Étude du rôle de la protéine Vpr du VIH-1 dans la modulation de la réponse immunitaire

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une activation chronique du système immunitaire et par une réduction graduelle du nombre de lymphocytes TCD4+, qui contribuent à une détérioration lente du système immunitaire menant à la phase SIDA. Paradoxalement, ce sont majoritairement des lymphocytes T CD4+ non infectés qui sont détruits et la cause de ce phénomène reste encore inconnue. Certaines protéines virales, dont la protéine accessoire Vpr, sont soupçonnées de jouer un rôle dans ce processus. Synthétisée tardivement, Vpr est incorporée à l’intérieur des virions, en plus d’être relâchée sous forme soluble dans le milieu extracellulaire. La principale fonction biologique de Vpr est l’induction d’un arrêt de cycle en phase G2/M, via le recrutement du complexe d’ubiquitine E3 ligase CUL4A-DDB1VprBP et l’activation de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par la kinase ATR. Une étude démontre que l’activation des voies de dommages à l’ADN conduit à l’expression de ligands du récepteur activateur NKG2D, exprimés par les cellules NK, déclenchant leurs fonctions cytolytiques. Chose intéressante, plusieurs études suggèrent que le VIH-1 régule positivement l’expression des ligands de NKG2D à la surface des lymphocytes T CD4+ infectés. Cependant, le facteur viral impliqué dans ce processus reste encore indéfini. Le but de cette thèse était d’évaluer le rôle de Vpr dans la modulation des fonctions cytolytiques des cellules NK et son implication potentielle dans la destruction des lymphocytes T CD4+. Nos travaux ont permis de démontrer que l’expression de Vpr, seule ou dans le contexte de l’infection, est suffisante afin d’augmenter spécifiquement l’expression du ligand de NKG2D, ULBP2, au niveau de lymphocytes T CD4+ primaires. Conséquemment, Vpr augmente ainsi la susceptibilité de ces cellules à une lyse par des cellules NK autologues. Nous démontrons que cette régulation positive d’ULBP2 repose sur la capacité de Vpr de recruter le complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP et l’activation de la voie de dommage à l’ADN ATR. Plus important encore, nous apportons des preuves que Vpr augmente également l’expression d’ULBP2 au niveau des cellules non infectées lors d’une infection de lymphocytes TCD4+ par le VIH-1. À cet effet, nous montrons que l’acheminement de Vpr au niveau de lymphocytes T CD4+ non infectés via des particules virales défectives est suffisant afin de réguler positivement ULBP2 et d’augmenter leur lyse par des cellules NK autologues. De plus, nous décrivons pour la première fois que Vpr, sous forme soluble, a la capacité d’induire des dommages à l’ADN et de réguler positivement ULBP2 suite à la transduction de différents types cellulaires, incluant des cellules T. Globalement, nos résultats démontrent que Vpr est un facteur viral clé impliqué dans la régulation positive des ligands de NKG2D induite par le VIH-1. Cette régulation positive d’ULBP2 pourrait alors contribuer à la destruction des lymphocytes T CD4+ infectés et non infectés via l’activation des fonctions cytolytiques des cellules NK. Une meilleure compréhension de la contribution de cette activité de Vpr dans la pathogenèse du VIH-1 a le potentiel de permettre le développement de nouvelles cibles ou stratégies thérapeutiques contre le VIH-1.

