Étude comparative de l'anatomie des plaies de greffe de cornée par tomographie de cohérence optique (OCT)

Cette thèse porte sur l’étude de l’anatomie de la cornée après 3 techniques de greffe soient, la greffe totale traditionnelle (GTT) et des techniques de greffe lamellaire postérieur (GLP) telles que la greffe lamellaire endothéliale profonde (DLEK) et la greffe endothélium/membrane de Descemet (EDMG) pour le traitement des maladies de l’endothélium, telles que la dystrophie de Fuchs et de la kératopathie de l’aphaque et du pseudophaque. Dans ce contexte, cette thèse contribue également à démontrer l’utilité de la tomographie de cohérence optique (OCT) pour l’étude de l’anatomie des plaies chirurgicales la cornée post transplantation. Au cours de ce travail nous avons étudié l'anatomie de la DLEK, avant et 1, 6, 12 et 24 mois après la chirurgie. Nous avons utilisé le Stratus OCT (Version 3, Carl Zeiss, Meditec Inc.) pour documenter l’anatomie de la plaie. L'acquisition et la manipulation des images du Stratus OCT, instrument qui à été conçu originalement pour l’étude de la rétine et du nerf optique, ont été adaptées pour l'analyse du segment antérieur de l’oeil. Des images cornéennes centrales verticales et horizontales, ainsi que 4 mesures radiaires perpendiculaires à la plaie à 12, 3, 6 et 9 heures ont été obtenues. Les paramètres suivants ont été étudiés: (1) Les espaces (gap) entre les rebords du disque donneur et ceux du receveur, (2) les dénivelés de surface postérieure (step) entre le les rebords du disque donneur et ceux du receveur, (3) la compression tissulaire, (4) le décollement du greffon, 6) les élévations de la surface antérieure de la cornée et 7) la pachymétrie centrale de la cornée. Les mesures d’épaisseur totale de la cornée ont été comparées et corrélées avec celles obtenues avec un pachymètre à ultra-sons. Des mesures d’acuité visuelle, de réfraction manifeste et de topographie ont aussi été acquises afin d’évaluer les résultats fonctionnels. Enfin, nous avons comparé les données de DLEK à celles obtenues de l’EDMG et de la GTT, afin de caractériser les plaies et de cerner les avantages et inconvénients relatifs à chaque technique chirurgicale. Nos résultats anatomiques ont montré des différences importantes entre les trois techniques chirurgicales. Certains des paramètres étudiés, comme le sep et le gap, ont été plus prononcés dans la GTT que dans la DLEK et complètement absents dans l’EDMG. D’autres, comme la compression tissulaire et le décollement du greffon n’ont été observés que dans la DLEK. Ceci laisse entrevoir que la distorsion de la plaie varie proportionnellement à la profondeur de la découpe stromale du receveur, à partir de la face postérieure de la cornée. Moins la découpe s’avance vers la face antérieure (comme dans l’EDMG), moins elle affecte l’intégrité anatomique de la cornée, le pire cas étant la découpe totale comme dans la GTT. Cependant, tous les paramètres d’apposition postérieure sous-optimale et d’élévation de la surface antérieure (ce dernier observé uniquement dans la GTT) finissent par diminuer avec le temps, évoluant à des degrés variables vers un profil topographique plus semblable à celui d’une cornée normale. Ce processus paraît plus long et plus incomplet dans les cas de GTT à cause du type de plaie, de la présence de sutures et de la durée de la cicatrisation. Les valeurs moyennes d’épaisseur centrale se sont normalisées après la chirurgie. De plus, ces valeurs moyennes obtenues par OCT étaient fortement corrélées à celles obtenues par la pachymétrie à ultra-sons et nous n’avons remarqué aucune différence significative entre les valeurs moyennes des deux techniques de mesure. L’OCT s’est avéré un outil utile pour l’étude de l’anatomie microscopique des plaies chirurgicales. Les résultats d’acuité visuelle, de réfraction et de topographie des techniques de GLP ont montré qu’il existe une récupération visuelle rapide et sans changements significatifs de l’astigmatisme, contrairement à la GTT avec et sans suture. La GLP a permis une meilleure conservation de la morphologie de la cornée, et par conséquence des meilleurs résultats fonctionnels que la greffe de pleine épaisseur. Ceci nous permet d’avancer que la GLP pourrait être la technique chirurgicale à adopter comme traitement pour les maladies de l’endothélium cornéen.

