Régulation de la proprotéine convertase subtilisine / kexine type 9 (PCSK9) dans les cellules intestinales Caco-2/15

La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) favorise la dégradation post-transcriptionnelle du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLr) dans les hépatocytes et augmente le LDL-cholestérol dans le plasma. Cependant, il n’est pas clair si la PCSK9 joue un rôle dans l’intestin. Dans cette étude, nous caractérisons les variations de la PCSK9 et du LDLr dans les cellules Caco-2/15 différentiées en fonction d’une variété d’effecteurs potentiels. Le cholestérol (100 µM) lié à l’albumine ou présenté en micelles a réduit de façon significative l’expression génique (30%, p<0,05) et l’expression protéique (50%, p<0,05) de la PCSK9. Étonnamment, une diminution similaire dans le LDLr protéique a été enregistrée (45%, p<0,05). Les cellules traitées avec le 25-hydroxycholestérol (50 µM) présentent également des réductions significatives dans l’ARNm (37%, p<0,01) et la protéine (75%, p<0,001) de la PCSK9. Une baisse des expressions génique (30%, p<0,05) et protéique (57%, p<0,01) a également été constatée dans le LDLr. Des diminutions ont aussi été observées pour la HMG CoA réductase et la protéine liant l’élément de réponse aux stérols SREBP-2. Il a été démontré que le SREBP-2 peut activer transcriptionnellement la PCSK9 par le biais de la liaison de SREBP-2 à son élément de réponse aux stérols situé dans la région proximale du promoteur de la PCSK9. Inversement, la déplétion du contenu cellulaire en cholestérol par l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine a augmenté l’expression génique de la PCSK9 (20%, p<0,05) et son contenu protéique (540%, p<0,001), en parallèle avec les niveaux protéiques de SREBP-2. L’ajout des acides biliaires taurocholate et déoxycholate dans le milieu apical des cellules intestinales Caco-2/15 a provoqué une baisse d’expression génique (30%, p<0,01) et une hausse d’expression protéique (43%, p<0,01) de la PCSK9 respectivement, probablement via la modulation du FXR (farnesoid X receptor). Ces données combinées semblent donc indiquer que la PCSK9 fonctionne comme un senseur de stérols dans le petit intestin.

TAR DNA-Binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1

TDP-43 est une protéine multifonctionnelle possédant des rôles dans la transcription, l'épissage des pré-ARNm, la stabilité et le transport des ARNm. TDP-43 interagit avec d'autres hnRNP, incluant hnRNP A2, via son extrémité C-terminale. Plusieurs membres de la famille des hnRNP étant impliqués dans la réponse au stress cellulaire, alors nous avons émis l’hypothèse que TDP-43 pouvait y participer aussi. Nos résultats démontrent que TDP-43 et hnRNP A2 sont localisés au niveau des granules de stress, à la suite d’un stress oxydatif, d’un choc thermique, et lors de l’exposition à la thapsigargine. TDP-43 contribue à la fois à l'assemblage et au maintien des granules de stress en réponse au stress oxydatif. TDP-43 régule aussi de façon différentielle les composants clés des granules de stress, notamment TIA-1 et G3BP. L'agrégation contrôlée de TIA-1 est perturbée en l'absence de TDP-43. En outre, TDP-43 régule le niveau d`ARNm de G3BP, un facteur de granule de stress de nucléation. La mutation associée à la sclérose latérale amyotrophique, TDP-43R361S, compromet la formation de granules de stress. Ainsi, la fonction cellulaire de TDP-43 s'étend au-delà de l’épissage; TDP-43 est aussi un composant de la réponse cellulaire au stress central et un acteur actif dans le stockage des ARNs.

Purification and identification of specific RNA-binding protein that binds to the 3'UTR region of cytochrome P450aromatase mRNA in bovine granulosa cells

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Carence en œstrogènes et bases moléculaires du métabolisme des triglycérides et du cholestérol dans le foie et l'intestin : effet de l'exercice physique

