Impact de l'haploinsuffisance du gène Sim1 sur le développement et la fonction du noyau paraventriculaire de l'hypothalamus

L’obésité provient d’un déséquilibre de l’homéostasie énergétique, c’est-à-dire une augmentation des apports caloriques et/ou une diminution des dépenses énergétiques. Plusieurs données, autant anatomiques que physiologiques, démontrent que l’hypothalamus est un régulateur critique de l’appétit et des dépenses énergétiques. En particulier, le noyau paraventriculaire (noyau PV) de l’hypothalamus intègre plusieurs signaux provenant du système nerveux central (SNC) et/ou de la périphérie, afin de contrôler l’homéostasie énergétique via des projections axonales sur les neurones pré-ganglionnaires du système autonome situé dans le troc cérébral et la moelle épinière. Plusieurs facteurs de transcription, impliqués dans le développement du noyau PV, ont été identifiés. Le facteur de transcription SIM1, qui est produit par virtuellement tous les neurones du noyau PV, est requis pour le développement du noyau PV. En effet, lors d’une étude antérieure, nous avons montré que le noyau PV ne se développe pas chez les souris homozygotes pour un allèle nul de Sim1. Ces souris meurent à la naissance, probablement à cause des anomalies du noyau PV. Par contre, les souris hétérozygotes survivent, mais développent une obésité précoce. De façon intéressante, le noyau PV des souris Sim1+/- est hypodéveloppé, contenant 24% moins de cellules. Ces données suggèrent fortement que ces anomalies du développement pourraient perturber le fonctionnement du noyau PV et contribuer au développement du phénotype d’obésité. Dans ce contexte, nous avons entrepris des travaux expérimentaux ayant pour but d’étudier l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur : 1) le développement du noyau PV et de ses projections neuronales efférentes; 2) l’homéostasie énergétique; et 3) les voies neuronales physiologiques contrôlant l’homéostasie énergétique chez les souris Sim1+/-. A cette fin, nous avons utilisé : 1) des injections stéréotaxiques combinées à des techniques d’immunohistochimie afin de déterminer l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur le développement du noyau PV et de ses projections neuronales efférentes; 2) le paradigme des apports caloriques pairés, afin de déterminer l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur l’homéostasie énergétique; et 3) une approche pharmacologique, c’est-à-dire l’administration intra- cérébroventriculaire (i.c.v.) et/ou intra-péritonéale (i.p.) de peptides anorexigènes, la mélanotane II (MTII), la leptine et la cholécystokinine (CCK), afin de déterminer l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur les voies neuronales contrôlant l’homéostasie énergétique. Dans un premier temps, nous avons constaté une diminution de 61% et de 65% de l’expression de l’ARN messager (ARNm) de l’ocytocine (Ot) et de l’arginine-vasopressine (Vp), respectivement, chez les embryons Sim1+/- de 18.5 jours (E18.5). De plus, le nombre de cellules produisant l’OT et la VP est apparu diminué de 84% et 41%, respectivement, chez les souris Sim1+/- adultes. L’analyse du marquage axonal rétrograde des efférences du noyau PV vers le tronc cérébral, en particulier ses projections sur le noyau tractus solitaire (NTS) aussi que le noyau dorsal moteur du nerf vague (X) (DMV), a permis de démontrer une diminution de 74% de ces efférences. Cependant, la composition moléculaire de ces projections neuronales reste inconnue. Nos résultats indiquent que l’haploinsuffisance de Sim1 : i) perturbe spécifiquement le développement des cellules produisant l’OT et la VP; et ii) abolit le développement d’une portion importante des projections du noyau PV sur le tronc cérébral, et notamment ses projections sur le NTS et le DMV. Ces observations soulèvent donc la possibilité que ces anomalies du développement du noyau PV contribuent au phénotype d’hyperphagie des souris Sim1+/-. En second lieu, nous avons observé que la croissance pondérale des souris Sim1+/- et des souris Sim1+/+ n’était pas significativement différente lorsque la quantité de calories présentée aux souris Sim1+/- était la même que celle consommée par les souris Sim1+/+. De plus, l’analyse qualitative et quantitative des tissus adipeux blancs et des tissus adipeux bruns n’a démontré aucune différence significative en ce qui a trait à la taille et à la masse de ces tissus chez les deux groupes. Finalement, au terme de ces expériences, les souris Sim1+/--pairées n’étaient pas différentes des souris Sim1+/+ en ce qui a trait à leur insulinémie et leur contenu en triglycérides du foie et des masses adipeuses, alors que tous ces paramètres étaient augmentés chez les souris Sim1+/- nourries ad libitum. Ces résultats laissent croire que l’hyperphagie, et non une diminution des dépenses énergétiques, est la cause principale de l’obésité des souris Sim1+/-. Par conséquent, ces résultats suggèrent que : i) l’haploinsuffisance de Sim1 est associée à une augmentation de l’apport calorique sans toutefois moduler les dépenses énergétiques; ii) l’existence d’au moins deux voies neuronales issues du noyau PV : l’une qui régule la prise alimentaire et l’autre la thermogénèse; et iii) l’haploinsuffisance de Sim1 affecte spécifiquement la voie neuronale qui régule la prise alimentaire. En dernier lieu, nous avons montré que l’injection de MTII, de leptine ainsi que de CCK induit une diminution significative de la consommation calorique des souris des deux génotypes, Sim1+/+ et Sim1+/-. De fait, la consommation calorique cumulative des souris Sim1+/- et Sim1+/+ est diminuée de 37% et de 51%, respectivement, durant les 4 heures suivant l’administration i.p. de MTII comparativement à l’administration d’une solution saline. Lors de l’administration i.c.v. de la leptine, la consommation calorique cumulative des souris Sim1+/- et Sim1+/+ est diminuée de 47% et de 32%, respectivement. Finalement, l’injection i.p. de CCK diminue la consommation calorique des souris Sim1+/- et Sim1+/+ de 52% et de 36%, respectivement. L’ensemble des résultats suggère ici que l’haploinsuffisance de Sim1 diminue l’activité de certaines voies neuronales régulant l’homéostasie énergétique, et particulièrement de celles qui contrôlent la prise alimentaire. En résumé, ces travaux ont montré que l’haploinsuffisance de Sim1 affecte plusieurs processus du développement au sein du noyau PV. Ces anomalies du développement peuvent conduire à des dysfonctions de certains processus physiologiques distincts régulés par le noyau PV, et notamment de la prise alimentaire, et contribuer ainsi au phénotype d’obésité. Les souris hétérozygotes pour le gène Sim1 représentent donc un modèle animal unique, où l’hyperphagie, et non les dépenses énergétiques, est la principale cause de l’obésité. En conséquence, ces souris pourraient représenter un modèle expérimental intéressant pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires en contrôle de la prise alimentaire.