Function of the immunoregulatory CD4-CD8- T cells in the context of autoimmune diabetes

La tolérance immunitaire dépend de la distinction entre le soi et le non soi par le système immunitaire. Un bris dans la tolérance immunitaire mène à l'auto-immunité, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du système nerveux central. Le diabète auto-immun, également connu sous le nom diabète juvénile et diabète de type 1, résulte d'une attaque auto-immune sur les cellules β pancréatiques sécrétrices d’insuline, localisées au niveau des îlots de Langerhans du pancréas. Bien que le diabète auto-immun soit traitable par une combinaison d’injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, de régime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limitées à, la cécité, les maladies cardiovasculaires, l’insuffisance rénale et l'amputation. En raison des nombreuses complications liées au diabète auto-immun à long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqués dans la progression de la maladie dans le but de développer de nouvelles thérapies qui empêcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rôle primordial dans la génération et l'entretien de la tolérance immunitaire a été attribué au nombre et à la fonction des sous-populations de cellules régulatrices. Une de ces populations est constituée de cellules T CD4-CD8- (double négatives, DN), qui ont été étudiées chez la souris et l'humain pour leur contribution à la tolérance périphérique, à la prévention des maladies et pour leur potentiel associé à la thérapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intérêt thérapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorégulateur antigène-spécifique dans divers cadres expérimentaux, y compris la prévention du diabète auto-immun. D’ailleurs, en utilisant un système transgénique, nous avons démontré que les souris prédisposées au diabète auto-immun présentent peu de cellules T DN, et que ce phénotype contribue à la susceptibilité au diabète auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empêcher la progression vers le diabète chez les souris prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats suggèrent que les cellules T DN puissent présenter un intérêt thérapeutique pour les patients diabétiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces résultats en utilisant un modèle non-transgénique, qui est plus physiologiquement comparable à l'humain. L'objectif principal de cette thèse est de définir la fonction immunorégulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thérapeutique de celles-ci dans la prévention du diabète auto-immun chez un modèle non-transgénique. Dans cette thèse, on démontre que les souris résistantes au diabète auto-immun présentent une proportion et nombre absolu plus élevés de cellules T DN non-transgéniques, lorsque comparées aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilité à la maladie. On observe que les cellules T DN éliminent les cellules B activées in vitro par une voie dépendante de la voie perforine et granzyme, où la fonction des cellules T DN est équivalente entre les souris résistantes et prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats confirment que l'association au diabète auto-immun est due à une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutôt qu’à une déficience fonctionnelle. On démontre que les cellules T DN non-transgéniques éliminent des cellules B chargées avec des antigènes d'îlots, mais pas des cellules B chargées avec un antigène non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on établit que le transfert des cellules T DN activées peut empêcher le développement du diabète auto-immun dans un modèle de souris non-transgénique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux îlots pancréatiques, et subissent une activation et une prolifération préférentielles au niveau des ganglions pancréatiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entraîne une diminution d'auto-anticorps spécifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les îlots, ce qui corrèle avec les résultats décrits ci-dessus. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de démontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel lié à la thérapie cellulaire pour le diabète auto-immun.

Étude des cellules dendritiques chez les patients qui ont subi une greffe de cellules souches allogéniques

La vigueur de la réponse immunitaire générée par les cellules dendritiques (DC) a positionné ces cellules comme médiatrices centrales dans l’activation des lymphocytes T. La vulnérabilité des cellules cancéreuses de leucémie myéloïde chronique (LMC) à l’intervention immunitaire résulte apparemment de la capacité des cellules leucémiques de se différencier en DC. Ces DC ont alors la capacité de présenter des peptides provenant des cellules souches leucémiques aux lymphocytes T. Dans ce travail, nous démontrons que la plupart des patients atteints d’une LMC présentent un déficit important en DC au niveau du sang et de la moelle osseuse avant la greffe de cellules souches allogéniques. Les faibles niveaux de DC circulantes résultent en grande partie d’une perte de la diversité au niveau des cellules progénitrices CD34+ leucémiques au niveau de la moelle osseuse. Ces cellules progénitrices CD34+ présentent d’ailleurs une capacité réduite à se différencier en DC in vitro. Nous avons trouvé qu’un décompte faible de DC avant une greffe allogénique était associé à une diminution significative de la survie et une augmentation considérable du risque de développer une des complications mortelles. Puisque la reconstitution des DC suite à la greffe est absente, notre étude appuie aussi la thèse que ce sont les cellules DC pré greffe qui sont primordiales dans l'effet du greffon contre leucémie (GVL). Dans ce contexte, notre étude suggère que le compte des DC avant la greffe allogénique pourrait servir de marqueur pronostique pour identifier les patients LMC à risque de développer certaines complications suite à une greffe allogénique.