La stéatose hépatique et la détérioration du profil lipidique plasmatique sont des pathologies métaboliques favorisées par la carence œstrogénique post-ménopausique. Cependant les mécanismes à la base de ces pathologies n’ont été que très peu étudiés. Le but de cette thèse a été d’investiguer les mécanismes moléculaires possibles à l’origine de l’hypercholestérolémie et de l’accumulation des lipides (triglycérides : TG et cholestérol) dans le foie en utilisant un modèle animal de la ménopause, la rate Sprague Dawley ovariectomisée (Ovx). Nous avons également examiné si le changement des habitudes de vie comme la pratique de l’exercice physique pouvait prévenir ou corriger les modifications induites par l’Ovx. Enfin, rosuvastatine (statine) a été utilisée comme thérapie pharmacologique de l’hypercholestérolémie dans le but de comprendre son effet au niveau moléculaire chez la rate Ovx. L’objectif de la première étude était de déterminer comment l’Ovx peut affecter les niveaux de TG et de cholestérol dans le foie des rates nourries avec une diète riche en lipides (HF : 42% gras). Les rates ont été soumises à la diète HF ou normale pendant 6 semaines avant d’être Ovx ou Sham (ovariectomie simulée), puis maintenues aux mêmes conditions diététiques pour 6 autres semaines. L’Ovx a provoqué une accumulation de TG dans le foie, mais pas la diète HF seule. Cependant, lorsque l’Ovx était combinée à la diète HF, l’accumulation des TG était beaucoup plus importante comparé à ce qui était observé chez les rates Ovx soumises à la diète normale. L’expression génique (ARNm) de CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1), PGC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1) et PPARα (Peroxysome proliferetor activated receptor alpha) intervenant dans l’oxydation des acides gras dans le foie était augmentée par la diète HF (p ˂ 0.001; p ˂ 0.01; p ˂ 0.05 respectivement) ; mais atténuée (p ˂ 0.05; p ˂ 0.05; p ˂ 0.07 respectivement) lorsque les rates ont été Ovx, favorisant ainsi l’accumulation des TG dans le foie. La combinaison de la diète HF à l’Ovx a également provoqué une hypercholestérolémie et une accumulation de cholestérol dans le foie malgré la diminution de l’expression de la HMGCoA-r (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase), enzyme clé de la synthèse du cholestérol. Ceci était associé à l’inhibition de l’expression génique de CYP7a1 (Cytochrome P450, family 7, subfamily a, polypeptide 1), suggérant une diminution de la synthèse des acides biliaires. Ayant constaté dans la première étude que l’Ovx élevait les niveaux de cholestérol hépatique et plasmatique, nous nous sommes fixés comme objectif dans la deuxième étude d’évaluer les effets de l’Ovx sur l’expression génique des transporteurs et enzymes responsables du métabolisme du cholestérol et des acides biliaires dans le foie et l’intestin, et de vérifier si l’exercice sur tapis roulant pouvait prévenir ou corriger les changements causés par l’Ovx. L’hypercholestérolémie constatée chez les rates Ovx comparativement aux Sham était accompagnée de la diminution de l’expression génique des récepteurs des LDL (R-LDL), des résidus de lipoprotéines (LRP1), de SREBP-2 (Sterol regulatory element binding protein 2) et de PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) dans le foie, suggérant une défaillance dans la clairance des lipoprotéines plasmatiques. L’Ovx a aussi inhibé l’expression génique de la MTP (Microsomal triglyceride transfer protein) et stimulé celle de SR-B1 (Scavenger receptor class B, member 1); mais aucun changement n’a été observé avec CYP7a1. Ces changements moléculaires pourraient par conséquent favoriser l’accumulation de cholestérol dans le foie. L’exercice physique n’a pas corrigé les modifications causées par l’Ovx sur l’expression génique de ces molécules au niveau hépatique à l’exception de SREBP-2. Par contre, au niveau intestinal (iléum), l’exercice sur tapis roulant a inhibé l’expression génique des marqueurs moléculaires intervenant dans l’absorption des acides biliaires (OSTα/β, FXR, RXRα, Fgf15) et du cholestérol (LXRα, NCP1L1) au niveau de l’iléum chez les rates Sham entraînées. Ces adaptations pourraient prévenir le développement de l’hypercholestérolémie protégeant en partie contre la survenue de l’athérosclérose. Au vue des effets délétères (hypercholestérolémie et diminution de l’expression du R-LDL, PCSK9, LRP1, SREBP-2 et HMGCOA-r dans le foie) causés par l’Ovx sur le métabolisme du cholestérol constatés dans l’étude 2, la 3ième étude a été conçue pour évaluer l’efficacité de rosuvastatine (Ros) sur l’expression génique de ces marqueurs moléculaires chez les rates Ovx sédentaires ou soumises à l’entraînement volontaire. Ros a été administrée aux rates Ovx pendant 21 jours par voie sous-cutanée à la dose de 5mg/kg/j à partir de la 9ième semaine après l’Ovx. Ros n’a pas diminué la concentration plasmatique de LDL-C et de TC chez les rates Ovx. Par contre, Ros a stimulé (P ˂ 0.05) l’expression génique de PCSK9, SREBP-2, LRP1, HMGCoA-r et ACAT2 (Acyl-CoA cholesterol acyltransferase) mais pas significativement (P = 0.3) celle du R-LDL dans le foie des rates Ovx sédentaires et entraînées. Ros n’a pas réduit la concentration plasmatique de LDL-C probablement à cause de l’induction plus importante de PCSK9 par rapport au R-LDL. Cependant, la stimulation de LRP1 par Ros protège partiellement contre la survenue des maladies cardiovasculaires. En conclusion, les études de cette thèse indiquent que la baisse du niveau des œstrogènes entraîne des changements radicaux du métabolisme hépatique des TG et du cholestérol provoqués par des altérations de l’expression des gènes clés des voies métaboliques associées.

Le rôle du stress oxydant dans les changements épigénétiques contribuant aux complications du syndrome métabolique.

