Caractérisation de la pharmacocinétique de formulations sensibles au pH et de formulations destinées au traitement des intoxications médicamenteuses

La préparation de formulations à libération contrôlée est le domaine des sciences pharmaceutiques qui vise à modifier l’environnement immédiat des principes actifs pour en améliorer l’efficacité et l’innocuité. Cet objectif peut être atteint en modifiant la cinétique de circulation dans le sang ou la distribution dans l’organisme. Le but de ce projet de recherche était d’étudier le profil pharmacocinétique (PK) de différentes formulations liposomales. L’analyse PK, généralement employée pour représenter et prédire les concentrations plasmatiques des médicaments et de leurs métabolites, a été utilisée ici pour caractériser in vivo des formulations sensibles au pH servant à modifier la distribution intracellulaire de principes actifs ainsi que des liposomes destinés au traitement des intoxications médicamenteuses. Dans un premier temps, la PK d’un copolymère sensible au pH, à base de N-isopropylacrylamide (NIPAM) et d’acide méthacrylique (MAA) a été étudiée. Ce dernier, le p(NIPAM-co-MAA) est utilisé dans notre laboratoire pour la fabrication de liposomes sensibles au pH. L’étude de PK conduite sur les profils de concentrations sanguines de différents polymères a défini les caractéristiques influençant la circulation des macromolécules dans l’organisme. La taille des molécules, leur point de trouble ainsi que la présence d’un segment hydrophobe à l’extrémité des chaînes se sont avérés déterminants. Le seuil de filtration glomérulaire du polymère a été évalué à 32 000 g/mol. Finalement, l’analyse PK a permis de s’assurer que les complexes formés par la fixation du polymère à la surface des liposomes restaient stables dans le sang, après injection par voie intraveineuse. Ces données ont établi qu’il était possible de synthétiser un polymère pouvant être adéquatement éliminé par filtration rénale et que les liposomes sensibles au pH préparés avec celui-ci demeuraient intacts dans l’organisme. En second lieu, l’analyse PK a été utilisée dans le développement de liposomes possédant un gradient de pH transmembranaire pour le traitement des intoxications médicamenteuses. Une formulation a été développée et optimisée in vitro pour capturer un médicament modèle, le diltiazem (DTZ). La formulation liposomale s’est avérée 40 fois plus performante que les émulsions lipidiques utilisées en clinique. L’analyse PK des liposomes a permis de confirmer la stabilité de la formulation in vivo et d’analyser l’influence des liposomes sur la circulation plasmatique du DTZ et de son principal métabolite, le desacétyldiltiazem (DAD). Il a été démontré que les liposomes étaient capables de capturer et de séquestrer le principe actif dans la circulation sanguine lorsque celui-ci était administré, par la voie intraveineuse. L’injection des liposomes 2 minutes avant l’administration du DTZ augmentait significativement l’aire sous la courbe du DTZ et du DAD tout en diminuant leur clairance plasmatique et leur volume de distribution. L’effet de ces modifications PK sur l’activité pharmacologique du médicament a ensuite été évalué. Les liposomes ont diminué l’effet hypotenseur du principe actif administré en bolus ou en perfusion sur une période d’une heure. Au cours de ces travaux, l’analyse PK a servi à établir la preuve de concept que des liposomes possédant un gradient de pH transmembranaire pouvaient modifier la PK d’un médicament cardiovasculaire et en diminuer l’activité pharmacologique. Ces résultats serviront de base pour le développement de la formulation destinée au traitement des intoxications médicamenteuses. Ce travail souligne la pertinence d’utiliser l’analyse PK dans la mise au point de vecteurs pharmaceutiques destinés à des applications variées. À ce stade de développement, l’aspect prédictif de l’analyse n’a pas été exploité, mais le côté descriptif a permis de comparer adéquatement diverses formulations et de tirer des conclusions pertinentes quant à leur devenir dans l’organisme.