Le rôle du CD40 homodimère dans la réponse immunitaire

Le CD40 est une glycoprotéine transmembranaire de type I, appartenant à la famille des TNFRs, exprimée à la surface des cellules immunitaires, hématopoïétiques, vasculaires, épithéliales, et d’autres types de cellules, y compris les cellules tumorales. Le CD40 ne possédant pas de domaine kinase, pour induire un signal il interagit directement ou indirectement avec des protéines adaptatrices telles que les TRAFs et les JAKs. L’interaction du CD40 avec son principal ligand, le CD154, joue un rôle primordial dans la régulation de la réponse immunitaire et le maintien de l’homéostasie. L’activation du CD40 à la surface des cellules B augmente leur capacité de présentation d’antigène, en plus d’induire la prolifération, la commutation isotypique et l’apoptose. Les patients souffrant de mutations au niveau du gène codant pour le CD40 ou de son ligand sont immunosupprimés et sensibles à des infections opportunistes. Des études ont montré que le CD40 comme d’autres membres de la famille des TNFRs est capable de former des homodimères. Plus récemment, on a montré que la formation du CD40 homodimère est le résultat de son engagement sur les cellules B. En plus, cette homodimérisation du CD40 est importante pour la phosphorylation de l’Akt. L’interaction CD40/CD154 peut avoir un rôle direct dans l’immunothérapie par l’induction de l’apoptose de certaines cellules cancéreuses ou un rôle indirect en activant les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) afin d'augmenter l’efficacité de l’activation des cellules T cytotoxiques. Nos résultats montrent que l’induction de la mort cellulaire par le CD40 requiert la perméabilisation du lysosome, la libération de la cathepsine B, la présence de ROS et une interaction avec le TRAF6, cette mort cellulaire programmée est plus importante en présence de la forme monomérique du CD40, muté au niveau de la cystéine 238. Par ailleurs, l’homodimérisation du CD40 requerrait sa translocation vers les radeaux lipidiques et nécessiterait la présence des ROS. Cette homodimérisation du CD40 semble être importante pour l’activation des cellules B par le biais de l’induction de l’expression du CD23, CD69 et CD80. De plus, nos résultats montrent pour la première fois une implication du CD40 homodimère dans l’induction du CD23 par le biais du TLR4. Nos résultats soulignent l’importance du CD40 homodimère dans certaines voies de signalisation. Ainsi, ils mettent en évidence le rôle de la Cys-238 dans la coopération entre des récepteurs de la réponse immunitaire innée et adaptative. Toutes ces données permettraient une meilleure compréhension de certaines voies de signalisation impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes et faisant objet de plusieurs essais thérapeutiques.

L’immunoprotéasome : producteur de peptides-CMH I et régulateur de l’expression génique