La méthylation de l'ADN est l'une des modifications épigénétiques au niveau des îlots CpG. Cette modification épigénétique catalysée par les ADN méthyltransférases (DNMTs) consiste en la méthylation du carbone 5' d’une cytosine ce qui aboutit à la formation de 5-méthylcytosine. La méthylation de l'ADN est clairement impliquée dans l'inactivation des gènes et dans l'empreinte génétique. Elle est modulée par la nutrition, en particulier par les donneurs de méthyle et par une restriction protéique. Ces modifications épigénétiques persistent plus tard dans la vie et conduisent au développement de nombreuses pathologies telles que le syndrome métabolique et le diabète de type 2. En fait, de nombreux gènes clés subissent une modification de leur état de méthylation en présence des composants du syndrome métabolique. Cela montre que la méthylation de l'ADN est un processus important dans l'étiologie du syndrome métabolique. Le premier travail de ce doctorat a porté sur la rédaction d’un article de revue qui a examiné le cadre central du syndrome métabolique et analyser le rôle des modifications épigénétiques susceptibles d'influer sur l'apparition du stress oxydant et des complications cardiométaboliques. D’autre part, les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées et traitées avec du Fer-Ascorbate pour induire un stress oxydant. Le Fer-Ascorbate a induit une augmentation significative de l’inflammation et de la peroxydation des lipides (malondialdehyde) ainsi que des altérations de de la défense antioxydante (SOD2 et GPx) accompagnées de modifications épigénétiques. De plus, la pré-incubation des cellules avec de la 5-aza-2'-désoxycytidine, un agent de déméthylation et/ou l’antioxydant Trolox a normalisé la défense antioxydante, réduit la peroxydation des lipides et prévenu l'inflammation. Ce premier travail a démontré que les modifications du redox et l’inflammation induites par le Fer-Ascorbate peuvent impliquer des changements épigénétiques, plus particulièrement des changements dans la méthylation de l’ADN. Pour mieux définir l’impact du stress oxydant au niveau nutritionnel, des cochons d’Inde âgés de trois jours ont été séparés en trois groupes : 1) Témoins: alimentation régulière; 2) Nutrition parentérale (NP) 3) H2O2 : Témoins + 350 uM H2O2. Après quatre jours, pour un groupe, les perfusions ont été stoppées et les animaux sacrifiés pour la collecte des foies. Pour l’autre groupe d’animaux, les perfusions ont été arrêtées et les animaux ont eu un accès libre à une alimentation régulière jusqu'à la fin de l’étude, huit semaines plus tard où ils ont été sacrifiés pour la collecte des foies. Ceci a démontré qu’à une semaine de vie, l'activité DNMT et les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient inférieurs pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. A neuf semaines de vie, l’activité DNMT est restée basse pour le groupe NP alors que les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient plus faibles pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. Ce travail a démontré que l'administration de NP ou de H2O2, tôt dans la vie, induit une hypométhylation de l'ADN persistante en raison d'une inhibition de l'activité DNMT. Finalement, des souris ayant reçu une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ont été utilisées comme modèle in vivo de syndrome métabolique. Les souris ont été nourris soit avec un régime standard chow (témoins), soit avec une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ou avec une diète HFHS en combinaison avec du GFT505 (30 mg/kg), un double agoniste de PPARα et de PPARδ, pendant 12 semaines. La diète HFHS était efficace à induire un syndrome métabolique étant donnée l’augmentation du poids corporel, du poids hépatique, des adiposités viscérales et sous-cutanées, de l’insensibilité à l’insuline, des lipides plasmatiques et hépatiques, du stress oxydant et de l’inflammation au niveau du foie. Ces perturbations étaient accompagnées d’une déficience dans l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ concomitant avec une hyperméthylation de leurs promoteurs respectifs. L’ajout de GFT505 à la diète HFHS a empêché la plupart des effets cardiométaboliques induits par la diète HFHS via la modulation négative de l’hyperméthylation des promoteurs, résultant en l’augmentation de l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ. En conclusion, GFT505 exerce des effets métaboliques positifs en améliorant le syndrome métabolique induit par l'alimentation HFHS via des modifications épigénétiques des gènes PPARs. Ensemble, les travaux de cette thèse ont démontré que le stress oxydant provenant de la nutrition induit d’importants changements épigénétiques pouvant conduire au développement du syndrome métabolique. La nutrition apparait donc comme un facteur crucial dans la prévention de la reprogrammation fœtale et du développement du syndrome métabolique. Puisque les mécanismes suggèrent que le stress oxydant agit principalement sur les métabolites du cycle de la méthionine pour altérer l’épigénétique, une supplémentation en ces molécules ainsi qu’en antioxydants permettrait de restaurer l’équilibre redox et épigénétique.

Évaluation neurobiologique des souris spontanément hypertendues : Du vieillissement à la génomique comparative