Le diabète maternel influence la morphogenèse rénale et la programmation périnatale

Le diabète maternel est un facteur de risque majeur pour le développement de malformations congénitales. Dans le syndrome de l’embryopathie diabétique, l’exposition prolongée du fœtus à de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rénales sont la cause de près de 40 pourcent des cas d’insuffisance rénale infantile. L’hyperglycémie constitue un environnement utérin adverse qui nuit à la néphrogenèse et peut causer l’agenèse, la dysplasie (aplasie) ou l’hypoplasie rénale. Les mécanismes moléculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mènent à la dysmorphogenèse et aux malformations demeurent toutefois mal définis. Le diabète maternel prédispose aussi la progéniture au développement d’autres problèmes à l’âge adulte, tels l’hypertension, l’obésité et le diabète de type 2. Ce phénomène appelé ‘programmation périnatale’ a suscité l’intérêt au cours des dernières décennies, mais les mécanismes responsables demeurent mal compris. Mes études doctorales visaient à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le diabète maternel ou un environnement in utero hyperglycémique affecte la néphrogenèse et programme par la suite la progéniture a développer de l’hypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilisé les cellules MK4, des cellules embryonnaires du mésenchyme métanéphrique de souris, pour nos études in vitro et deux lignées de souris transgéniques (Tg) pour nos études ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urétérique (UB), sous le contrôle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) dans les glomérules, sous le contrôle du promoteur nephrin spécifique aux podocytes. Nos études in vitro visaient à déterminer si les hautes concentrations de glucose modulent l’expression du gène Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont été traitées pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos résultats ont démontré que le D-glucose élevé (25mM) augmente la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules MK4 et induit spécifiquement l’expression du gène Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose n’induisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de l’expression du gène Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’expression du gène Pax2 par les concentrations élevées de glucose est due, au moins en partie, à la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos études ex vivo s’intéressaient aux effets d’un milieu hyperglycémique sur la morphogenèse de la ramification du bourgeon urétérique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 à E18) ont été prélevés par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite été cultivés dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses durées. Nos résultats ont démontré que le D-glucose stimule la ramification du UB de manière spécifique, et ce via l’expression du gène Pax2. Cette augmentation de la ramification et de l’expression du gène Pax2 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces études ont démontré que les hautes concentrations de glucose altèrent la morphogenèse de la ramification du UB via l’expression de Pax2. L’effet stimulant du glucose semble s’effectuer via la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation Akt. Nos études in vivo visaient à déterminer le rôle fondamental du diabète maternel sur les défauts de morphogenèse rénale chez la progéniture. Dans notre modèle animal, le diabète maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont été étudiés à différents âges (naissants et âgés de une, deux ou trois semaines). Nous avons examiné leurs morphologie rénale, nombre de néphrons, expression génique et les événements apoptotiques lors de cette étude à court terme. La progéniture des mères diabétiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possédait des glomérules plus petits et moins de néphrons par rapport à la progéniture des mères contrôles. La dysmorphogenèse rénale observée est peut-être causée par l’augmentation de l’apoptose des cellules dans la région du glomérule. Nos résultats ont montré que les souriceaux nés de mères diabétiques possèdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rénaux que la progéniture des mères contrôles. Les souriceaux des mères diabétiques montrent une augmentation de l’expression des composants du système rénine angiotensine (RAS) intrarénal comme l’angiotensinogène et la rénine, ainsi qu’une augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces résultats indiquent que le diabète maternel active le RAS intrarénal et induit l’apoptose des glomérules, menant à une altération de la morphogenèse rénale de la progéniture. En conclusion, nos études ont permis de démontrer que le glucose élevé ou l’environnement in utero diabétique altère la morphogenèse du UB, qui résulte en un retard dans la néphrogenèse et produit des reins plus petits. Cet effet est dû, au moins en partie, à la génération des ROS, à l’activation du RAS intrarénal et à la voie NF-kB. Nos études futures se concentreront sur les mécanismes par lesquels le diabète maternel induit la programmation périnatale de l’hypertension chez la progéniture adulte. Cette étude à long terme porte sur trois types de progénitures : adultes nés de mères contrôles, diabétiques ou diabétiques traitées avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rénale et l’expression de divers gènes et protéines. Nous voulons de plus déterminer si la présence d’un système antioxydant (catalase) peut protéger la progéniture des effets néfastes des ROS causés par l’environnement in utero hyperglycémique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spécifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons d’explorer notre hypothèse sur le rôle des ROS dans notre modèle expérimental de diabète maternel.