GREBP, un nouveau facteur de transcription contrôlant l’expression de la guanylate cyclase A, récepteur de l’ANP, via l’élément de réponse au cGMP

La découverte du système des peptides natriurétiques (NP), au début des années 80, fut une découverte majeure qui révéla le rôle endocrinien du cœur. Les connaissances sur la relaxation vasculaire, la diurèse et la natriurèse provoquées par ce système ont évolué vers un niveau de complexité insoupçonné à cette époque. Nous savons à présent que les NP sont impliqués dans plusieurs autres mécanismes dont la prolifération cellulaire, l’apoptose, l’inhibition du système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS) et le métabolisme des adipocytes. Le métabolisme des lipides est maintenant devenu une cible de choix dans la lutte contre l’obésité. Cette condition aux proportions pandémiques est un facteur de risque majeur dans l’apparition de l’hypertension et du syndrome métabolique (MetS). La compréhension des mécanismes et des défauts de la voie des NP pourrait avoir un impact positif sur le contrôle du MetS et de l’hypertension. L’expression du récepteur des peptides natriuretiques de type 1 (NPR1/GCA) est contrôlée par plusieurs agents incluant son propre ligand, le peptide natriurétique de l’oreillette (ANP). La découverte d’une boucle de retro-inhibition, dans les années 90, a été un événement majeur dans le domaine des NP. En effet, suite à une stimulation à l’ANP, le NPR1/GCA peut inhiber l’activité transcriptionnelle de son propre gène par un mécanisme dépendant du cGMP. Notre groupe a identifié un élément cis-régulateur responsable de cette sensibilité au cGMP et mon projet consistait à identifier la ou les protéine(s) liant cet élément de réponse au cGMP (cGMP-RE). Nous avons identifié un clone liant le cGMP-RE en utilisant la technique du simple hybride chez la levure et une banque d’ADN complémentaire (ADNc) de rein humain. Ce clone provient d’un ADNc de 1083-bp dont le gène est localisé sur le chromosome 1 humain (1p33.36) et codant pour une protéine dont la fonction était inconnue jusqu’ici. Nous avons nommé cette nouvelle protéine GREBP en raison de sa fonction de cGMP Response Element Binding Protein. Des essais de liaison à l’ADN ont montré que cette protéine possède une affinité 18 fois plus élevée pour le cGMP-RE que le contrôle, tandis que des expériences de retard sur gel (EMSA) ont confirmé la spécificité des interactions protéine-ADN. De plus, l’immuno-précipitation de la chromatine (ChIP) a prouvé que GREBP lie le cGMP-RE dans des conditions physiologiques. La liaison de GREBP au cGMP-RE inhibe l’expression du gène rapporteur luciférase sous contrôle du promoteur de npr1/gca. L’inhibition de GREBP à l’aide d’ARN interférant active le promoteur de npr1/gca. Dans les cellules NCI-H295R, l’ANP stimule l’expression de grebp de 60% après seulement 3 heures et inhibe l’expression de npr1/gca de 30%. GREBP est une protéine nucléaire surtout exprimée dans le cœur et ayant le facteur eIF3F comme partenaire. Les variations nucléotidiques du gène sont plus fréquentes chez les patients hypertendus que chez des patients normotendus ou hypertendus souffrant de MetS. Nous rapportons ici l’existence d’un gène spécifique à l’humain qui agit comme répresseur transcriptionnel de npr1/gca et potentiellement impliqué dans le développement de l’hypertension.

Frequency of Chromosome Healing and Interstitial Telomeres in 40 Cases of Constitutional Abnormalities.

Human telomeres play a major role in stabilizing chromosome ends and preventing fusions. Chromosomes bearing a broken end are rescued by the acquisition of a new telomeric cap without any subtelomeric sequences being present at the breakpoint, a process referred to as chromosome healing. Conversely, a loss of telomeric function or integrity can lead to the presence of interstitial telomeres at the junction site in translocations or ring chromosomes. In order to determine the frequency at which interstitial telomeres or chromosome healing events are observed in target chromosome abnormalities, we conducted a retrospective FISH study using pan-telomeric and chromosome-specific subtelomeric probes on archival material from 40 cases of terminal deletions, translocations or ring chromosomes. Of the 19 terminal deletions investigated, 17 were negative for the subtelomeric probe specific to the deleted arm despite being positive for the pan-telomeric probe. These 17 cases were thus considered as been rescued through chromosome healing, suggesting that this process is frequent in terminal deletions. In addition, as two of these cases were inherited from a parent bearing the same deletion, chromosomes healed by this process are thus stable through mitosis and meiosis. Regarding the 13 cases of translocations and eight ring chromosomes, four and two cases respectively demonstrated pan-telomeric sequences at the interstitial junction point. Furthermore, two cases of translocations and one ring chromosome had both interstitial pan-telomeres and subtelomeres, whereas two other cases of ring chromosomes and one case of translocation only showed interstitial subtelomeres. Therefore, interstitial (sub)telomeric sequences in translocations and ring chromosomes are more common than previously thought, as we found a frequency of 43% in this study. Moreover, our results illustrate the necessity of performing FISH with both subtelomeric and pan-telomeric probes when investigating these rearrangements, as the breakpoints can be either in the distal part of the pan-telomeres, or in between the two types of sequences.