Le but de cette thèse est premièrement d’évaluer l’effet du vieillissement sur les fonctions psychomotrices des souches de souris sélectionnées génétiquement en fonction de leur tension artérielle (TA); deuxièmement, de localiser les déterminants génétiques des phénotypes psychophysiologiques à partir de souches recombinantes congéniques (RCS). Ces travaux ont mené à la publication de 4 articles. Le premier article décrit l’évaluation des fonctions psychomotrices des souches avec une tension artérielle élevée (HBP), basse (LBP) et normale (NBP). La performance aux épreuves d’exploration, d’habiletés motrices et d’apprentissage spatial, a été mesurée sur deux cohortes âgées respectivement de 12 mois et de trois mois. Indépendamment de l’âge, les HBPs sont hyperactives dans l’open-field (OF), mais pas dans le test d’exploration de trous. Inversement, les LBP explorent moins d’espaces que les NBP et, à trois mois seulement, sont hypoactives dans l’OF. Par ailleurs, les HBPs et les LBP présentent des déficits précoces de coordination motrice et des fonctions visuo-motrices. Le second article concerne l’évaluation longitudinale de la coordination motrice, de l’anxiété et de l’apprentissage spatial des souches HBP, LBP et NBP, à l’âge de deux mois et de 12 mois. Le vieillissement accentue l’hyperactivité des HBPs dans l’OF. Par contre, l’hypoactivité des souris LBP est détectable seulement à l’âge de deux mois. Indépendamment de l’âge, les souris HBP et LBP montrent une perception réduite du danger dans l’épreuve d’anxiété et des dysfonctions visuo-motrices au labyrinthe aquatique. Enfin, des déficits précoces de coordination motrice se manifestent seulement chez les HBPs. Il reste à déterminer si les déficits observés sont liés à des déterminants génétiques indépendants ou secondaires aux altérations de la tension artérielle. Le troisième article présente la comparaison entre les souches consanguines A/J et C57Bl/6J (B6) aux épreuves de l’OF, de la planche à trous, du labyrinthe aquatique et du cintre (coordination motrice). Les B6 explore d’avantage l’OF et la planche à trous. Les B6 sont moins rapides sur le cintre, mais supérieurs aux A/J dans le labyrinthe aquatique, avec une plate-forme invisible ou visible. Ces résultats démontrent l’implication de déterminants génétiques. Cette thèse se termine par un quatrième article sur la localisation des déterminants génétiques de la susceptibilité au stress dans les RCS, dérivées de A/J et B6, et présentant un agencement spécifique de 12.5% du génome. La réactivité émotionnelle est évaluée dans l’OF et le plus-maze; la réponse de stress est mesurée par radio télémétrie de la température interne pendant le stress d’immobilisation (SI) sous diète régulière et riche en sel; l’excrétion des électrolytes urinaires est dosée après 24 heures de diète salée. Les loci les plus significatifs sont situés dans les régions suivantes: de l’émotionalité dans l’OF (Emo1) sur le chr. 1 (LOD=4.6) correspondant à la région homologue impliquée dans la cohorte d’hypertension familiale du Saguenay; de la dopa décarboxylase (ddc) sur le chr. 11 pour l’émergence du plus-maze (LOD=4.7); de la protéine liant l’endotoxine (lbp) sur le chr. 2 pour l’hypothermie initiale en réponse au SI (LOD=4); et de HSP90 sur le chr. 12 pour l’excrétion de Ca++ (LOD=4.6). Des banques de données sont ensuite interrogées pour recenser les polymorphismes des régions régulatrices ou codantes des gènes candidats chez les souches ancestrales A/J et B6, dont les séquences sont disponibles pour le génome entier. Des utilitaires web permettent de dévoiler les changements dans la structure secondaire de l’ARNm, l’interférence avec des microARN ou avec d’autres motifs de liaison. Plusieurs SNPs fonctionnels ont été identifiés pour le QTL du chr. 1, particulièrement dans les éléments de régulation; ceux-ci impliquant des gènes reliés avec les réponses inflammatoire/immunitaire ou avec le système cardiovasculaire. La quantification par la PCR confirme une régulation à la baisse d’atp1a2 dans le cœur et le cerveau des souches susceptibles à l’anxiété. Ces résultats confirment l’intrication des altérations de la susceptibilité au stress et de la régulation de la TA.

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.

La PCSK9 humaine, une molécule aux multiples facettes métaboliques et une cible thérapeutique prometteuse : études de régulation in vitro et in vivo

La proprotéine convertase subtilisine/kexine-9 (PCSK9) a été identifiée comme le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie autosome dominante (ADH). Les deux autres gènes impliqués dans l’ADH encodent le récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR) et l’apolipoprotéine B. La PCSK9 est une convertase qui favorise la dégradation du LDLR dans les hépatocytes et augmente le niveau plasmatique de cholestérol des LDL (LDL-C). Les mutations « gain de fonction » de la PCSK9 sont associées à un phénotype d’hypercholestérolémie familiale, tandis que les variantes « perte de fonction » sont associées à un LDL-C réduit et à un risque coronarien plus faible. Pour élucider le rôle physiologique de la PCSK9, nous avons étudié sa régulation génique. En utilisant le RT-PCR quantitatif dans des hépatocytes humains, nous avons analysé la régulation de PCSK9 sous différentes conditions modulant l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol. Nous avons démontré que l’expression de la PCSK9 était induite par les statines de manière dose-dépendante et que cette induction était abolie par le mévalonate. De plus, le promoteur de PCSK9 contenait deux motifs conservés pour la régulation par le cholestérol : le sterol regulatory element (SRE) et un site Sp1. La PCSK9 circule dans le plasma sous des formes mature et clivée par la furine. Grâce à notre anticorps polyclonal, nous avons mis au point un test ELISA mesurant la PCSK9 plasmatique totale. Une étude transversale a évalué les concentrations plasmatiques de PCSK9 chez des sujets sains et hypercholestérolémiques, traités ou non par des statines ou une combinaison statine/ezetimibe. Chez 254 sujets sains, la valeur moyenne de PCSK9 (écart-type) était de 89,5 (31,9) µg/L. La concentration plasmatique de la PCSK9 corrélait avec celle de cholestérol total, du LDL-C, des triglycérides (TG), de la glycémie à jeun, l’âge et l’indice de masse corporelle. Le séquençage de PCSK9 chez des sujets aux extrêmes de la distribution des concentrations de PCSK9 de notre cohorte a révélé la présence d’une nouvelle variation « perte de fonction » : R434W. Chez 200 patients hypercholestérolémiques, la concentration de PCSK9 était plus élevée que chez les sujets sains (P<0,04). Elle a augmenté avec une dose croissante de statine (P<0,001), et a augmenté encore plus suite à l’ajout d’ezetimibe (P<0,001). Chez les patients traités, ceux présentant une hypercholestérolémie familiale (HF; due à une mutation du LDLR) avaient des concentrations plus élevées de PCSK9 que les non-HF (P<0,005), et la réduction de LDL-C corrélait positivement avec la concentration de PCSK9 atteinte de la même manière dans les deux sous-catégories (P<0,02 et P<0,005, respectivement). Par ailleurs, une incubation des cellules HepG2 (hépatocytes) et Caco-2 (entérocytes) avec de l’ezetimibe a provoqué une augmentation de l’ARNm de PCSK9 et de NPC1L1 de 1,5 à 2 fois (P<0,05), mais aucune variation significative de PCSK9 sécrétée n’a été observée, suggérant que ces lignées cellulaires ne sont pas un modèle idéal. Nous avons également mesuré le niveau de PCSK9 chez 1 739 Canadiens-français âgés de 9, 13 et 16 ans. La valeur moyenne (écart-type) de PCSK9 dans cette cohorte était de 84,7 (24,7) µg/L, légèrement plus basse que dans la cohorte d’adultes (89,5 (31,9) µg/L). Chez les garçons, la PCSK9 circulante diminuait avec l’âge, tandis que c’était l’inverse chez les filles. Il y avait des associations positives et significatives entre la PCSK9 et la glycémie à jeun, l’insulinémie, le HOMA-IR, et les paramètres lipidiques (TC, LDL-C, TG, HDL-C, apoAI et apoB). Dans l’analyse multivariée, une hausse de 10% de l’insulinémie à jeun était associée à une augmentation de 1 à 2% de PCSK9. La régulation de PCSK9 est typique de celle d’un gène impliqué dans le métabolisme des lipoprotéines et est probablement la cible du facteur de transcription «sterol regulatory element-binding protein » (SREBP-2). La concentration plasmatique de la PCSK9 est associée avec l’âge, le sexe, et de multiples marqueurs métaboliques chez les enfants et les adultes. La détection de la PCSK9 circulante chez les sujets HF et non-HF signifie que ce test ELISA spécifique à PCSK9 pourrait servir à suivre la réponse à la thérapie chez un grand éventail de sujets. PCSK9 semble être une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de l’hypercholestérolémie et de la maladie cardiovasculaire.

