ces résultats suggèrent que la capacité d’ET-1 à atténuer l’expression de Sirt-1 serait un éventuel mécanisme d’action avec des effets favorisant les MCV.

Association entre les dérégulations des cellules dendritiques et les altérations des lymphocytes B présentes chez les patients infectés par le VIH

La dérégulation du compartiment B est une conséquence importante de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), qui peut mener à des manifestations autoimmunes et ultimement à des lymphomes B. Parmi les premières anomalies détectées, on dénote l’activation polyclonale, reflétée par la présence d’hyperglobulinémie (hyper-Ig) et des titres élevés d’autoanticorps chez les patients. On observe également une altération des dynamiques des populations, notamment une expansion de la population des cellules matures activées. De plus, les patients évoluent vers l’incapacité de générer une réponse humorale efficace, et sont sujets à une perte de la mémoire immunologique en phase chronique, caractérisée par une diminution de la population des cellules mémoires et par l’épuisement cellulaire. Toutefois, on connaît très peu les mécanismes impliqués dans de telles altérations. Les cellules dendritiques (DC) sont parmi les premières populations cellulaires à rencontrer et à propager le VIH lors d’une infection, et s’en trouvent affectées directement et indirectement, par le virus et ses composantes. On retrouve en effet une diminution des fréquences de DC dans le sang, les muqueuses et les organes lymphoïdes de patients infectés par le VIH, ainsi qu’un blocage au niveau de la maturation cellulaire. Toutefois, un débat perdure quant à l’apparition de ces altérations durant la phase aigüe de l’infection, et à la restauration des fréquences et des fonctions des DC chez les patients sous traitement. Cette controverse est due à la rareté des études longitudinales incluant des suivis qui s’échelonnent de la phase aigüe à la phase chronique de l’infection. Les DC jouent un rôle important dans le développement, la survie et l’activation des lymphocytes B, de façon T-dépendante et T-indépendante, notamment via des facteurs de croissance tel que BLyS (B lymphocyte stimulator). Par conséquent, nous formulons l’hypothèse que dans le cadre d’une infection VIH, les altérations observées au niveau des cellules B sont modulées par les DC. L’objectif majeur de cette étude est donc d’évaluer l’implication potentielle des DC dans les altérations des cellules B au cours de l’infection par le VIH. Pour ce faire, nous avons d’abord caractérisé de façon longitudinale le statut des populations de DC du sang périphérique de patients infectés au VIH et présentant différents types de progression de la maladie. Cela nous a permis d’évaluer la présence d’une corrélation entre les dynamiques de DC et le type de progression. Par la suite, nous avons évalué la capacité des DC à exprimer BLyS, puis mesuré sa concentration ainsi que celles d’autres facteurs de croissance des cellules B dans le plasma des patients. Enfin, nous avons caractérisé le statut des lymphocytes B, en fonction du stade de l’infection et du taux de progression clinique des patients. Cette étude démontre une diminution de la fréquence des populations de DC myéloïdes (mDC) dans le sang de patients infectés par le VIH sujets à une progression clinique. Cette diminution est observée dès le stade aigu de l’infection et au-delà du traitement antirétroviral (ART). Des concentrations élevées de MCP-1 (monocyte chemotactic protein), MIP (macrophage inflammatory protein) -3α et MIP-3β suggèrent la possibilité d’un drainage vers des sites périphériques. Nous observons également des niveaux supérieurs à la normale de précurseurs CD11c+CD14+CD16- en phase chronique, possiblement liés à une tendence de régénération des DC. Les patients en phase chronique présentent de hautes concentrations plasmatiques de BLyS, reflétée par un haut taux d’expression de cette cytokine par les mDC et leurs précurseurs. Parallèlement, nous observons une expansion des cellules B matures activées ainsi que des taux élevés d’IgG et IgA dans le sang de ces patients. De plus, nous constatons l’expansion d’une population de cellules B qui présente à la fois des caractéristiques de cellules B immatures transitionnelles (TI, transitional immature), et de cellules B recirculantes activées de la zone marginale (MZ, marginal zone), considérées ici comme des «précurseurs/activées de la MZ». Cette étude démontre aussi, chez les progresseurs lents, une meilleure préservation du compartiment des DC du sang périphérique, accompagnée d’une augmentation de précurseurs des DC de phénotype CD11c+CD14+CD16+, ainsi que des concentrations plasmatiques et niveaux d’expression normaux de BLyS. Conséquemment, nous n’avons pas observé d’augmentation des cellules B matures activées et des cellules B précurseurs/activées de la MZ. Toutefois, la fréquence des cellules B matures de la MZ est diminuée, reflétant possiblement leur recrutement vers des sites périphériques et leur contribution à un mécanisme actif de contrôle de la progression de la maladie. L’ensemble de ce travail suggère que dans le cadre d’une infection au VIH, les altérations observées au niveau des DC modulent les anomalies des cellules B. Par conséquent, le maintien de l’équilibre des fonctions DC, notamment les fonctions noninflammatoires, pourrait avoir un impact important dans la prévention de la progression de maladies associées aux altérations du compartiment des cellules B.