Le système ubiquitine-protéasome est le principal mécanisme par lequel les protéines intracellulaires sont dégradées. Le protéasome dit constitutif (PC) est donc essentiel à l’homéostasie mais aussi à la régulation de la majorité des processus cellulaires importants. La découverte d’un deuxième type de protéasome, appelé immunoprotéasome (IP), soulève toutefois de nouvelles questions. Pourquoi existe-t-il plus d’un type de protéasome ? L’IP a-t-il des rôles redondants ou complémentaires avec le PC ? L’IP étant présent principalement dans les cellules immunitaires ou stimulées par des cytokines, plusieurs groupes ont tenté de définir son rôle dans la réponse immunitaire. Or, l’implication de son homologue constitutif dans un éventail de processus non spécifiquement immunitaires nous laisse croire que l’IP pourrait lui aussi avoir un impact beaucoup plus large. L’objectif de cette thèse était donc de caractériser certains rôles cellulaires de l’IP dans les cellules dendritiques. Nous avons d’abord étudié l’impact global de l’IP sur la présentation antigénique de classe I. Ce faisant, nous avons pu déterminer ses deux contributions principales, soit l’augmentation drastique du nombre et de la diversité des peptides présentés sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I. Les différences de clivage entre le PC et l’IP pourraient expliquer en partie cette diversité du répertoire peptidique, notamment par l’affinité apparente de l’IP pour les régions protéiques non structurées. Dans un deuxième temps, nous avons dévoilé un nouveau rôle de l’IP sur un processus dépassant le cadre immunitaire : la transcription. Nous avons découvert que l’IP modifie l’abondance des ARNm en agissant principalement au niveau de leur synthèse. L’impact de l’IP sur le transcriptome est majeur et serait dû en partie à une dégradation différente de facteurs de transcription des familles IRF, STAT et NF-kB. Les cellules dendritiques IP-déficientes activent moins efficacement les lymphocytes T CD8+ et nous croyons que cette défaillance est causée (du moins en partie) par la perturbation transcriptomique provoquée par l’absence d’IP. Il importe donc de comprendre les différents rôles moléculaires de l’IP afin de mieux définir sa contribution globale au fonctionnement de la cellule et comprendre l’avantage évolutif, au niveau de l’organisme, procuré par une telle plasticité du système ubiquitine-protéasome.

Les macrophages d’ascendance européenne et africaine répondent différemment aux infections bactériennes

Des études antérieures démontrent que les descendants de peuples européens et africains présentent des différences de susceptibilité à certaines maladies infectieuses. Ces différences suggèrent des variations interpopulationnelles de la réponse immunitaire qui résultent probablement de l’adaptation de ces individus aux pathogènes de leur environnement. Nous avons caractérisé la réponse immunitaire chez des descendants de peuples européens et africains à des infections bactériennes. Nous avons infecté des macrophages dérivés de monocytes de 30 Américains d’origine africaine (Africains) et de 31 Américains d’origine européenne (Européens) avec les pathogènes intracellulaires Listeria monocytogenes et Salmonella typhimurium pendant 4 heures, puis nous avons mesuré le niveau d’expression pangénomique des cellules infectées et non infectées par séquençage de l’ARNm. Nous avons estimé le niveau de contrôle de l’infection par les macrophages à 2, 4 et 24 heures post-infection en évaluant le taux de survie des bactéries. Nous avons observé que les Africains présentent significativement moins de bactéries intracellulaires après 4 et 24 heures que les Européens, suggérant que les Africains contrôlent mieux les infections bactériennes. Nous avons identifié des différences interpopulationnelles dans le niveau de sécrétion des cytokines et dans le niveau d’expression de certains gènes, ce qui suggère que les Africains modulent une réponse inflammatoire plus forte que les Européens. Nous avons démontré que plusieurs de ces gènes ont subi des évènements de sélection positive récents seulement chez les Européens. Notre étude a identifié plusieurs gènes candidats susceptibles d’influencer le cours des infections bactériennes chez les humains. Nos résultats indiquent que les différences dans la progression des maladies infectieuses entre les populations européennes et africaines seraient le résultat de la sélection naturelle.