Études sur la dérégulation des cytokines et des cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH-1

La prolifération, la différenciation ainsi que les fonctions des cellules du système immunitaire sont contrôlées en partie par les cytokines. Lors de l’infection par le VIH-1, les défauts observés dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du système immunitaire sont en large partie attribués à une production altérée des cytokines et à un manque d’efficacité au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces études, nous nous sommes intéréssés à la régulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont l’IL-18 et l’IL-21. Nous avons observé une corrélation inversée significative entre les concentrations sériques d’IL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infectés par le VIH-1. Nos expériences in vitro ont démontré que cette cytokine induit l’apoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut être inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour FasL et TNF-α. Cette mort cellulaire est due à l’expression de FasL sur les cellules NK et à la production de TNF-α par ces cellules. L’IL-18 augmente aussi la susceptibilité à la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous démontrons aussi que, contrairement à l’IL-18, les niveaux d’IL-18BP sont plus faibles dans les sérum de patients infectés. Ceci résulte sur une production non coordonnée de ces deux facteurs, aboutissant à des niveaux élevés d’IL-18 libre et biologiquement active chez les patients infectés. L’infection de macrophages in vitro induit la production d’IL-18 et réduit celle d’IL-18BP. De plus, l’IL-10 et le TGF-β, dont les concentrations sont élevées chez les patients infectés, réduisent la production d’IL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous démontrons que l’IL-18 augmente la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Les niveaux élevés d’IL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infectés contribuent donc à l’immuno-pathogénèse induite par le VIH-1 en perturbant l’homéostasie des cellules NK ainsi qu’en augmentant la réplication du virus chez les patients. Ces études suggèrent donc la neutralisation des effets néfastes de l’IL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de l’IL-18BP exogène. Ceci permettrait de moduler l’activité de l’IL-18 in vivo à des niveaux souhaitables. L’IL-21 joue un rôle clef dans le contrôle des infections virales chroniques. Lors de ces études, nous avons déterminé la dynamique de la production d’IL-21 lors de l’infection par le VIH-1 et sa conséquence sur la survie des cellules T CD4+ et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1. Nous avons démontré que sa production est compromise tôt au cours de l’infection et que les concentrations d’IL-21 corrèlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectées. Nos études ont démontré que le traitement antirétroviral restaure partiellement la production d’IL-21. De plus, l’infection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en réduisant l’expression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi démontré que la fréquence des cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 qui produisent de l’IL-21 est réduite chez les patients virémiques. Selon nos résultats, l’IL-21 empêche l’apoptose spontanée des cellules T CD4+ de patients infectés et l’absence d’IL-21 réduit la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos résultats démontrent que l'IL-21R est exprimé de façon égale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infectés. L’IL-21 active les protéines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rôle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilité des cellules NK, mais ne possède aucun effet sur leur prolifération. Nous démontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions sécrétrices et cytotoxiques ainsi que la viabilité des cellules NK provenant de patients chroniquement infectés par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble présenter ces effets sans augmenter en contrepartie la réplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la réplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectées d'une manière dépendante à l'expression de perforine et à l'utilisation de la protéine LFA-1. Les niveaux d’IL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur l’état de fonctionnalité de ce compartiment cellulaire. De plus, ces résultats suggèrent l’utilisation de cette cytokine en tant qu’agent immunothérapeutique pour restaurer les niveaux normaux d’IL-21 et augmenter la réponse antivirale chez les patients infectés par le VIH-1.

