Prévalence et facteurs de risque de l'infection par Coxiella Burnettii chez les ruminants d'élevage au Québec

Coxiella burnetii est une bactérie zoonotique affectant un grand nombre d’espèces animales. Chez les ruminants domestiques, l’infection est généralement asymptomatique, mais parfois associée à des problèmes reproducteurs. Néanmoins, le cycle de transmission de l’infection chez ceux-ci demeure peu connu. Dans ce contexte, nous avons réalisé une étude auprès de fermes bovines, ovines et caprines dans deux régions administratives du Québec afin d’estimer les prévalences de cette infection et d’identifier les facteurs de risque, aux niveaux individuel et troupeau, associés à la positivité. Nous avons estimé une prévalence de positivité au niveau troupeau de 44.6 % (IC95%=33.0-56.6) chez les bovins, de 70.8 % (IC95% =48.9-87.4) chez les ovins et de 66.7 % (IC95% =22.3-95.7) chez les caprins. Une association a été observée chez les troupeaux bovins entre leur positivité et la densité de petits ruminants par kilomètre carré dans un rayon de cinq kilomètres entourant la ferme. Chez les petits ruminants, une association avec la positivité des troupeaux a été observée avec la taille des troupeaux et la présence d’un chien sur la ferme. Au niveau individuel, le nombre de jours en lait ainsi que l’âge des petits ruminants étaient associés à la positivité, et ce dernier facteur était modulé par l’accès des animaux au pâturage. Aucun agrégat spatial de fermes positives n’a été détecté chez aucune des trois espèces. L’infection par Coxiella burnetii est donc fréquente dans les troupeaux de ruminants domestiques québécois et semble associée à certaines pratiques de régie et à la présence, ou proximité, d’autres animaux domestiques.

Épidémiologie spatiale de la campylobactériose au Québec

La campylobactériose représente la principale cause de gastro-entérite bactérienne dans les pays industrialisés. L’épidémiologie de la maladie est complexe, impliquant plusieurs sources et voies de transmission. L’objectif principal de ce projet était d’étudier les facteurs environnementaux impliqués dans le risque de campylobactériose et les aspects méthodologiques pertinents à cette problématique à partir des cas humains déclarés au Québec (Canada) entre 1996 et 2006. Un schéma conceptuel des sources et voies de transmission de Campylobacter a d’abord été proposé suivant une synthèse des connaissances épidémiologiques tirées d’une revue de littérature extensive. Le risque d’une récurrence de campylobactériose a ensuite été décrit selon les caractéristiques des patients à partir de tables de survie et de modèles de régression logistique. Comparativement au risque de campylobactériose dans la population générale, le risque d’un épisode récurrent était plus élevé pour les quatre années suivant un épisode. Ce risque était similaire entre les genres, mais plus élevé pour les personnes de régions rurales et plus faible pour les enfants de moins de quatre ans. Ces résultats suggèrent une absence d’immunité durable ou de résilience clinique suivant un épisode déclaré et/ou une ré-exposition périodique. L’objectif suivant portait sur le choix de l’unité géographique dans les études écologiques. Neuf critères mesurables ont été proposés, couvrant la pertinence biologique, la communicabilité, l’accès aux données, la distribution des variables d’exposition, des cas et de la population, ainsi que la forme de l’unité. Ces critères ont été appliqués à des unités géographiques dérivées de cadre administratif, sanitaire ou naturel. La municipalité affichait la meilleure performance, étant donné les objectifs spécifiques considérés. Les associations entre l’incidence de campylobactériose et diverses variables (densité de volailles, densité de ruminants, abattoirs, température, précipitations, densité de population, pourcentage de diplomation) ont ensuite été comparées pour sept unités géographiques différentes en utilisant des modèles conditionnels autorégressifs. Le nombre de variables statistiquement significatives variait selon le degré d’agrégation, mais la direction des associations était constante. Les unités plus agrégées tendaient à démontrer des forces d’association plus élevées, mais plus variables, à l’exception de l’abattoir. Cette étude a souligné l’importance du choix de l’unité géographique d’analyse lors d’une utilisation d’un devis d’étude écologique. Finalement, les associations entre l’incidence de campylobactériose et des caractéristiques environnementales ont été décrites selon quatre groupes d’âge et deux périodes saisonnières d’après une étude écologique. Un modèle de Poisson multi-niveau a été utilisé pour la modélisation, avec la municipalité comme unité. Une densité de ruminant élevée était positivement associée avec l’incidence de campylobactériose, avec une force d’association diminuant selon l’âge. Une densité de volailles élevée et la présence d’un abattoir de volailles à fort volume d’abattage étaient également associées à une incidence plus élevée, mais seulement pour les personnes de 16 à 34 ans. Des associations ont également été détectées avec la densité de population et les précipitations. À l’exception de la densité de population, les associations étaient constantes entre les périodes saisonnières. Un contact étroit avec les animaux de ferme explique le plus vraisemblablement les associations trouvées. La spécificité d’âge et de saison devrait être considérée dans les études futures sur la campylobactériose et dans l’élaboration de mesures préventives.