Évaluation de la fréquence des micronoyaux et du potentiel clastogène et/ou aneugène du benzo-a-pyrène suite à une exposition in vitro des lymphocytes humains

Le benzo-a-pyrène (BaP) est un cancérogène reconnu pour l'homme, contaminant présent dans notre environnement. Il cause des dommages à l'ADN que nous avons mesurés dans les lymphocytes exposés à de faibles concentrations de BaP, provenant de 20 jeunes volontaires non fumeurs et en santé. Suite à l’exposition, la fréquence des micronoyaux (MN) augmente significativement et décrit une courbe dose-réponse non linéaire, suggérant le déclenchement du processus de détoxification et la réparation de l’ADN. Des différences entre les individus et entre les sexes sont présentes dans la réponse génotoxique produite par le BaP. Le test des aberrations chromosomiques montre que le pourcentage de chromosomes cassés augmente significativement dans les cellules exposées au BaP. Combinés avec l'augmentation de la fréquence des MN, nos résultats confirment l'effet clastogène du BaP déjà rapporté dans la littérature. L’hybridation in situ en fluorescence (FISH) des MN avec une sonde pancentromérique est aussi utilisée pour établir leur mécanisme de formation. La FISH révèle que la majorité des MN formés après une exposition au BaP contient un centromère et plus, ce qui est significativement différent de la condition non exposée. Plus précisément, dans nos conditions expérimentales, les MN induits par le BaP contiennent surtout trois centromères et plus, indiquant également la présence d'un effet aneugène. L'effet clastogène du BaP est relié à son rôle d'initiateur dans la cancérogenèse, alors que l'effet aneugène le relierait à l'étape de progression. Ces résultats sont importants puisque l'exposition aux composés de la classe du BaP est de longue durée (cigarette, air pollué).

La quétiapine dans le traitement des troubles liés à l’utilisation de substances psychoactives.

Contexte Les troubles liés à l’utilisation de substances psychoactives (TUS) sont associés à une variété de troubles psychiatriques entre autre une instabilité comportementale et affective. Plusieurs études suggèrent que les antipsychotiques atypiques peuvent être utiles dans le traitement de la toxicomanie. L’objectif principal de la présente étude à devis ouvert est d’évaluer l’efficacité de la quétiapine sur les variables reliés à la toxicomanie chez des poly-toxicomanes sans psychose comorbide entrant en désintoxication. Méthodes Dans le cadre d’une étude pharmacologique à devis ouvert d’une durée de 12 semaines, trente-trois polytoxicomanes entrant en désintoxication et répondant à un ou plusieurs critères d’abus/dépendance à une substance du DSM-IV ont été recrutés. Les patients présentant un autre trouble comorbide à l’Axe I ont été exclus. Les envies de consommer, les quantités consommées, les jours de consommation ainsi que la sévérité de la toxicomanie ont été évalués au point de départ (semaine 0) et à la fin de l’étude (semaine 12). Les symptômes psychiatriques et dépressifs furent aussi évalués. Résultats 26 des 33 patients complétèrent plus de 9 semaines de traitement. Les résultats relatifs à la dernière observation reportée (LOCF) ont montré une amélioration significative des envies de consommer, des quantités consommées, des jours de consommation, de la sévérité de la toxicomanie et des symptômes psychiatriques et dépressifs. Conclusions Nos résultats ne peuvent être attribués en soi aux effets pharmacologiques de la quétiapine, et ce compte tenu d’abord du type d’étude à devis ouvert à laquelle nous avons procédée, ainsi que le petit nombre de sujets impliqués et enfin le fait que les participants étaient impliqués dans une thérapie intensive. Ceci dit, nos résultats suggèrent quand même que la quétiapine peut être bénéfique dans le traitement des toxicomanes entrant en désintoxication. Des études randomisées sont de mises pour déterminer la pertinence de ces résultats.