Association de polymorphismes dans le gène GPIHBP1 avec l’hypertriglycéridémie

L’hypertriglycéridémie (hyperTG) est une dyslipidémie fréquente, caractérisée par une augmentation de la concentration plasmatique en triglycérides (TG). L’hyperTG est considérée comme un facteur de risque indépendant de la maladie cardiovasculaire, particulièrement de la maladie coronarienne athérosclérotique. Plusieurs facteurs environnementaux et génétiques ont été associés avec l’hyperTG. Cependant, près de 90% des cas d’hyperTG primaire sont encore incomplètement caractérisés au niveau moléculaire. Dernièrement, la protéine GPIHBP1 (glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein-binding protein 1), qui a un rôle clef dans le métabolisme des TG, a été associée à l’expression d’hyperTG sévère et rare chez l’humain. Ce mémoire présente les résultats de nos travaux qui ont été effectués afin d’identifier de nouvelles bases moléculaires associées à l’expression de l’hyperTG dans le locus du gène GPIHBP1. Nous avons observé que le polymorphisme GPIHBP1 g.-469G>A (rs72691625), dont la fréquence de l’allèle mineure a été évaluée à 19,6% dans notre échantillon, serait associé à l’expression d’hyperTG (TG ≥ 2mmol/L) dans une population canadienne-française. Ce polymorphisme est associé à un risque 1,67 fois plus grand d’exprimer une triglycéridémie ≥ 2mmol/L chez les porteurs hétérozygotes et 5,7 fois plus grand chez les porteurs homozygotes, comparativement aux non-porteurs. Ce risque d’hyperTG serait exacerbé par la présence concomitante d’une mutation hypertriglycéridémiante dans le gène codant pour la lipoprotéine lipase. La présence de ce polymorphisme serait particulièrement associée à l’expression de la dysbêtalipoprotéinémie familiale et de l’hypertriglycéridémie familiale endogène. GPIHBP1 g.-469G>A est le premier polymorphisme fréquent identifié dans le promoteur du gène à être associé avec l’expression d’hyperTG. GPIHBP1 émerge de plus en plus comme un gène candidat intéressant pour la recherche de nouvelles bases moléculaires pouvant expliquer certaines formes d’hyperTG primaire fréquente.

Régulation transcriptionnelle du gène de la protéine de liaison de la chlorophylle-a et de la péridinine chez le dinoflagellé Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés jouent un rôle très important dans l’écologie des océans en y réalisant une grande partie de la production primaire, en formant une association symbiotique avec les coraux et en ayant la capacité de produire des fleurs d’algues potentiellement toxiques pour les communautés côtières humaines et animales. Malgré tout, la biologie moléculaire des dinoflagellés n’a que très peu été étudiée dans les dernières années, les connaissances de processus de base comme la régulation de la transcription y étant fortement limitées. Une tentative pour élucider ce mécanisme a été réalisée chez les dinoflagellés photosynthétiques Lingulodinium polyedrum et Amphidinium carterae. Une expérience d’induction de la transcription du gène de la Peridinin chlorophyll-a binding protein, le complexe majeur de collecte de lumière, a été réalisée par une baisse de l’intensité lumineuse et a montré une faible augmentation (moins de 2 fois) du transcrit à court et long terme. Des expériences de simple-hybride et de retard sur gel (EMSA) ont été faits pour identifier de potentielles interactions protéine-ADN dans la région intergénique du gène PCP organisé en tandem. Ces essais ont été infructueux pour identifier de telles protéines. Une analyse du transcriptome de L. polyedrum a été effectuée, montrant une importante sous-représentation de domaines de liaison à l’ADN classique (comme Heat-shock factor, bZIP ou Myb) et une surreprésentation du domaine d’origine bactérienne Cold shock en comparaison avec d’autres eucaryotes unicellulaires. Ce travail suggère que les mécanismes de régulation transcriptionnelle des dinoflagellés pourraient différer substantiellement de ceux des autres eucaryotes.

Bioassay-guided fractionation of Larix laricina du Roi, and antidiabetic potentials of ethanol and hot water extracts of seventeen medicinal plants from the traditional pharmacopeia of the James Bay Cree