Vieillissement vasculaire chez des patients athérosclérotiques: Sénescence prématurée des cellules endothéliales?

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique.

Brain tumor and brain endothelial cells' response to ionizing radiation and phytochemical treatments

Le glioblastome multiforme (GBM) représente la tumeur cérébrale primaire la plus agressive et la plus vascularisée chez l’adulte. La survie médiane après le diagnostic est de moins d’un an en l’absence de traitement. Malheureusement, 90% des patients traités avec de la radiothérapie après la résection chirurgicale d’un GBM développent une récidive tumorale. Récemment, le traitement des GBM avec radiothérapie et témozolomide, un agent reconnu pour ses propriétés antiangiogéniques, a permis de prolonger la survie médiane à 14,6 mois. Des efforts sont déployés pour identifier des substances naturelles capables d’inhiber, de retarder ou de renverser le processus de carcinogenèse. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), un polyphénol retrouvé dans le thé vert, est reconnu pour ses propriétés anticancéreuses et antiangiogéniques. L’EGCG pourrait sensibiliser les cellules tumorales cérébrales et les cellules endothéliales dérivées des tumeurs aux traitements conventionnels. Le chapitre II décrit la première partie de ce projet de doctorat. Nous avons tenté de déterminer si l’EGCG pourrait sensibiliser la réponse des GBM à l’irradiation (IR) et si des marqueurs moléculaires spécifiques sont impliqués. Nous avons documenté que les cellules U-87 étaient relativement radiorésistantes et que Survivin, une protéine inhibitrice de l’apoptose, pourrait être impliquée dans la radiorésistance des GBM. Aussi, nous avons démontré que le pré-traitement des cellules U-87 avec de l’EGCG pourrait annuler l’effet cytoprotecteur d’une surexpression de Survivin et potentialiser l’effet cytoréducteur de l’IR. Au chapitre III, nous avons caractérisé l’impact de l’IR sur la survie de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines (HBMEC) et nous avons déterminé si l’EGCG pouvait optimiser cet effet. Bien que les traitements individuels avec l’EGCG et l’IR diminuaient la survie des HBMEC, le traitement combiné diminuait de façon synergique la survie cellulaire. Nous avons documenté que le traitement combiné augmentait la mort cellulaire, plus spécifiquement la nécrose. Au chapitre IV, nous avons investigué l’impact de l’IR sur les fonctions angiogéniques des HBMEC résistantes à l’IR, notamment la prolifération cellulaire, la migration cellulaire en présence de facteurs de croissance dérivés des tumeurs cérébrales, et la capacité de tubulogenèse. La voie de signalisation des Rho a aussi été étudiée en relation avec les propriétés angiogéniques des HBMEC radiorésistantes. Nos données suggèrent que l’IR altère significativement les propriétés angiogéniques des HBMEC. La réponse aux facteurs importants pour la croissance tumorale et l’angiogenèse ainsi que la tubulogenèse sont atténuées dans ces cellules. En conclusion, ce projet de doctorat confirme les propriétés cytoréductrices de l’IR sur les gliomes malins et propose un nouveau mécanisme pour expliquer la radiorésistance des GBM. Ce projet documente pour la première fois l’effet cytotoxique de l’IR sur les HBMEC. Aussi, ce projet reconnaît l’existence de HBMEC radiorésistantes et caractérise leurs fonctions angiogéniques altérées. La combinaison de molécules naturelles anticancéreuses et antiangiogéniques telles que l’EGCG avec de la radiothérapie pourrait améliorer l’effet de l’IR sur les cellules tumorales et sur les cellules endothéliales associées, possiblement en augmentant la mort cellulaire. Cette thèse supporte l’intégration de nutriments avec propriétés anticancéreuses et antiangiogéniques dans le traitement des gliomes malins pour sensibiliser les cellules tumorales et endothéliales aux traitements conventionnels.