L'expression de la protéine de l'hémochromatose HFE est modulée par les lymphocytes T activés et inhibe la présentation antigénique par MHC I

La présentation antigénique par le complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) I est un processus ubiquitaire permettant la présentation de protéines endogènes qui reflètent l'état de la cellule à la surface cellulaire aux lymphocytes T CD8+ dans le contexte de la surveillance et la réponse immunitaires. Ainsi, l'expression des molécules du MHC I classiques est induite en réponse aux stimuli inflammatoires afin de favoriser la reconnaissance immunitaire et l'élimination des pathogènes. HFE est une molécule du MHC Ib non-classique qui sert de régulateur négatif de l'absorption du fer. HFE est associé au développement de l'hémochromatose héréditaire (HH), maladie associée au métabolisme du fer mais souvent accompagnée de défauts immunitaires. Ainsi, nous avons en premier lieu étudié l'impact de HFE sur la présentation antigénique par MHC I, afin d'expliquer en partie les défauts immunitaires liés à l'HH associée à HFEC282Y. Puis, compte tenu de l'impact de l'inflammation sur l'expression des molécules du MHC I classiques, nous avons étudié la régulation de l'expression de HFE en réponse aux stimuli inflammatoires induits par les cellules du sang périphérique mononucléées (PBMC). Nous avons mis au point un système d’expression antigénique dans lequel nous contrôlons l’expression de MHC I, de HFE et d’un antigène pour lequel nous avons généré des lymphocytes T CD8+ spécifiques. Nos résultats démontrent que la forme sauvage de HFE (HFEWT), contrairement à sa forme mutée (HFEC282Y), inhibe la reconnaissance de complexes MHC I/peptide (pMHC). Nous avons également démontré que l'inhibition de la reconnaissance est maintenue, indépendamment des niveaux d'expression de MHC I à la surface, d'une compétition pour la β2-microglobuline, de la capacité de HFE d'interagir avec le récepteur de la transferrine, de l'origine de l'antigène ou de l'affinité de celui-ci. Par ailleurs, nous avons identifié les domaines α1-2 de HFEWT comme étant responsables de l'inhibition de la reconnaissance antigénique. Par contre, la reconnaissance de peptides chargés de manière externe sur les molécules du MHC I présentes à la surface n'a démontré aucune inhibition en présence de HFEWT, suggérant que HFEWT pourrait affecter la reconnaissance en interférant avec le processus d'apprêtement antigénique intracellulaire. À l’inverse, nous avons souhaité déterminer si les lymphocytes T activés pouvaient influencer les niveaux d'expression de HFE. En termes de régulation de l'expression de HFE, nous avons établi que HFE est exprimé dans les tissus sains chez l'humain et induit chez les lignées de cancers du colon, du sein, du poumon, du rein et du mélanome. Par ailleurs, en co-cultivant des lymphocytes T activés avec ces lignées tumorales, nous avons démontré que l'expression de HFE est fortement inhibée dans toutes ces lignées tumorales lorsqu'exposées à des lymphocytes T activés. Finalement, la modulation de l'expression de HFE est indépendante du contact cellulaire et semble médiée en partie par le GM-CSF, l'IFN-γ et le TNF. En somme, ces résultats suggèrent que les lymphocytes T de l'hôte modulent l'expression de HFE dans le microenvironnement inflammatoire, ce qui pourrait promouvoir la reconnaissance des antigènes présentés sur les molécules du MHC I présentées aux lymphocytes T CD8+ antigène-spécifiques. De plus, ces études soulèvent la possibilité d'un nouveau rôle physiologique de HFEWT dans la voie de présentation antigénique par MHC I, qui pourrait moduler l'immunogénicité des antigènes et la réponse immunitaire cellulaire chez l'hôte.