Stress oxydatif, fonction mitochondriale et maladie inflammatoire de l'intestin

CONTEXTE: Bien que la dysfunction mitochondriale et le stress oxydant jouent des rôles prépondérants dans plusieurs conditions pathologiques, ils n’ont pas été étudiés de façon extensive au niveau du tube digestif qui est constamment exposé aux oxydants (provenant de l’alimentation) et à divers agents pathogènes. L’ingestion simultanée de sels ferreux et d’acide ascorbique peut causer le dommage des macromolécules par oxydation. Le ‘’Nuclear factor erythroid 2 related factor’’ (Nrf2) est un important facteur de transcription sensible au potentiel redox et qui protège contre le stress oxydant en induisant des gènes anti-oxydants et de detoxification par sa liaison à l’élément de réponse antioxydante (ARE). Les fonctions anti-oxydantes et anti-inflammatoires de Nrf2 ont été décrites dans une variété de types cellulaires et de tissus. Cependant son rôle est très peu connu au niveau du tube digestif. OBJECTIFS: Les objectifs sont d’évaluer comment la peroxydation lipidique médiée par le fer/ascorbate (FE/ASC) affecte les fonctions mitochondriales dans les cellules Caco-2/15, et de déterminer l’ampleur de l’implication de Nrf2. MÉTHODES: Le stress oxydant a été induit dans les cellules Caco2/15 en les traitant avec 0.2mm/2mm de FE/ASC. L’augmentation de l’expression de Nrf2 a été obtenue suite au prétraitement des cellules Caco2/15 avec 50 μM d’Olitpraz (OPZ), un puissant activateur. L’invalidation du gène de Nrf2 a été réalisée dans les cellules par transfection avec un vecteur lentiviral contenant un shRNA contre Nrf2. RÉSULTATS: Nos résultats montrent que le traitement des cellules Caco-2/15 avec du FE/ASC (0.2 mm/2 mm) augmente les niveaux du malondialdehyde (MDA), réduit la production d’ATP, entraîne une surcharge mitochondriale de calcium, active l’expression protéique du cytochrome C et de l’AIF (apoptotic inducing factor), réduit l’activité des complexes I, II, 2 III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, augmente les niveaux de 8-OHdG, un marqueur des dommages à l’ADN mitochondrial, diminue la DNA glycosylase, et altère les expressions génique et protéique des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). De plus, nos observations montrent que l’induction et l’activation de Nrf2 dans les cellules Caco-2/15 résultent en: une augmentation des enzymes anti-oxydantes endogènes (catalase, glutathion peroxydase, et superoxyde dismutase), une réduction du facteur nucléaire NFκβ et de TNF-α, une augmentation de la production d’ ATP et de l’activité des complexes respiratoires (I, II, III, IV) et de PGC-1α, et une régulation des niveaux de la prohibitine mitochondriale, du Bcl-2 anti-apoptotique et de l’occludine. CONCLUSION: Dans l’ensemble, nos résultats montrent que l’exposition aigüe des cellules Caco-2/15 à la peroxydation par le FE/ASC entraîne des effets pathologiques sur les fonctions mitochondriales et l’intégrité de l’ADN, qui sont abolis par l’induction de Nrf2. Il en ressort que Nrf2 joue un rôle majeur dans la protection de l’épithélium intestinal contre le stress oxydant.

Caractérisation et étude de la régulation d’une isoforme cytosolique de peroxyrédoxine chez les solanacées