Identification de QTL à pression artérielle dans le chromosome 18 du rat et analyse des gènes candidats Adrb2 et Nedd4l associés à l’hypertension essentielle

L’hypertension constitue un facteur majeur de risque de maladies cardiovasculaires et touche à un pourcentage important de la population humaine. Il s’agit d’une maladie complexe étant donné son caractère multifactoriel. La régulation de la pression artérielle (PA) est sous contrôle de plusieurs gènes, appelés loci pour traits quantitatifs ou QTL, et elle est le résultat de leur interaction. Étant donné que la PA est un trait quantitatif sous contrôle de plusieurs composantes comme les facteurs génétiques et environnementaux, l’étude de l’hypertension est limitée chez les populations humaines. Ainsi la stratégie principale pour l’étude de cette maladie est l’identification de QTL à PA chez des souches congéniques de rat construites à partir des lignées hyper- et normotendues; à savoir les souches Dahl salt-sensitive [1] et Lewis, respectivement. Des études précédentes dans notre laboratoire ont localisé trois QTL à PA au niveau du chromosome 18 chez le rat. Au cours de ce projet, de nouvelles sous-souches ont été construites afin de raffiner la cartographie de ces QTL. Ainsi, les C18QTL1, C18QTL3 et C18QTL4 ont été définis. Des analyses moléculaires ont été effectuées sur deux gènes candidats pour le C18QTL3; à savoir, Adrb2 et Nedd4l associés précédemment à l’hypertension. La comparaison des résultats de séquençage des régions régulatrices et codantes de ces deux gènes, ainsi que leur analyse d’expression par qRT-PCR chez les souches contrastantes DSS et Lewis, n’ont pas montré de différence significative pouvant expliquer la variation du phénotype observé. Des études plus poussées devront être effectuées sur ces deux gènes et, le cas échéant, l’analyse d’autres gènes contenus dans le C18QTL3 devra être entamée afin d’identifier le gène responsable de ce QTL.

Genetic-epidemiologic analysis of X-inactivation skewing in human females : suggestive evidence for two distinct traits

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Bcl-xL (S49) and (S62) sequential phosphorylation/dephosphorylation during mitosis prevents chromosome instability and aneuploidy

Une caractéristique intéressante de la protéine Bcl-xL est la présence d'un domaine en boucle non-structurée entre les hélices α1 and α2 de la protéine. Ce domaine protéique n'est pas essentiel pour sa fonction anti-apoptotique et absent chez CED-9, la protéine orthologue chez Caenorhabditis elegans. A l'intérieur de ce domaine, Bcl-xL subit une phosphorylation et déphosphorylation dynamique sur les résidus Ser49 et Ser62 en phase G2 du cycle cellulaire et lors de la mitose. Lorsque ces résidus sont mutés et les protéines exprimées dans des cellules cancéreuses, les cellules démontrent plusieurs défauts mitotiques liés à l'instabilité chromosomique. Pour analyser les effets de Bcl-xL Ser49 et Ser62 dans les cellules normales, les présentes études ont été réalisées dans des cellules diploïdes humaines normales, et in vivo chez Caenorhabditis elegans. Dans une première étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cellules fibroblastiques diploïdes humaines normales BJ, exprimant Bcl-xL (type sauvage), (S49A), (S49D), (S62A), (S62D) et les double (S49/62A) et (S49/62D) mutants. Les cellules exprimant les mutants de phosphorylation ont montré des cinétiques de doublement de la population cellulaire réduites. Ces effets sur la cinétique de doublement de la population cellulaire corrèle avec l'apparition de la sénescence cellulaire, sans impact sur les taux de mort cellulaire. Ces cellules sénescentes affichent des phénotypes typiques de sénescence associés notamment à haut niveau de l'activité β-galactosidase associée à la sénescence, la sécrétion d' interleukine-6, l'activation de p53 et de p21WAF1/ Cip1, un inhibiteur des complexes kinase cycline-dépendant, ainsi que la formation de foyers de chromatine nucléaire associés à γH2A.X. Les analyses de fluorescence par hybridation in situ et des caryotypes par coloration au Giemsa ont révélé que l'expression des mutants de phosphorylation de Bcl-xL provoquent de l'instabilité chromosomique et l'aneuploïdie. Ces résultats suggèrent que les cycles de phosphorylation et déphosphorylation dynamiques de Bcl-xL Ser49 et Ser62 sont importants dans le maintien de l'intégrité des chromosomes lors de la mitose dans les cellules normales. Dans une deuxième étude, nous avons entrepris des expériences chez Caenorhabditis elegans pour comprendre l'importance des résidus Ser49 et Ser62 de Bcl-xL in vivo. Les vers transgéniques portant les mutations de Bcl-xL (S49A, S62A, S49D, S62D et S49/62A) ont été générés et leurs effets ont été analysés sur les cellules germinales des jeunes vers adultes. Les vers portant les mutations de Bcl-xL ont montré une diminution de ponte et d'éclosion des oeufs, des variations de la longueur de leurs régions mitotiques et des zones de transition, des anomalies chromosomiques à leur stade de diplotène, et une augmentation de l'apoptose des cellules germinales. Certaines de ces souches transgéniques, en particulier les variants Ser/Ala, ont également montré des variations de durée de vie par rapport aux vers témoins. Ces observations in vivo ont confirmé l'importance de Ser49 et Ser62 à l'intérieur du domaine à boucle de Bcl-xL pour le maintien de la stabilité chromosomique. Ces études auront une incidence sur les futures stratégies visant à développer et à identifier des composés qui pourraient cibler non seulement le domaine anti-apoptotique de la protéine Bcl-xL, mais aussi son domaine mitotique pour la thérapie du cancer.