Impact de l'agroenvironnement sur la qualité microbiologique des eaux récréatives dans une perspective de santé publique

La pollution microbienne des eaux récréatives peut engendrer un risque pour la santé des populations exposées. La contamination fécale de ces eaux représente une composante importante de ce risque, notamment par la présence possible d’agents pathogènes et par l’exposition à des micro-organismes résistants aux antimicrobiens. Les sources de pollution fécale sont multiples et incluent entre autres les activités agricoles et les productions animales. Ce projet visait donc à mieux comprendre les facteurs influençant la qualité microbiologique des eaux récréatives du Québec méridional, en ciblant le rôle possible des activités agricoles, ainsi qu`à proposer et évaluer de nouvelles sources de données pouvant contribuer à l’identification de ces facteurs. Dans un premier temps, une évaluation de la présence d’Escherichia coli résistants aux antimicrobiens dans les eaux récréatives à l’étude a été effectuée. À la lumière des résultats de cette première étude, ces eaux représenteraient une source de micro-organismes résistants aux antimicrobiens pour les personnes pratiquant des activités aquatiques, mais l’impact en santé publique d’une telle exposition demeure à déterminer. Les déterminants agroenvironnementaux associés à la présence de micro-organismes résistants aux antimicrobiens ont par la suite été explorés. Les résultats de ce chapitre suggèrent que les activités agricoles, et plus spécifiquement l’épandage de fumier liquide, seraient reliées à la contamination des eaux récréatives par des bactéries résistantes aux antimicrobiens. Le chapitre suivant visait à identifier des déterminants agroenvironnementaux temps-indépendants d’importance associés à la contamination fécale des eaux à l’étude. Différentes variables, regroupées en trois classes (activités agricoles, humaines et caractéristiques géohydrologiques), ont été explorées à travers un modèle de régression logistique multivarié. Il en est ressorti que les eaux récréatives ayant des sites de productions de ruminants à proximité, et en particulier à l’intérieur d’un rayon de 2 km, possédaient un risque plus élevé de contamination fécale. Une association positive a également été notée entre le niveau de contamination fécale et le fait que les plages soient situées à l’intérieur d’une zone urbaine. Cette composante nous permet donc de conclure qu’en regard à la santé publique, les eaux récréatives pourraient être contaminées par des sources de pollution fécale tant animales qu’humaines, et que celles-ci pourraient représenter un risque pour la santé des utilisateurs. Pour terminer, un modèle de régression logistique construit à l’aide de données issues de la télédétection et mettant en association un groupe de déterminants agroenvironnementaux et la contamination fécale des eaux récréatives a été mis au point. Ce chapitre visait à évaluer l’utilité de telles données dans l’identification de ces déterminants, de même qu`à discuter des avantages et contraintes associées à leur emploi dans le contexte de la surveillance de la qualité microbiologique des eaux récréatives. À travers cette étude, des associations positives ont été mises en évidence entre le niveau de contamination fécale des eaux et la superficie des terres agricoles adjacentes, de même qu’avec la présence de surfaces imperméables. Les données issues des images d’observation de la Terre pourraient donc constituer une valeur ajoutée pour les programmes de suivi de la qualité microbiologique de ces eaux en permettant une surveillance des déterminants y étant associés.