MiR-16, un nouveau régulateur du transporteur de glucose dépendant de l’insuline GLUT-4

Les microARNs sont des petits ARNs non codants d'environ 22 nucléotides qui régulent négativement la traduction de l'ARN messager cible (ARNm) et ont donc des fonctions cellulaires. Le microARN-16 (miR-16) est connu pour ses effets antiprolifératifs. Nous avons observé que l’expression de miR-16 est diminuée dans les cellules endothéliales humaines sénescentes et quiescentes en comparaison à des cellules prolifératives. Une analyse informatique des sites potentiels de liaison de miR-16 prévoit que GLUT-4, un transporteur du glucose insulinodépendant, pourrait être une cible potentielle du miR-16. Nous avons donc testé l'hypothèse que miR-16 régule négativement le métabolisme du glucose cellulaire. Dans des HUVEC, l'inhibition de miR-16 endogène avec des anti-miRNA oligonucléotides (AMO) augmente les niveaux protéiques de GLUT-4 de 1,7 ± 0,4 fois (p=0,0037 ; n=9). Dans des souris nourries avec un régime alimentaire normal ou riche en graisse et en sucre, l’expression de GLUT-4 dans le muscle squelettique a tendance à corréler négativement avec les niveaux de miR-16 (p=0,0998, r2=0,3866, n=4). Ces résultats suggèrent que miR-16 est un régulateur négatif de GLUT-4 et qu’il pourrait être impliqué dans la régulation du métabolisme cellulaire du glucose.

Molecular interactions of arbuscular mycorrhizal fungi with mycotoxin-producing fungi and their role in plant defense responses