Nous avons utilisé une approche ethnobotanique pour identifier des espèces de plantes utilisées par les Cris afin de traiter les symptômes du diabète de type 2. Larix laricina du Roi (L. laricina) a récemment été identifiée comme une des meilleures plantes qui a stimulé le transport de glucose dans les cellules C2C12 et fortement potentialisé la différenciation des 3T3-L1 en indiquant une sensibilité potentiellement accrue à l’insuline. Ensuite, ces études de criblage ont été effectuées sur des extraits éthanolique (EE) en utilisant une série de bioessais in vitro. Cependant, les préparations traditionnelles des plantes sont souvent faites avec l’eau chaude. Le but de cette thèse de doctorat était d’isoler les principes actifs de L. laricina par un fractionnement guidé par l’adipogenèse; d’évaluer et de comparer l’activité et les mécanismes antidiabétiques des EE et des extraits aqueux (HWE) de ces 17 plantes. Pour le fractionnement de L. laricina, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau composé actif cycloartane triterpene, qui a amélioré fortement l’adipogenèse et a été responsable en partie de l’activité adipogénique (potentiellement similaire à l’effet sensibilisateur à l’insuline des glitazone) de l’extrait éthanolique issu de l’écorce de L. laricina. Pour le métabolisme lipidique, nos résultats ont confirmé que 10 parmi les 17 EE ont augmenté la différenciation des adipocytes alors que 2 extraits seulement l’ont inhibée. Les HWE ont montré une faible activité adipogénique ou antiadipogénique. Les EE de R. groenlandicum et K. angustifolia ont le PPAR γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), le SREBP-1 (sterol regulatory element binding protein-1) et le C/EBP (CCAAT-enhancer binding proteins) α, alors que ceux de P. balsamifera et A. incana les ont inhibés. L’effet inhibiteur de P. balsamifera a également été prouvé d’avoir impliqué l’activation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK). Les EE et HWE de R. groenlandicum ont stimulé les mêmes facteurs de transcription alors que les extraits aqueux d’autres plantes sélectionnées ont perdu ces effets en comparaison avec leurs extraits éthanoliques respectifs. L’analyse phytochimique a également identifié le groupe des espèces actives et inactives, notamment lorsque les espèces ont été séparées par famille de plante. Finalement concernant l’homéostasie de glucose, nos résultats ont confirmé que plusieurs EE ont stimulé le transport de glucose musculaire et inhibé l’activité de la glucose-6-phosphatase (G6Pase) hépatique. Certains des HWE ont partiellement ou complètement perdu ces activités antidiabétiques par rapport aux EE, tandis qu’une seule plante (R.groenlandicum) a juste conservé un potentiel similaire entre les EE et HWE dans les deux essais. Dans les cellules musculaires, les EE de R.groenlandicum, A. incana et S. purpurea ont stimulé le transport de glucose en activant la voie de signalisation de l’AMPK et en augmentant le niveau d’expression des GLUT4. En comparaison avec les EE, les HWE de R.groenlandicum ont montré des activités similaires; les HWE de A. incana ont complètement perdu leur effet sur tous les paramètres étudiés; les HWE de S. purpurea ont activé la voie de l’insuline au lieu de celle de l’AMPK pour augmenter le transport de glucose. Dans les cellules H4IIE, les EE et HWE des 5 plantes ont activé la voie de l’AMPK, et en plus les EE et HWE de 2 plantes ont activé la voie de l’insuline. La quercétine-3-O-galactoside et la quercétine 3-O-α-L-arabinopyranoside ont été identifiées comme des composés ayant un fort potentiel antidiabétique et donc responsables de l'activité biologique des plantes HWE actifs avec le transport du glucose. En conclusion, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau triterpène actif à partir du fractionnement de L. laricina. Nous avons fourni également une preuve directe pour l'évaluation et la comparaison d'une action analogue à l'insuline ou insulino-sensibilisateur des EE et HWE de plantes médicinales Cris au niveau de muscle, de foie et de tissus adipeux. Une partie de leur action peut être liée à la stimulation des voies de signalisation intracellulaire insulino-dépendante et non-insulino-dépendante, ainsi que l’activation de PPARγ. Nos résultats indiquent que les espèces de plantes, les tissus ou les cellules cibles, ainsi que les méthodes d'extraction sont tous des déterminants significatifs de l'activité biologique de plantes médicinales Cris sur le métabolisme glucidique et lipidique.

Mécanismes de régulation du trafic et de l’activité du récepteur GABAB

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique.

Caractérisation des processus moléculaires impliqués dans l’activation de la protéine IKKbeta par l'angiotensine II et son rôle dans la réponse phénotypique des CMLV.

Le système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA) régule l’homéostasie de la contraction des artères. Or, suivant la liaison de l’angiotensine II (Ang II) à son récepteur AT1, le SRAA est également impliqué dans l’activation de voies de signalisation à l’origine de l’inflammation et de l’hypertrophie des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), soit deux processus participant au remodelage vasculaire caractéristique de diverses maladies cardiovasculaires, telles l’hypertension et l’athérosclérose. Ces pathologies sont les premières causes de mortalité naturelle en Amérique et les traitements les ciblant ne sont pas optimaux puisqu’ils visent seulement quelques facteurs de risque qui leur sont associés. Ainsi, la détermination des effecteurs intracellulaires régulant ces voies délétères est nécessaire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. L’inflammation Ang II-dépendante dans les CMLV est attribuée au facteur de transcription nuclear factor-kappa B (NF-κB). Cependant, les processus moléculaires couplant le récepteur AT1 à son activation sont peu caractérisés. L’étude abordant cette question démontre in vitro que NF-κB est activé par la protéine IκB kinase β (IKKβ) dans les CMLV exposées à l’Ang II et que cette kinase est régulée par deux voies de signalisation indépendantes, mais complémentaires afin d’assurer son activation rigoureuse et soutenue. L’une des voies est précoce et dépend des seconds messagers ainsi que de deux nouveaux effecteurs sous-jacents au récepteur AT1, soit la E3 ligase TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) et la IKK kinase transforming growth factor-beta-activated kinase 1 (TAK1) tandis que la seconde est tardive et résulte de la signalisation mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2) - extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) - ribosomal S6 kinase (RSK). L’inhibition conjointe de ces voies abroge complètement la réponse inflammatoire, ce qui indique qu’elles en sont la seule source. Ainsi, l’inhibition d’IKKβ pourrait suffire à contrer l’inflammation impliquée dans le remodelage vasculaire associé à une suractivation du SRAA. Une découverte des plus novatrices découle de cette étude, qui veut que la E3 ligase TRAF6 est un nouvel effecteur des récepteurs couplés aux protéines G et est à l’origine de la formation d’un nouveau type de second messager, soit des chaînes libres de poly-ubiquitines. Les mécanismes moléculaires à la base de l’hypertrophie Ang II-dépendante dans les CMLV sont également peu définis. Or, suivant la parution d’un article démontrant qu’IKKβ dans les cellules cancéreuses participe aux mécanismes d’initiation de la traduction en réponse au facteur de nécrose tumorale α (TNFα) via la phosphorylation de la protéine Tuberous sclerosis 1 (TSC1) et donc l’activation du complexe mammalian target of rapamycin (mTORC1), une hypothèse a été émise selon laquelle cette kinase serait impliquée dans la synthèse protéique Ang II-dépendante dans les CMLV. Les expériences effectuées in vitro dans des CMLV exposées à l’Ang II démontrent qu’IKKβ induit la phosphorylation de TSC1 ainsi que l’activation de mTORC1 et de ses substrats S6 kinase 1 (S6K1) et translational regulators eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein (4E-BP1), deux protéines impliquées directement dans l’hypertrophie. Par ailleurs, la synthèse protéique au niveau des CMLV exposées à l’Ang II est réduite de 75% suivant la diminution de l’expression d’IKKβ et suivant la surexpression d’un mutant de TSC1 dont le site consensus d’IKKβ a été modifié, faisant de cette kinase un médiateur majeur au niveau de ce processus. Ainsi, in vitro IKKβ en réponse à l’Ang II est en amont de deux processus impliqués dans un remodelage vasculaire à l’origine de maladies cardiovasculaires. De plus, plusieurs facteurs de risque de ces pathologies convergent à l’activation d’IKKβ, ce qui en fait une cible thérapeutique particulièrement attrayante. Qui plus est, l’administration d’un inhibiteur d’IKKβ à des rats diminue non seulement la synthèse protéique dépendante de l’Ang II au niveau de l’aorte et des artères mésentériques, mais également la synthèse de la protéine pro-inflammatoire VCAM-1 par les cellules composant l’aorte, ce qui confirme son envergure en tant que cible.