Reactive Hyperemia as endothelial function determinant using plethysmography methods

L’atteinte de la fonction endothéliale représente une phase précoce de l’athérosclérose, un stade où les patients sont généralement asymptomatiques. Il existe donc un intérêt certain à détecter la dysfonction endothéliale. Nous avons développé une technique de mesure des variations de flot artériel au niveau des membres supérieurs, basée sur la spectroscopie proche infrarouge (NIRS). Cette approche permettrait d’étudier le niveau d’atteinte vasculaire et probablement de quantifier le degré de dysfonction endothéliale périphérique lors d’une hyperémie réactive. L'expérience a été exécutée sur deux cohortes de 13 et de 15 patients et a été comparée à la pléthysmographie par jauge de contrainte (SGP) qui est considérée comme une méthode de référence. Par la suite, nous avons caractérisé la réponse endothéliale par modélisation de la courbe hyperémique du flot artériel. Des études préliminaires avaient démontré que la réponse hyperémique adoptait majoritairement une forme bi-modale. Nous avons tenté de séparer les composantes endothéliales-dépendantes et endothéliales-indépendantes de l’hyperémie. La quantification des deux composantes de la réaction hyperémique permet de calculer un indice de la ‘santé’ du système endothélial local. Cet indice est nommé le ηfactor. Les résultats montrent une forte corrélation des mesures de flots entre la technique développée et la méthode de référence (r=0.91). Nous avons conclu que NIRS est une approche précise pour la mesure non-invasive du flot artériel. Nous avons obtenu une bonne répétabilité (ICC = 0.9313) pour le ηfactor indiquant sa robustesse. Cependant des études supplémentaires sont nécessaires pour valider la valeur de diagnostic du facteur défini. Mots clés: hyperémie réactive, réponse myogénique, oxyde nitrique, athérosclérose, spectroscopie proche infrarouge

Revêtement anti-apoptotique à base de chondroïtine sulfate : vers un stent-graft bioactif

La réparation endovasculaire (EVAR) est une technique minimalement invasive permettant de traiter l’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) par l’entremise d’un stent- graft (SG). L’utilisation d’EVAR est actuellement limitée par de fréquentes complications liées à une guérison inadéquate autour de l’implant. Ce manque de guérison est principalement dû au type de recouvrement polymérique des SG, au milieu pro-apoptotique des AAA et à l’accès réduit aux nutriments et à l’oxygène après EVAR. L’objectif de cette thèse consistait à concevoir un revêtement bioactif permettant d’inhiber l’apoptose et stimuler la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), pour ainsi favoriser la guérison des tissus vasculaires autour des SG. La chondroïtine-4-sulfate (CS) a d’abord été choisie, car elle a été identifiée comme un médiateur important de la réparation vasculaire. Il a été démontré que la CS en solution influence directement la résistance à l’apoptose des CMLV, en plus de favoriser la différenciation myofibroblastique chez les fibroblastes. Dans le cadre de ce projet, un premier revêtement à base de CS et de collagène a été créé. Bien que le revêtement permettait d’induire une résistance à l’apoptose chez les CMLV, il se désintégrait trop rapidement dans des conditions aqueuses. Une nouvelle méthodologie a donc été adaptée afin de greffer la CS directement sur des surfaces aminées, à l’aide d’un système utilisant un carbodiimide. Dans le but d’accroître la croissance des CMLV à la surface des revêtements, le facteur de croissance de l’épiderme (EGF) a ensuite été sélectionné. En plus de ses propriétés mitogéniques et chimiotactiques, l’EGF stimule la production d’éléments de la matrice extracellulaire, comme le collagène et la fibronectine. De plus, l’activation du récepteur de l’EGF inhibe également l’apoptose des CMLV. L’EGF a donc été greffé sur la CS. Le revêtement de CS+EGF a démontré une bonne uniformité et bioactivité sur des surfaces de verre aminé. iii iv Dans une 3ème étape, afin de permettre de transposer ce revêtement bioactif sur des implants, plusieurs méthodes permettant de créer des groupements d’amines primaires sur les biomatériaux polymériques comme le PET ou le ePTFE ont été étudiées. La polymérisation par plasma a été choisie pour créer le revêtement CS+EGF à la surface de PET. Une fois de plus, celui-ci a permis d’inhiber l’apoptose des CMLV, dans des conditions pro-apoptotiques, et de favoriser la croissance des cellules. Le revêtement de CS et d’EGF, déposé sur des surfaces aminées, possède des caractéristiques biologiques intéressantes et semble donc prometteur pour favoriser une meilleure guérison autour des SG.