Les trichothécènes de Fusarium appartiennent au groupe des sesquiterpènes qui sont des inhibiteurs la synthèse des protéines des eucaryotes. Les trichothécènes causent d’une part de sérieux problèmes de santé aux humains et aux animaux qui ont consommé des aliments infectés par le champignon et de l’autre part, elles sont des facteurs importants de la virulence chez plantes. Dans cette étude, nous avons isolé et caractérisé seize isolats de Fusarium de la pomme de terre infectée naturellement dans un champs. Les tests de pathogénicité ont été réalisés pour évaluer la virulence des isolats sur la pomme de terre ainsi que leur capacité à produire des trichothécènes. Nous avons choisi F. sambucinum souche T5 comme un modèle pour cette étude parce qu’il était le plus agressif sur la pomme de terre en serre en induisant un flétrissement rapide, un jaunissement suivi de la mort des plantes. Cette souche produit le 4,15-diacétoxyscirpénol (4,15-DAS) lorsqu’elle est cultivée en milieu liquide. Nous avons amplifié et caractérisé cinq gènes de biosynthèse trichothécènes (TRI5, TRI4, TRI3, TRI11, et TRI101) impliqués dans la production du 4,15-DAS. La comparaison des séquences avec les bases de données a montré 98% et 97% d'identité de séquence avec les gènes de la biosynthèse des trichothécènes chez F. sporotrichioides et Gibberella zeae, respectivement. Nous avons confrenté F. sambucinum avec le champignon mycorhizien à arbuscule Glomus irregulare en culture in vitro. Les racines de carotte et F. sambucinum seul, ont été utilisés comme témoins. Nous avons observé que la croissance de F. sambucinum a été significativement réduite avec la présence de G. irregulare par rapport aux témoins. Nous avons remarqué que l'inhibition de la croissance F. sambucinum a été associée avec des changements morphologiques, qui ont été observés lorsque les hyphes de G. irregulare ont atteint le mycélium de F. sambucinum. Ceci suggère que G. irregulare pourrait produire des composés qui inhibent la croissance de F. sambucinum. Nous avons étudié les patrons d’expression des gènes de biosynthèse de trichothécènes de F. sambucinum en présence ou non de G. irregulare, en utilisant le PCR en temps-réel. Nous avons observé que TRI5 et TRI6 étaient sur-exprimés, tandis que TRI4, TRI13 et TRI101 étaient en sous-exprimés en présence de G. irregulare. Des analyses par chromatographie en phase-gazeuse (GC-MS) montrent clairement que la présence de G. irregulare réduit significativement la production des trichothécènes par F. sambucinum. Le dosage du 4,15-DAS a été réduit à 39 μg/ml milieu GYEP par G. irregulare, comparativement à 144 μg/ml milieu GYEP quand F. sambucinum est cultivé sans G. irregulare. Nous avons testé la capacité de G. irregulare à induire la défense des plants de pomme de terre contre l'infection de F. sambucinum. Des essais en chambre de croissance montrent que G. irregulare réduit significativement l’incidence de la maladie causée par F. sambucinum. Nous avons aussi observé que G. irregulare augmente la biomasse des racines, des feuilles et des tubercules. En utilisant le PCR en temps-réel, nous avons étudié les niveaux d’expression des gènes impliqué dans la défense des plants de pommes de terre tels que : chitinase class II (ChtA3), 1,3-β-glucanase (Glub), peroxidase (CEVI16), osmotin-like protéin (OSM-8e) et pathogenèses-related protein (PR-1). Nous avons observé que G. irregulare a induit une sur-expression de tous ces gènes dans les racines après 72 heures de l'infection avec F. sambucinum. Nous avons également trové que la baisse provoquée par F. sambucinum des gènes Glub et CEVI16 dans les feuilles pourrait etre bloquée par le traitement AMF. Ceci montre que l’inoculation avec G. irregulare constitut un bio-inducteur systémique même dans les parties non infectées par F. sambucinum. En conclusion, cette étude apporte de nouvelles connaissances importantes sur les interactions entre les plants et les microbes, d’une part sur les effets directs des champignons mycorhiziens sur l’inhibition de la croissance et la diminution de la production des mycotoxines chez Fusarium et d’autre part, l’atténuation de la sévérité de la maladie dans des plantes par stimulation leur défense. Les données présentées ouvrent de nouvelles perspectives de bio-contrôle contre les pathogènes mycotoxinogènes des plantes.

Caractérisation fonctionnelle chez le poisson zèbre de l'isoforme protéique WNK1/HSN2 mutée dans la neuropathie héréditaire sensitive et autonome de type 2