Evaluating DNA damage response (DDR) activation in human prostate cancer

Introduction: Au Canada, le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes et le plus mortel après les cancers du poumon et du côlon. Il y a place à optimiser le traitement du cancer de la prostate de manière à mettre en œuvre une médecine personnalisée qui s’adapte aux caractéristiques de la maladie de chaque patient de façon individuelle. Dans ce mémoire, nous avons évalué la réponse aux dommages de l’ADN (RDA) comme biomarqueur potentiel du cancer de la prostate. Les lésions potentiellement oncogènes de l'ADN déclenche une cascade de signalisation favorisant la réparation de l'ADN et l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire pour préserver l’intégrité du génome. La RDA est un mécanisme central de suppression tumorale chez l’homme. La RDA joue un rôle important dans l’arrêt de la prolifération des cellules dont les génomes sont compromis, et donc, prévient la progression du cancer en agissant comme une barrière. Cette réponse cellulaire détermine également comment les cellules normales et cancéreuses réagissent aux agents utilisés pour endommager l'ADN lors du traitement du cancer comme la radiothérapie ou la chimiothérapie, en plus la présence d,un certain niveau de RDA dans les cellules du cancer de la prostate peuvent également influer sur l'issue de ces traitements. L’activation des signaux de la RDA peut agir comme un frein au cancer dans plusieurs lésions pré-néoplasiques de l'homme, y compris le cancer de la prostate. Il a été démontré que la RDA est augmentée dans les cellules de néoplasie intra- épithéliale (PIN) comparativement aux cellules prostatiques normales. Toutefois, le devient de la RDA entre le PIN et l’adénocarcinome est encore mal documenté et aucune corrélation n'a été réalisée avec les données cliniques des patients. Notre hypothèse est que les niveaux d’activation de la RDA seront variables selon les différents grades et agressivité du cancer de la prostate. Ces niveaux pourront être corrélés et possiblement prédire les réponses cliniques aux traitements des patients et aider à définir une stratégie plus efficace et de nouveaux biomarqueurs pour prédire les résultats du traitement et personnaliser les traitements en conséquence. Nos objectifs sont de caractériser l'activation de la RDA dans le carcinome de la prostate et corréler ses données avec les résultats cliniques. Méthodes : Nous avons utilisé des micro-étalages de tissus (tissue microarrays- TMAs) de 300 patients ayant subi une prostatectomie radicale pour un cancer de la prostate et déterminé le niveau d’expression de protéines de RDA dans le compartiment stromal et épithélial des tissus normaux et cancéreux. Les niveaux d’expression de 53BP1, p-H2AX, p65 et p-CHK2 ont été quantifiés par immunofluorescence (IF) et par un logiciel automatisé. Ces marqueurs de RDA ont d’abord été validés sur des TMAs-cellule constitués de cellules de fibroblastes normales ou irradiées (pour induire une activation du RDA). Les données ont été quantifiées à l'aide de couches binaires couramment utilisées pour classer les pixels d'une image pour que l’analyse se fasse de manière indépendante permettant la détection de plusieurs régions morphologiques tels que le noyau, l'épithélium et le stroma. Des opérations arithmétiques ont ensuite été réalisées pour obtenir des valeurs correspondant à l'activation de la RDA qui ont ensuite été corrélées à la récidive biochimique et l'apparition de métastases osseuses. Résultats : De faibles niveaux d'expression de la protéine p65 dans le compartiment nucléaire épithélial du tissu normal de la prostate sont associés à un faible risque de récidive biochimique. Par ailleurs, nous avons aussi observé que de faibles niveaux d'expression de la protéine 53BP1 dans le compartiment nucléaire épithéliale du tissu prostatique normal et cancéreux ont été associés à une plus faible incidence de métastases osseuses. Conclusion: Ces résultats confirment que p65 a une valeur pronostique chez les patients présentant un adénocarcinome de la prostate. Ces résultats suggèrent également que le marqueur 53BP1 peut aussi avoir une valeur pronostique chez les patients avec le cancer de la prostate. La validation d'autres marqueurs de RDA pourront également être corrélés aux résultats cliniques. De plus, avec un suivi des patients plus long, il se peut que ces résultats se traduisent par une corrélation avec la survie. Les niveaux d'activité de la RDA pourront éventuellement être utilisés en clinique dans le cadre du profil du patient comme le sont actuellement l’antigène prostatique spécifique (APS) ou le Gleason afin de personnaliser le traitement.