Role of the protein tyrosine phosphatase DEP-1 in Src activation and the mediation of biological cell functions of endothelial and breast cancer cells

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer.

Le fragment LG3 du perlécan : un nouveau régulateur de remodelage vasculaire en transplantation

L’apoptose endothéliale initie le processus menant au remodelage vasculaire et au développement de la néointima dans la vasculopathie du greffon. La formation de néointima résulte de l’accumulation de leucocytes, de matrice extracellulaire et de cellules positives pour l’actine musculaire lisse alpha (αSMA+) dans l’intima des artères, artérioles et capillaires du greffon. Les cellules αSMA+ dans la néointima sont des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) dérivées du donneur ainsi que des cellules souches dérivées du receveur, dont des cellules souches mésenchymateuses (CSM). L’acquisition d’un phénotype anti-apoptotique chez ces cellules est déterminante pour le développement de la néointima. Le laboratoire de Dre Hébert a démontré que les cellules endothéliales (CE) apoptotiques libèrent des médiateurs induisant une résistance à l’apoptose chez les CMLV et les fibroblastes. Notamment, les CE apoptotiques relâchent la cathepsine L qui clive le perlécan et ainsi libère un fragment C-terminal correspondant au troisième motif laminine G du domaine V du perlécan (LG3). Le LG3 est anti-apoptotique pour les fibroblastes. Nous avons donc émis l’hypothèse que le LG3 est un des médiateurs clés libéré par les CE apoptotiques favorisant le développement de la néointima via l’induction d’un phénotype anti-apoptotique chez les cellules néointimales αSMA+. Nous avons démontré que les médiateurs libérés par les CE apoptotiques induisent un phénotype anti-apoptotique chez les CSM dépendant de l’activation de la voie ERK1/2. De plus, le LG3 active la voie ERK1/2 via son interaction avec les intégrines beta 1 et induit une réponse anti-apoptotique chez ces cellules. Cependant l’activation de ERK1/2 par le LG3 est plus faible en comparaison de son activation par le milieu conditionné par des CE apoptotiques. Nos résultats suggèrent que les CE apoptotiques libèrent aussi de l’EGF qui agit de façon paracrine sur les CSM en coopération avec le LG3 pour induire un phénotype anti-apoptotique chez les CSM. Nous avons poursuivi l’étude de l’effet du LG3 in vivo sur le remodelage vasculaire en transplantation. Nous avons pour cela développé un modèle murin de rejet vasculaire qui consiste en une transplantation aortique entre des souris alloincompatibles. Nous avons ensuite injecté du LG3 chez les souris receveuses en post-transplantation. Nous avons observé dans ce modèle que des niveaux augmentés de LG3 sérique augmentent la formation de néointima, favorisent l’accumulation de cellules néointimales αSMA+ et diminuent le nombre de cellules CD31+ au niveau du greffon aortique. Parallèlement nous avons vérifié que le LG3 induit aussi un phénotype anti-apoptotique chez les CMLV et nous avons démontré un nouvel effet du LG3, soit une activité pro-migratoire, qui dépend de l’activation de la voie ERK1/2 chez les CMLV. Nous avons complété cette étude par l’analyse des niveaux de LG3 sérique dans une cohorte de patients receveurs d’allogreffe rénale. Nous avons observé chez ces patients, une association entre des niveaux élevés de LG3 sérique et un rejet vasculaire. Le LG3 contribue à la formation de néointima par son activité pro-migratoire et pro-survie chez les cellules néointimales et aussi de par son activité angiostatique. Nos résultats suggèrent que le LG3 est un nouveau médiateur important dans le remodelage vasculaire en transplantation

Regenerative potential of corneal endothelium from patients with fuchs endothelial corneal dystrophy

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques.