La neuropathie humaine sensitive et autonome de type 2 (NHSA 2) est une pathologie héréditaire rare caractérisée par une apparition précoce des symptômes et une absence d’affectation motrice. Cette pathologie entraîne la perte de perception de la douleur, de la chaleur et du froid ainsi que de la pression (toucher) dans les membres supérieurs et inférieurs et est due à des mutations autosomales récessives confinées à l’exon HSN2 de la protéine kinase à sérine/thréonine WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1). Cet exon spécifique permettrait de conférer une spécificité au système nerveux à l’isoforme protéique WNK1/HSN2. La kinase WNK1 est étudiée en détails, en particulier au niveau du rein, mais son rôle au sein du système nerveux demeure inconnu. Considérant le début précoce de la neuropathie et le manque d’innervation sensorielle révélé par des biopsies chez les patients NHSA2, notre hypothèse de recherche est que les mutations tronquantes menant à la NHSA de type 2 causent une perte de fonction de l’isoforme WNK1/HSN2 spécifique au système nerveux entraînant un défaut dans le développement du système nerveux sensoriel périphérique. Chez l’embryon du poisson zèbre, WNK1/HSN2 est exprimé au niveau des neuromastes de la ligne latérale postérieure, un système mécanosensoriel périphérique. Nous avons obtenu des embryons knockdown pour WNK1/HSN2 par usage d’oligonucléotides morpholino antisens (AMO). Nos trois approches AMO ont révélé des embryons présentant des défauts d’établissement au niveau de la ligne latérale postérieure. Afin de déterminer la voie pathogène impliquant l’isoforme WNK1/HSN2, nous nous sommes intéressés à l’interaction rapportée entre la kinase WNK1 et le co-transporteur neuronal KCC2. Ce dernier est une cible de phosphorylation de WNK1 et son rôle dans la promotion de la neurogenèse est bien connu. Nous avons détecté l’expression de KCC2 au niveau de neuromastes de la ligne latérale postérieure et observé une expression accrue de KCC2 chez les embryons knockdown pour WNK1/HSN2 à l’aide de RT-PCR semi-quantitative. De plus, une sur-expression d’ARN humain de KCC2 chez des embryons a produit des défauts dans la ligne latérale postérieure, phénocopiant le knockdown de WNK1/HSN2. Ces résultats furent validés par un double knockdown, produisant des embryons n’exprimant ni KCC2, ni WNK1/HSN2, dont le phénotype fut atténué. Ces résultats nous mènent à suggérer une voie de signalisation où WNK1/HSN2 est en amont de KCC2, régulant son activation, et possiblement son expression. Nous proposons donc que la perte de fonction de l’isoforme spécifique cause un débalancement dans les niveaux de KCC2 activée, menant à une prolifération et une différenciation réduites des progéniteurs neuronaux du système nerveux périphérique. Les défauts associés à la NHSA de type 2 seraient donc de nature développementale et non neurodégénérative.

Modulation de la réponse immunitaire dans le cerveau par la barrière hémato-encéphalique : implication en sclérose en plaques

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration périvasculaire de cellules mononucléaires, telles que les lymphocytes T CD4+ et CD8+, les lymphocytes B ainsi que les cellules myéloïdes qui comprend les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs). Ce phénomène d’infiltration est dû à une fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’entrée des cellules immunitaires au SNC va mener à la destruction de la gaine de myéline et donc à l’apparition de plaques de démyélinisation. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la migration des divers sous-types de cellules immunitaires du sang périphérique à travers la BHE est contrôlée par des mécanismes moléculaires distincts et spécifiques à chaque type cellulaire. Afin de répondre à cette hypothèse, quatre différentes études ont été mises sur pieds. En premier lieu, nous démontrons un effet bénéfique des statines sur la BHE en SEP, en diminuant la migration des lymphocytes T et des monocytes, et en diminuant la diffusion de marqueurs moléculaire soluble. Ce phénomène s’opère via la suppression du processus d’isoprenylation, et en empêchant probablement la contraction des cellules endothéliales de la BHE. De plus, nous démontrons que les monocytes qui migrent au SNC en condition inflammé sont en mesures de se différencier en DCs et d’induire une réponse inflammatoire de la part des lymphocytes T CD4+. La migration des monocytes à travers la BHE est contrôlée par une nouvelle molécule d’adhérence nommée Ninjurin-1. Le blocage de Ninjurin-1 conduit à une inhibition spécifique de la migration des monocytes in vitro, ainsi qu’à une amélioration des signes cliniques du modèle animal de la SEP, soit l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Finalement, nous démontrons que la migration des lymphocytes T CD8+ au SNC s’effectue via l’intégrine alpha-4. De plus, la majorité des lymphocytes T CD8+ que l’on retrouve dans le liquide céphalo-rachidien de patients SEP, dans le SNC de souris EAE ainsi que dans le SNC de souris infectée au virus de l’hépatite murine portent un phénotype effecteur mémoire. Ces données pourraient expliquer l’émergence de leucoencéphalopathie multifocale progressive observée chez certains patients SEP traités au natalizumab, un anticorps dirigé contre l’intégrine alpha-4. En conclusion, notre étude a permis de démontrer l’importance des monocytes provenant de la périphérie dans le processus inflammatoire prenant part au SNC en SEP. L’inhibition d’entrée de ces cellules pourrait s’avérer bénéfique en SEP tout en permettant l’immuno-surveillance du cerveau, ce que l’anti-alpha-4 intégrine ne permet pas. Les statines pourraient s’avérer une autre option intéressante puisqu’elles agissent sur les processus inflammatoires impliqués dans la SEP.