Facteurs de risque d´introduction et diagnostic de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) est l'agent causal de la paratuberculose, maladie entérique, chronique et incurable des ruminants, avec un impact économique important. Une meilleure compréhension des facteurs de risque associés à l'introduction de la maladie dans un troupeau est essentielle pour sa prévention. L’amélioration des tests diagnostiques est aussi importante pour son contrôle. L’introduction des nouveaux animaux dans le troupeau et la présence et contact des différentes espèces sauvages et domestiques avec les vaches, semblent être des facteurs de risques d’introduction de la maladie. Nous avons réalisé une revue systématique dont l`objective était de recueillir l’information pertinente pour répondre à la question sur l’importance de ces facteurs et leur impact sur l’introduction de la maladie dans un troupeau. D`un autre côté, la détection de MAP dans les fèces par culture bactérienne demeure la méthode diagnostique de choix malgré les facteurs qui l`affectent. Une série de 3 étapes est requise afin de confirmer la présence du MAP : (1) culture (2) coloration, et (3) confirmation du MAP par PCR (si détecté à l´étape 2). Certains échantillons fécaux présentent une particularité en raison de leur forte charge de micro-organismes. Ces contaminants peuvent interférer avec la croissance et la détection de MAP. Une étude visant à : a) estimer l'impact des certain covariables sur les résultats de la culture de MAP parmi l`analyse rétrospective d`un banque des données et b) évaluer la possibilité d'optimiser le processus de diagnostic du MAP en effectuant l'analyse PCR sur les cultures déclarées comme contaminées a été réalisée.

Transmission de Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis dans les troupeaux de bovins laitiers et dépistage de l’infection par la culture de l’environnement au Québec

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) cause la maladie de Johne, une maladie chronique et incurable affectant les ruminants partout dans le monde. Plusieurs pays ont mis en place des programmes de contrôle afin de prévenir la transmission entre et au sein des troupeaux. Afin d’arriver à prévenir et contrôler cette maladie, une bonne compréhension des facteurs de risque impliqués dans la transmission est essentielle. Des tests diagnostiques performants et à coût abordable sont aussi nécessaires afin de détecter la présence du MAP et/ou les animaux infectés. L’objectif de la première étude était de réviser systématiquement la littérature scientifique concernant les facteurs de risque associés à la transmission du MAP aux génisses laitières. La présence d’une association significative entre les facteurs de risque concernant l’environnement néonatal, le colostrum, le lait, le logement des veaux et le contact des veaux avec le fumier de vaches adultes et la transmission du MAP a été compilée de 23 articles. Le contact des veaux avec le fumier de vaches adultes est le facteur de risque le plus important dans la transmission du MAP. L’objectif de la seconde étude était d’évaluer la relation entre le nombre d’échantillons de l’environnement positifs pour le MAP et la prévalence individuelle d’excrétion fécale dans les troupeaux laitiers entravés du Québec. Le nombre de cultures positives d’échantillons de l’environnement s’est avéré associé à la prévalence individuelle d’excrétion fécale du MAP. Une association significative a été trouvée entre la présence d’une forte charge bactérienne dans un échantillon de fumier individuel et la détection du MAP dans l’environnement.