Exploration du rôle du fragment LG3 sur les cellules souches mésenchymateuses dans le contexte du rejet vasculaire

La vasculopathie du greffon est une pathologie caractérisée par un rétrécissement progressif et oblitérant des vaisseaux sanguins menant à une ischémie et une perte de fonction du greffon. Le rétrécissement vasculaire est dû à une accumulation de matrice extracellulaire (MEC) et de cellules mononuclées positives pour l’actine musculaire lisse alpha (alphaSMA) dont les cellules souches mésenchymateuses, le tout formant une néointima oblitérante. Cette pathologie est la cause principale de la perte des greffons rénaux et cardiaques à long terme. Le rejet vasculaire aigu est un prédicteur de la vasculopathie du greffon. L’équipe du Dr Hébert a démontré que l’apoptose endothéliale, qui joue un rôle important dans le développement du rejet vasculaire, initie la libération de LG3, un fragment du protéoglycan perlécan. Les taux sanguins et urinaires de LG3 sont augmentés chez les receveurs d’allogreffe rénale avec rejet vasculaire et vasculopathie du greffon. Les résultats obtenus en laboratoire durant ma maîtrise ont permis de mieux caractériser l’impact du LG3 sur un type cellulaire important participant à la formation de néointima : les cellules souches mésenchymateuses. Mes travaux ont démontré que le LG3 induit à la fois la migration horizontale des MSC et la transmigration des MSC. Cette migration est dépendante de la voie de signalisation d’ERK1/2, précédemment identifiée comme voie centrale dans la formation de néointima. De plus, nos résultats démontrent que la kinase Src est activée en amont de l’activation de la voie MAPK. La migration horizontale et la transmigration induites par le LG3 sont aussi dépendantes des intégrines alpha2beta1, ainsi que l’activation de la voie MAPK. Dans un modèle de transplantation murin, nous avons également démontré que l’injection sérique de LG3 recombinant favorise l’accumulation de cellules positives pour alphaSMA dans la néointima. En outre, lorsque le receveur est déficient pour l’intégrine alpha2, mais que le greffon est sauvage, la formation de néointima induite par l’injection de LG3 est diminuée dans le greffon suggérant que les cellules du receveur jouent un rôle important dans la formation de la néointima. Enfin, nous avons démontré que l’injection de LG3 augmente aussi le nombre de cellules positives pour la forme phosphorylée d’ERK1/2 (p-ERK1/2) dans la néointima du greffon et que cette accumulation est dépendante de la présence des intégrines 2 1 chez les cellules du receveur.Lorsque le receveur est sauvage, il y a une augmentation du nombre de cellules positives pour p-ERK1/2. L’investigation de ces mécanismes dans le remodelage vasculaire expose de nouvelles opportunités pour inhiber la réponse cellulaire qui mène au remodelage inadapté lors d’un dommage vasculaire chronique et ainsi prolonger la survie du greffon.

The effects of administration of a nuclear factor kappa-B inhibitor on pulmonary endothelial dysfunction after cardiopulmonary bypass: impact on oxygenation and hemodynamics and development of therapeutic and preventive modalities in a porcine model

Introduction: La circulation extracorporelle (CEC) peut entraîner une dysfonction endothéliale pulmonaire et l’hypertension pulmonaire. Le SN50 agit au niveau de la signalisation cellulaire pour prévenir ces réactions à la CEC et pourrait renverser la dysfonction endothéliale pulmonaire post-CEC sans effets néfastes sur l’hémodynamie. Méthodes: Quatre groups de porcs ont reçu un parmi quatre traîtements avant de subir 90 minutes de CEC et 60 minutes de reperfusion: (1) milrinone nébulisé; (2) sildenafil nébulisé; (3) placebo nébulisé; et (4) SN-50 intraveineux. Un monitoring hémodynamique invasif a été utilisé. La réactivité vasculaire des artères pulmonaires de deuxième ordre a été évaluée face à l’acétylcholine et la bradykinine. Résultats: Le sildénafil produit une augmentation significative de la pression de l’artère pulmonaire (PAP) moyenne à 60 minutes de reperfusion par rapport au début de la chirurgie. Les relaxations dépendantes de l’endothélium face à la bradykinine étaient meilleurs dans les groupes milrinone et SN-50 et surtout dans le groupe sildénafil par rapport au groupe placébo. Le SN-50 produisait de moins bonnes relaxations dépendantes de l’endothélium face à l’acétylcholine que les autres traitements incluant placébo. Conclusion: Le sildénafil prévient mieux la dysfonction endothéliale pulmonaire que les autres traitements. Les bénéfices du SN-50 sont possiblement sous-estimés vu que la dose n’a pas pu être ajustée à la durée de CEC. Le sildenafil inhalé mérite une étude plus importante chez l’humain et le SN-50 dans un model de CEC animal.