Facteurs de sévérité et rôle des protéines à domaine polyalanine dans la dystrophie musculaire oculopharyngée

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Caractérisation des processus moléculaires impliqués dans l’activation de la protéine IKKbeta par l'angiotensine II et son rôle dans la réponse phénotypique des CMLV.

Le système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA) régule l’homéostasie de la contraction des artères. Or, suivant la liaison de l’angiotensine II (Ang II) à son récepteur AT1, le SRAA est également impliqué dans l’activation de voies de signalisation à l’origine de l’inflammation et de l’hypertrophie des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), soit deux processus participant au remodelage vasculaire caractéristique de diverses maladies cardiovasculaires, telles l’hypertension et l’athérosclérose. Ces pathologies sont les premières causes de mortalité naturelle en Amérique et les traitements les ciblant ne sont pas optimaux puisqu’ils visent seulement quelques facteurs de risque qui leur sont associés. Ainsi, la détermination des effecteurs intracellulaires régulant ces voies délétères est nécessaire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. L’inflammation Ang II-dépendante dans les CMLV est attribuée au facteur de transcription nuclear factor-kappa B (NF-κB). Cependant, les processus moléculaires couplant le récepteur AT1 à son activation sont peu caractérisés. L’étude abordant cette question démontre in vitro que NF-κB est activé par la protéine IκB kinase β (IKKβ) dans les CMLV exposées à l’Ang II et que cette kinase est régulée par deux voies de signalisation indépendantes, mais complémentaires afin d’assurer son activation rigoureuse et soutenue. L’une des voies est précoce et dépend des seconds messagers ainsi que de deux nouveaux effecteurs sous-jacents au récepteur AT1, soit la E3 ligase TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) et la IKK kinase transforming growth factor-beta-activated kinase 1 (TAK1) tandis que la seconde est tardive et résulte de la signalisation mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2) - extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) - ribosomal S6 kinase (RSK). L’inhibition conjointe de ces voies abroge complètement la réponse inflammatoire, ce qui indique qu’elles en sont la seule source. Ainsi, l’inhibition d’IKKβ pourrait suffire à contrer l’inflammation impliquée dans le remodelage vasculaire associé à une suractivation du SRAA. Une découverte des plus novatrices découle de cette étude, qui veut que la E3 ligase TRAF6 est un nouvel effecteur des récepteurs couplés aux protéines G et est à l’origine de la formation d’un nouveau type de second messager, soit des chaînes libres de poly-ubiquitines. Les mécanismes moléculaires à la base de l’hypertrophie Ang II-dépendante dans les CMLV sont également peu définis. Or, suivant la parution d’un article démontrant qu’IKKβ dans les cellules cancéreuses participe aux mécanismes d’initiation de la traduction en réponse au facteur de nécrose tumorale α (TNFα) via la phosphorylation de la protéine Tuberous sclerosis 1 (TSC1) et donc l’activation du complexe mammalian target of rapamycin (mTORC1), une hypothèse a été émise selon laquelle cette kinase serait impliquée dans la synthèse protéique Ang II-dépendante dans les CMLV. Les expériences effectuées in vitro dans des CMLV exposées à l’Ang II démontrent qu’IKKβ induit la phosphorylation de TSC1 ainsi que l’activation de mTORC1 et de ses substrats S6 kinase 1 (S6K1) et translational regulators eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein (4E-BP1), deux protéines impliquées directement dans l’hypertrophie. Par ailleurs, la synthèse protéique au niveau des CMLV exposées à l’Ang II est réduite de 75% suivant la diminution de l’expression d’IKKβ et suivant la surexpression d’un mutant de TSC1 dont le site consensus d’IKKβ a été modifié, faisant de cette kinase un médiateur majeur au niveau de ce processus. Ainsi, in vitro IKKβ en réponse à l’Ang II est en amont de deux processus impliqués dans un remodelage vasculaire à l’origine de maladies cardiovasculaires. De plus, plusieurs facteurs de risque de ces pathologies convergent à l’activation d’IKKβ, ce qui en fait une cible thérapeutique particulièrement attrayante. Qui plus est, l’administration d’un inhibiteur d’IKKβ à des rats diminue non seulement la synthèse protéique dépendante de l’Ang II au niveau de l’aorte et des artères mésentériques, mais également la synthèse de la protéine pro-inflammatoire VCAM-1 par les cellules composant l’aorte, ce qui confirme son envergure en tant que cible.