La régulation du gène CYP19A1 dans les cellules de granulosa bovine in vitro

L’oestradiol joue un rôle important dans la reproduction en général, particulièrement dans la croissance folliculaire chez la vache. La production de l’œstradiol nécessite l’expression du gène CYP19A1 suite à la stimulation des cellules de granulosa par l’hormone folliculostimulante (FSH) ou le facteur de croissance insulinique de type 1 (IGF-1). Chez la vache, il existe six promoteurs (1.1 ; 1.2 ; 1.3 ; 1.4 ; 1.5 et 2) qui dirigent la transcription du gène CYP19A1 dans les cellules de la granulosa. Le principal promoteur qui dirige la transcription au niveau de l’ovaire (cellules de granulosa) est le promoteur 2 (P2). Cependant, l’effet de la FSH et de l’IGF-1 sur l’activation de ces promoteurs d’aromatase demeure mal connu. De plus, la demi-vie du transcrit CYP19A1 est très courte avec une région 3’UTR relativement longue. L’analyse de la séquence 3’UTR montre la présence des motifs ARE (séquence riche en AU), des études antérieur montrent que ces séquences impliquent dans la régulation de la stabilité ou la dégradation de l’ARNm, ce qui est fort probable que la courte demi-vie de l’ARNm CYP19A1 est sous le contrôle post-transcriptionel. L’objectif de la thèse visait à étudier la régulation de l’expression du gène CYP19A1 chez la vache. Il y a deux thèmes soit étude de la régulation transcriptionnelle ciblant le promoteur et soit étude de la régulation post-transcriptionnelle impliquant la région 3’non traduite (3’UTR). Le premier objectif vise à étudier la régulation transcriptionnelle du gène CYP19A1. Nous avons étudié l'activité du promoteur ovarien bovin dans deux modèles de cellules de la granulosa, les cellules lutéinisées et nonlutéinisées in vitro, suite à une stimulation des cellules par la FSH ou IGF-1. Nous avons également évalué la voie de signalisation impliquée dans la régulation des différents promoteurs en utilisant un RT-PCR et un gène rapporteur (les différents promoteurs d’aromatase ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en amont du gène exprimant la luciférase). Les résultats de RT-PCR démontrent que la FSH et l’IGF-1 augmentent les concentrations d’ARNm provenant des deux promoteurs 2 et 1.1 dans les cellules de la granulosa non lutéinisées. Des expériences subséquentes ont montré que la FSH stimule le promoteur 2 via la voie PKA tandis que l'IGF-1 stimule le promoteur 2 via la voie PKC. La FSH et l’IGF-1 stimulent l’expression du promoteur 1.1 via la voie PI3K. L’analyse de l’activité luciférase démontre que dans les cellules de granulosa lutéinisées, la FSH stimule le promoteur 1.1 de façon dose dépendante et ne semble y avoir aucun effet significatif sur le promoteur 2. Nous avons donc comparé l’activité du promoteur PII/P2 humain, du rat, de la chèvre et de la vache dans les cellules de granulosa bovine lutéinisées. Le résultat le plus significatif est que le promoteur 2 bovine (et caprine) dépend de plusieurs facteurs de transcription (NR5A2, FOXL2) comparé au promoteur PII humain et celui du promoteur proximal du rat qui dépendent principalement de l'AMPc. En effet, nos résultats ont démontré une expression raisonnablement robuste du P2 bovine lorsque les cellules sont traitées à la forskoline, NR5A2 et FOXL2. Le facteur FOXL2 semble déterminer l'activité du promoteur 2 chez le ruminant. Le deuxième objectif vise à étudier la régulation post-transcriptionnelle du gène CYP19A1. Pour ce faire, nous avons déterminé la séquence minimale de l'ARNm CYP19A1 requise pour la régulation de sa demi-vie. Différents séquences de la région 3’UTR ont été insérés dans le vecteur pGL3promoter en aval du gène exprimant la luciférase ou soit dans le vecteur pGEMTeasy. Le vecteur pGL3promoter a été transfecté dans les cellules de granulosa lutéinisées pour évaluer l'impact de la séquence 3'UTR sur l'expression du gène rapporteur de la luciférase, alors que le vecteur pGEMTeasy a été utilisé pour la transcription in vitro afin de générer de l’ARNm. Ce dernier sera utilisé en réaction croisée au UV avec des extraits protéiques pour démontrer l’association du complexe ARNm/protéine. L’analyse de l’activité luciférase a permis d’identifier une séquence de 200 pb située entre 926 et 1134 pb de la région 3'UTR de l’ARNm CYP19A1 qui a réduit significativement l’activité de la luciférase. Selon les analyses de la réaction croisée au UV, une ou plusieurs protéines de 66 et 80 kDA se lient spécifiquement à la séquence de 200 pb qui réduit l’activité de luciférase. Cette protéine s'exprime dans les cellules de granulosa, mais n’a pas été détectée dans d'autres tissus comme le foie et le cœur. Par ailleurs, l’utilisation du gène rapporteur sensible à la FSH a suscité l’intérêt d'une compagnie pharmaceutique qui vend de l’equine chorionic gonadotropin (eCG) pour lui permettre de distinguer facilement l’eCG ayant une forte activité FSH et donc, avoir un produit commercial plus efficace et de meilleure qualité. Dans cette étude, nous avons développé un système de bioessai à la FSH basé sur la transfection des cellules avec un récepteur à la FSH et un gène rapporteur colorimètrique qui permet d’estimer l’activité de la FSH dans le sérum de la jument et qui pourrait être applicable au niveau de la ferme/industrie.