Les peroxyrédoxines (PRXs) forment une famille de peroxydases communes à tous les organismes vivants et ubiquitaires dans la cellule. Leur particularité provient d’un ou deux résidus cystéines accomplissant un cycle d’oxydo-réduction à l’aide d’un donneur d’électron. Ces protéines thiols sensibles au potentiel redox sont impliquées dans le mécanisme de détoxification du H2O2, une molécule oxydante induite lors de situations de stress. Les PRXs pourraient être induites par le stress et régulées par phosphorylation. En effet, des expérimentations in vitro ont démontré que la nucléoside diphosphate kinase 1 (NDPK1) a la capacité de phosphoryler une PRX cytosolique de pomme de terre. Ce mémoire décrit les travaux expérimentaux effectués pour caractériser la fonction de la PRX. Pour cela, le clonage d’une isoforme a été effectué, suivi d’une caractérisation biochimique et d’une étude d’expression de la protéine. Les données de séquençage révèlent qu’il s’agit d’une PRX de type II phylogénétiquement liée aux PRXs cytosoliques. L’ADNc codant pour cette peroxyrédoxine (PRX1) a été cloné chez Solanum chacoense. Une protéine recombinante portant une étiquette (6xHis) en N-terminale a été produite. Des essais enzymatiques ont confirmé la fonction antioxydante de la protéine recombinante et un anticorps polyclonal a été généré chez le lapin puis utilisé en conjonction avec un anticorps anti-NDPK1 pour déterminer les patrons d’expression généraux de ces protéines chez Solanum lycopersicum et Solanum tuberosum lors de situations de stress. Les données démontrent que les deux protéines sont généralement co-exprimées mais pas co-régulées et que la PRX1 est induite en certaines situations de stress.

Association of reduced extracellular brain ammonia, lactate, and intracranial pressure in pigs with acute liver failure.

We previously demonstrated in pigs with acute liver failure (ALF) that albumin dialysis using the molecular adsorbents recirculating system (MARS) attenuated a rise in intracranial pressure (ICP). This was independent of changes in arterial ammonia, cerebral blood flow and inflammation, allowing alternative hypotheses to be tested. The aims of the present study were to determine whether changes in cerebral extracellular ammonia, lactate, glutamine, glutamate, and energy metabolites were associated with the beneficial effects of MARS on ICP. Three randomized groups [sham, ALF (induced by portacaval anastomosis and hepatic artery ligation), and ALF+MARS] were studied over a 6-hour period with a 4-hour MARS treatment given beginning 2 hours after devascularization. Using cerebral microdialysis, the ALF-induced increase in extracellular brain ammonia, lactate, and glutamate was significantly attenuated in the ALF+MARS group as well as the increases in extracellular lactate/pyruvate and lactate/glucose ratios. The percent change in extracellular brain ammonia correlated with the percent change in ICP (r(2) = 0.511). Increases in brain lactate dehydrogenase activity and mitochondrial complex activity for complex IV were found in ALF compared with those in the sham, which was unaffected by MARS treatment. Brain oxygen consumption did not differ among the study groups. Conclusion: The observation that brain oxygen consumption and mitochondrial complex enzyme activity changed in parallel in both ALF- and MARS-treated animals indicates that the attenuation of increased extracellular brain ammonia (and extracellular brain glutamate) in the MARS-treated animals reduces energy demand and increases supply, resulting in attenuation of increased extracellular brain lactate. The mechanism of how MARS reduces extracellular brain ammonia requires further investigation.

Biochemical mechanisms involved in pulmonary hypo-alveolarization induced by peroxides contaminating parenteral nutrition in newborn guinea pig