Les effets de l’Angiopoietin-like 2 sur la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2

L’angiopoietin-like 2 (angptl2) est une glycoprotéine de 64 kDa pro-inflammatoire et pro-athérogénique associée à divers maladies inflammatoires chroniques. Il est probable que l’angptl2 possède également un effet pro-oxydant, puisqu’elle stimule la production aigüe de dérivés réactifs oxygénés (DRO). Le facteur de transcription « nuclear factor (erythroidderived 2)-like 2 » (Nrf2) fait partie d’un mécanisme antioxydant majeur permettant de maintenir l’équilibre redox via l’induction de plusieurs gènes de l’élément de réponse antioxydante (ERA). En présence de DRO, la protéine Keap-1 se dissocie de Nrf2 et cesse de promouvoir sa dégradation protéasomale. Cette dissociation est stimulée par la protéine DJ-1 qui favorise la translocation nucléaire de Nrf2. La p38MAPK peut phosphoryler Nrf2 et promouvoir son interaction avec Keap-1. Nous avons posé l’hypothèse selon laquelle l’angptl2 causait un stress oxydant chronique, d’abord en stimulant en aigu la production de DRO, puis en inhibant la voie antioxydante Nrf2. Nous avons étudié, par immunobuvardage de type Western sur des cellules endothéliales en culture (HUVEC), les effets de l’angptl2 recombinante (100 nM) sur les niveaux protéiques nucléaires de Nrf2, les niveaux de Keap-1 dans le cytosol et de DJ-1 dans le noyau, en absence et en présence de l’antioxydant NAC (10 μM). Nous avons également étudié l’activation de la p38MAPK. Les niveaux nucléaires de Nrf2 n’ont pas été affectés par la stimulation aigüe (10 min) à l’angptl2 recombinante, mais ont été diminués par la stimulation chronique (24 h). L’ajout d’un agent antioxydant n’a pas altéré l’effet chronique, indiquant que les DRO ne sont pas directement impliqués. Les niveaux protéiques cytosoliques de Keap-1, protéine inhibitrice de Nrf2, et les niveaux nucléaires de DJ-1, protéine stabilisatrice de Nrf2, n’ont pas été affectés par l’angptl2 de manière significative. La phosphorylation de la p38MAPK n’a pas été non plus affectée par la stimulation aigüe ou chronique à l’angptl2. Ces données suggèrent que l’angptl2 n’a pas d’effet aigu, mais a un effet chronique inhibiteur sur la voie Nrf2, qui n’est pas associé à un effet sur Keap-1, DJ-1 ou p38MAPK.

Monoacylglycerol, alpha/beta-hydrolase domain-6, and the regulation of insulin secretion and energy metabolism