Angiopoietin like-2: a pro-inflammatory and pro-oxidative protein that contributes to endothelial dysfunction

Le vieillissement vasculaire est caractérisé par une dysfonction de l’endothélium. De nombreux facteurs de risque cardiovasculaire tels que l’obésité et l’hypertension prédisposent l’endothélium à un stress oxydant élevé aboutissant à une dysfonction endothéliale, celle-ci étant communément accompagnée d’une diminution de la biodisponibilité du monoxyde d’azote. Bien que la fonction endothéliale soit un déterminant majeur de la prédiction du risque cardiovasculaire des patients, son évaluation individuelle reste très limitée. En conséquence, il existe un intérêt scientifique grandissant pour la recherche de meilleurs biomarqueurs. L’Angiopoiétine like-2 (angptl2), une protéine identifiée récemment, joue un rôle pro-inflammatoire et pro-oxydant dans plusieurs désordres causés par une inflammation chronique allant de l’obésité à l’athérosclérose. L’inflammation et un stress oxydant accru ont été établis comme des mécanismes sous-jacents à l’apparition d’une dysfonction endothéliale, c’est pourquoi ce travail met l’accent sur le rôle de l’angptl2 dans la dysfonction endothéliale. Plus précisément, ce travail vise à: 1) déterminer les effets aigus de l’angptl2 sur la fonction endothéliale, 2) caractériser la fonction endothéliale et la contribution des différents facteurs relaxants dérivés de l'endothélium (EDRF) dans plusieurs lits vasculaires, et ce, dans un modèle de souris réprimant l’expression de l’angptl2 (knock-down, KD), et 3) examiner si l'absence d'expression angptl2 protège contre la dysfonction endothéliale induite par un régime riche en graisses (HFD) ou par perfusion d'angiotensine II (angII) chez la souris. Dans la première étude, l’incubation aigue avec de l’angptl2 recombinante induit une dysfonction endothéliale dans les artères fémorales isolées de souris de type sauvage (WT), probablement en raison d’une production accrue d'espèces réactives oxygénées. Les artères fémorales de souris angptl2 KD présentent une meilleure fonction endothéliale en comparaison aux souris WT, vraisemblablement par une plus grande contribution de la prostacycline dans la vasodilatation. Après 3 mois d’une diète HFD, les principaux EDRF respectifs des artères fémorales et mésentériques sont conservés uniquement dans les souris angptl2 KD. Cette préservation est associée à un meilleur profil métabolique, une moindre accumulation de triglycérides dans le foie et des adipocytes de plus petite taille. De plus, l’expression de gènes inflammatoires dans ces tissus adipeux n’est augmentée que chez les souris WT. Dans la seconde étude, l’absence d’angptl2 résulte en une production accrue de monoxyde d’azote dans les artères cérébrales isolées par rapport à celles des souris WT. La perfusion chronique d’angII provoque, seulement chez les souris WT, une dysfonction endothéliale cérébrale probablement par le biais d’une augmentation de la production d’espèces réactives oxygénées, probablement dérivé des NADPH oxydase 1 et 2, ainsi que l'augmentation des facteurs constricteurs dérivés de l’endothélium issus de la cyclo-oxygénase. En revanche, l’apocynine réduit la dilatation cérébrale chez les souris KD traitées à l’angII, ce qui suggère le recrutement potentiel d’une voie de signalisation compensatoire impliquant les NADPH oxydases et qui aurait un effet vaso-dilatateur. Ces études suggèrent fortement que l’angptl2 peut avoir un impact direct sur la fonction endothéliale par ses propriétés pro-inflammatoire et pro-oxydante. Dans une optique d’application à la pratique clinique, les niveaux sanguins d’angptl2 pourraient être un bon indicateur de la fonction endothéliale.