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP), caractérisée par un défaut de l’alvéolarisation, est une complication pathologique associée à un stress oxydant chez le nouveau-né prématuré. La DBP est présente chez près de 50 % des nouveau-nés de moins de 29 semaines de gestation. La nutrition parentérale (NP) que ces nouveau-nés reçoivent pour cause d’immaturité gastro-intestinale est une source importante de stress oxydant. En effet, leur NP est contaminée par des peroxydes, dont l’ascorbylperoxyde qui est une forme peroxydée du déshydroascorbate. La génération des peroxydes est catalysée par la lumière ambiante. La photoprotection de la NP, quoique difficile d’application en clinique, est associée à une diminution de l’incidence de la DBP chez les enfants prématurés. Chez l’animal nouveau-né, la photoprotection de la NP est associée à un meilleur développement alvéolaire. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que l’ascorbylperoxide infusé avec la NP cause la perte d’alvéoles suite à une apoptose exagérée induite par l’oxydation du potentiel redox du glutathion. Cette oxydation du potentiel redox serait occasionnée par l’inhibition de la transformation hépatique de la méthionine en cystéine, menant à une diminution de la synthèse de glutathion au foie et dans les tissus tels que les poumons. La confirmation de cette hypothèse suggérera qu’un ajout de glutathion dans la NP permettra une meilleure détoxification de l’ascorbylperoxide par l’action de la glutathion peroxydase, et préviendra l’oxydation du potentiel redox et ainsi, la perte d'alvéoles par apoptose. Objectifs : Le but de mon projet de recherche est de comprendre les mécanismes biochimiques liant la NP et le développement de la DBP chez le nouveau-né prématuré et de proposer une alternative nutritionnelle prévenant le développement de cette complication fréquemment observée dans cette population. Les objectifs spécifiques sont : 1) d’évaluer l’impact, au poumon, de l’infusion de l’ascorbylperoxyde sur l’axe métabolique potentiel redox du glutathion - apoptose - le développement alvéolaire; 2) d’étudier l’impact de l’ascorbylperoxyde et du potentiel redox sur l’activité hépatique de la méthionine adénosyltransférase (MAT), première enzyme de la cascade métabolique transformant la méthionine en cystéine; et 3) de tenter de prévenir l’impact négatif de la NP ou de l’infusion d’ascorbylperoxyde sur le poumon en améliorant le statut en glutathion. Méthodes: Par un cathéter fixé dans la jugulaire, des cochons d’Inde de trois jours de vie (n = 8 par groupe) ont reçu en continu durant 4 jours une NP ou une solution de base (dextrose + NaCl) enrichie des différentes molécules à l’essai. Le premier objectif a été atteint en enrichissant la solution de base en ascorbylperoxyde à 0, 20, 60 et 180 μM. Ces solutions contenaient ou non 350 μM H2O2 pour se rapprocher des conditions cliniques. Le second objectif a été atteint en investiguant les mécanismes d’inhibition de la MAT dans des animaux infusés ou non avec des solutions contenant la solution de base, des peroxydes, du glutathion et la NP (dextrose + acides aminés + multivitamines + lipides). Le troisième objectif a été atteint en ajoutant ou non à une solution d’ascorbylperoxide ou à la NP 10 μM de glutathion (GSSG), afin d’obtenir une concentration plasmatique normale de glutathion. Après 4 jours, les poumons étaient prélevés et traités pour la détermination de GSH et GSSG par électrophorèse capillaire, le potentiel redox était calculé selon l'équation de Nernst et le niveau de caspase-3 actif (marqueur d’apoptose) par Western blot et l’index d’alvéolarisation quantifié par le nombre d’interceptes entre des structures histologiques et une droite calibrée. Les données étaient comparées par ANOVA, les effets étaient considérés comme significatifs si le p était inférieur à 0,05. Résultats: L’infusion de l’ascorbylperoxyde, indépendamment du H2O2, a induit une hypoalvéolarisation, une activation de la caspase-3 et une oxydation du potentiel redox de manière dose-dépendante. Ces effets ont été empêchés par l’ajout de GSSG à la NP ou à la solution d’ascorbylperoxyde (180 M). L’ascorbylperoxyde et le H2O2 ont inhibé l’activité de MAT tandis qu’elle était linéairement modulée par la valeur du potentiel redox hépatique. Conclusion : Nos résultats suggèrent que l’ascorbylperoxyde est l’agent actif de la NP conduisant au développement de la DBP. Ainsi la correction des bas niveaux de glutathion induits par les peroxydes de la NP favorise la détoxification des peroxydes et la correction du potentiel redox pulmonaire ; ce qui a protégé les poumons des effets délétères de la NP en outrepassant l’inhibition de la MAT hépatique. Nos résultats sont d'une grande importance car ils donnent de l'espoir pour une prévention possible de la DBP.