Le cycle glycérolipides/acides gras libres (GL/FFA) est une voie métabolique clé qui relie le métabolisme du glucose et des acides gras et il est composé de deux processus métaboliques appelés lipogenèse et lipolyse. Le cycle GL/FFA, en particulier la lipolyse des triglycérides, génère diverses molécules de signalisation pour réguler la sécrétion d'insuline dans les cellules bêta pancréatiques et la thermogenèse non-frissonnante dans les adipocytes. Actuellement, les lipides provenant spécifiquement de la lipolyse impliqués dans ce processus sont mal connus. L’hydrolyse des triglycérides dans les cellules β est réalisée par les actions successives de la triglycéride lipase adipocytaire pour produire le diacylglycérol, ensuite par la lipase hormono-sensible pour produire le monoacylglycérol (MAG) et enfin par la MAG lipase (MAGL) qui relâche du glycerol et des acides gras. Dans les cellules bêta, la MAGL classique est très peu exprimée et cette étude a démontré que l’hydrolyse de MAG dans les cellules β est principalement réalisée par l'α/β-Hydrolase Domain-6 (ABHD6) nouvellement identifiée. L’inhibition d’ABHD6 par son inhibiteur spécifique WWL70, conduit à une accumulation des 1-MAG à longues chaines saturées à l'intérieur des cellules, accompagnée d’une augmentation de la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS). Baisser les niveaux de MAG en surexprimant ABHD6 dans la lignée cellulaire bêta INS832/13 réduit la GSIS, tandis qu’une augmentation des niveaux de MAG par le « knockdown » d’ABHD6 améliore la GSIS. L'exposition aiguë des monoacylglycérols exogènes stimule la sécrétion d'insuline de manière dose-dépendante et restaure la GSIS supprimée par un inhibiteur de lipases appelé orlistat. En outre, les souris avec une inactivation du gène ABHD6 dans tous les tissus (ABHD6-KO) et celles avec une inactivation du gène ABHD6 spécifiquement dans la cellule β présentent une GSIS stimulée, et leurs îlots montrent une augmentation de la production de monoacylglycérol et de la sécrétion d'insuline en réponse au glucose. L’inhibition d’ABHD6 chez les souris diabétiques (modèle induit par de faibles doses de streptozotocine) restaure la GSIS et améliore la tolérance au glucose. De plus, les résultats montrent que les MAGs non seulement améliorent la GSIS, mais potentialisent également la sécrétion d’insuline induite par les acides gras libres ainsi que la sécrétion d’insuline induite par divers agents et hormones, sans altération de l'oxydation et l'utilisation du glucose ainsi que l'oxydation des acides gras. Nous avons démontré que le MAG se lie à la protéine d’amorçage des vésicules appelée Munc13-1 et l’active, induisant ainsi l’exocytose de l'insuline. Sur la base de ces observations, nous proposons que le 1-MAG à chaines saturées agit comme facteur de couplage métabolique pour réguler la sécrétion d'insuline et que ABHD6 est un modulateur négatif de la sécrétion d'insuline. En plus de son rôle dans les cellules bêta, ABHD6 est également fortement exprimé dans les adipocytes et son niveau est augmenté avec l'obésité. Les souris dépourvues globalement d’ABHD6 et nourris avec une diète riche en gras (HFD) montrent une faible diminution de la prise alimentaire, une diminution du gain de poids corporel et de la glycémie à jeun et une amélioration de la tolérance au glucose et de la sensibilité à l'insuline et ont une activité locomotrice accrue. En outre, les souris ABHD6-KO affichent une augmentation de la dépense énergétique et de la thermogenèse induite par le froid. En conformité avec ceci, ces souris présentent des niveaux élevés d’UCP1 dans les adipocytes blancs et bruns, indiquant le brunissement des adipocytes blancs. Le phénotype de brunissement est reproduit dans les souris soit en les traitant de manière chronique avec WWL70 (inhibiteur d’ABHD6) ou des oligonucléotides anti-sense ciblant l’ABHD6. Les tissus adipeux blanc et brun isolés de souris ABHD6-KO montrent des niveaux très élevés de 1-MAG, mais pas de 2-MAG. L'augmentation des niveaux de MAG soit par administration exogène in vitro de 1-MAG ou par inhibition ou délétion génétique d’ABHD6 provoque le brunissement des adipocytes blancs. Une autre évidence indique que les 1-MAGs sont capables de transactiver PPARα et PPARγ et que l'effet de brunissement induit par WWL70 ou le MAG exogène est aboli par les antagonistes de PPARα et PPARγ. L’administration in vivo de l’antagoniste de PPARα GW6471 à des souris ABHD6-KO inverse partiellement les effets causés par l’inactivation du gène ABHD6 sur le gain de poids corporel, et abolit l’augmentation de la thermogenèse, le brunissement du tissu adipeux blanc et l'oxydation des acides gras dans le tissu adipeux brun. L’ensemble de ces observations indique que ABHD6 régule non seulement l’homéostasie de l'insuline et du glucose, mais aussi l'homéostasie énergétique et la fonction des tissus adipeux. Ainsi, 1-MAG agit non seulement comme un facteur de couplage métabolique pour réguler la sécrétion d'insuline en activant Munc13-1 dans les cellules bêta, mais régule aussi le brunissement des adipocytes blancs et améliore la fonction de la graisse brune par l'activation de PPARα et PPARγ. Ces résultats indiquent que ABHD6 est une cible prometteuse pour le développement de thérapies contre l'obésité, le diabète de type 2 et le syndrome métabolique.

Modulation de l’homéostasie lipidique intestinale suite à une intervention en médecine traditionnelle Cri chez un modèle animal d’obésité et de pré-diabète

Introduction : Les taux d’obésité et de diabète de type 2 et leurs complications sont plus élevés chez les populations autochtones que chez la population générale. Une des raisons pour ces taux très élevés de complications est la résistance culturelle des autochtones envers les soins de santé contemporains souvent dus aux traitements culturellement inadéquats pour ces affections. Afin d’adresser cette problématique, l’équipe sur les médecines autochtones antidiabétiques des Instituts de recherche en santé du Canada (ÉMAAD-IRSC) a étudié 17 plantes de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Nation de la Baie James, dont le peuplier baumier Populus balsamifera. Objectifs : Le but de cette présente étude est d’examiner les effets de P. balsamifera sur les contenus lipidiques de l’intestin ainsi que la composition des protéines clés impliquées dans le métabolisme des lipides. Matériel et méthodes : Les souris étaient assignées à huit semaines de diètes, soit la diète standard (CHOW), une diète à forte teneur lipidique (HFD) ou une HFD avec ajout de 125 mg/kg de Populus balsamifera. Résultats : Les résultats ont montré que les teneurs totales de l’intestin en cholestérol, en phospholipides et en triglycérides ne sont pas influencées par l’absence ou la présence de l’extrait de P. balsamifera. La teneur en acides gras a significativement augmenté dans le traitement HFD comparé au groupe contrôle CHOW. Le traitement avec P. balsamifera a significativement réduit le contenu d’acides gras dans le jéjunum vers des valeurs observées pour la diète contrôle. Une modification non significative a été notée dans l’expression des protéines FAS, CPT-1, ACC-P. Conclusion : Ces résultats renforcent davantage le potentiel d’utilisation de l’extrait de peuplier baumier dans le contexte de forte prévalence d’obésité dans les populations autochtones.

Requirements for the selective degradation of CD4 receptor molecules by the human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein in the endoplasmic reticulum.

BACKGROUND: HIV-1 Vpu targets newly synthesized CD4 receptor for rapid degradation by a process reminiscent of endoplasmic reticulum (ER)-associated protein degradation (ERAD). Vpu is thought to act as an adaptor protein, connecting CD4 to the ubiquitin (Ub)-proteasome degradative system through an interaction with beta-TrCP, a component of the SCFbeta-TrCP E3 Ub ligase complex. RESULTS: Here, we provide direct evidence indicating that Vpu promotes trans-ubiquitination of CD4 through recruitment of SCFbeta-TrCP in human cells. To examine whether Ub conjugation occurs on the cytosolic tail of CD4, we substituted all four Ub acceptor lysine residues for arginines. Replacement of cytosolic lysine residues reduced but did not prevent Vpu-mediated CD4 degradation and ubiquitination, suggesting that Vpu-mediated CD4 degradation is not entirely dependent on the ubiquitination of cytosolic lysines and as such might also involve ubiquitination of other sites. Cell fractionation studies revealed that Vpu enhanced the levels of ubiquitinated forms of CD4 detected in association with not only the ER membrane but also the cytosol. Interestingly, significant amounts of membrane-associated ubiquitinated CD4 appeared to be fully dislocated since they could be recovered following sodium carbonate salt treatment. Finally, expression of a transdominant negative mutant of the AAA ATPase Cdc48/p97 involved in the extraction of ERAD substrates from the ER membrane inhibited Vpu-mediated CD4 degradation. CONCLUSION: Taken together, these results are consistent with a model whereby HIV-1 Vpu targets CD4 for degradation by an ERAD-like process involving most likely poly-ubiquitination of the CD4 cytosolic tail by SCFbeta-TrCP prior to dislocation of receptor molecules across the ER membrane by a process that depends on the AAA ATPase Cdc48/p97.

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.