Correlates of protective immunity against hepatitis C virus

Le virus de l’hépatite C (VHC) infecte ~185 millions d’individus dans le monde. Malgré le développement des nouvelles thérapies dirigées contre le VHC, on compte deux millions de nouvelles infections chaque année, en particulier dans les pays sous-développés et les populations marginalisées. Comme pour la plupart des virus à infection chronique, le développement d’un vaccin prophylactique efficace est limité par le manque de caractérisation des déterminants de la mémoire immunitaire protectrice lors des épisodes de réinfection naturelle chez les êtres humains. Le VHC représente un modèle unique au sein des virus à infection chronique pour étudier l’immunité protectrice. En effet ~30% des patients infectés par le VHC peuvent être guéris suite à un premier épisode d’infection spontanément. Dans cette thèse, nous avons étudié l’immunité protectrice contre le VHC dans une cohorte d’utilisateurs de drogues par injection qui sont à risque d’être infectés ou réinfectés. Notre hypothèse est que la majorité des patients qui ont résolu une première infection par le VHC sont protégés contre le développement d’une infection chronique s’ils sont réexposés. Cette immunité protectrice est associée à la présence des cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles qui possèdent des fréquences, magnitudes et avidités élevées. La capacité protectrice des cellules T mémoire contre les séquences variables du VHC est dépendante de la diversité et flexibilité du répertoire de leurs récepteurs de cellules T (TCR), qui reconnaissent les séquences variables des épitopes ciblés. Notre premier objectif était de définir et détailler les déterminants de l’immunité protectrice conférée par les cellules T spécifiques du VHC. Nos résultats ont montré que la protection pendant l’épisode de réinfection était associée à une augmentation de la magnitude et du spectre des réponses spécifiques par les cellules T CD4 et CD8 polyfonctionnelles, ainsi que par l’apparition d’une population de cellules T tétramère+ CD8+ effectrices qui expriment faiblement le marqueur CD127 (CD127lo) lors du pic de la réponse. Chez les patients qui ont développé une infection chronique pendant l’épisode de réinfection, nous avons observé une expansion très limitée des cellules T CD4 et CD8. Le séquençage des épitopes ciblés par les cellules T CD8 chez ces patients qui sont non-protégés a montré que les séquences de ces épitopes sont différentes des séquences de référence qui étaient utilisées pour tous les essais immunologiques de cette étude. Le deuxième objectif était d’analyser la dynamique du répertoire des TCRs des cellules T CD8 spécifiques chez les patients protégés versus les patients non-protégés. Nos résultats ont montré que le répertoire des cellules T CD8 spécifiques est plus focalisé que chez les patients protégés. En plus, nous avons observé que les clonotypes qui forment le répertoire chez les patients protégés sont distincts de ceux chez les patients non-protégés. Ces clonotypes chez les patients protégés ont montré de plus grandes avidité et polyfonctionnalité que leurs homologues chez les patients non-protégés. En conclusion, nos résultats suggèrent que la protection contre le développement d’une infection chronique pendant l’épisode de réinfection par le VHC est associée à une augmentation de la magnitude, du spectre et de la fonctionnalité des réponses des cellules T spécifiques, ainsi qu’à un répertoire des TCRs plus focalisé composé des clonotypes distincts qui possèdent de plus grandes avidité et polyfonctionnalité que chez les patients non-protégés. L’homologie des séquences des souches virales entre les différents épisodes de l’infection est un déterminant majeur de l’établissement d’une protection efficace. Ces résultats ont donc des implications très importantes pour le développement d’un vaccin prophylactique contre le VHC et d’autres virus à infection chronique.

Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Étude de la différenciation des lymphocytes T CD8+ effecteurs et mémoires : rôle de la cellule présentatrice d’antigène et de la voie de signalisation Notch

Lors d’une infection par un pathogène, des lymphocytes T CD8+ naïfs (LTn) spécifiques de l’antigène sont activés, prolifèrent et se différencient en LT effecteurs (LTe). Les LTe produisent différentes cytokines et acquièrent une activité cytotoxique menant à l’élimination du pathogène. Seulement 5 à 10 % des LTe survivront et se différencieront en LT mémoires (LTm), qui sont capables de répondre plus rapidement lors d’une seconde infection par le même pathogène, contribuant au succès de la vaccination. Toutefois, la compréhension de l’ensemble des mécanismes régulant le développement des LTe et des LTm demeure incomplète. Afin de mieux comprendre les signaux requis pour la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immune, nous avons posé deux hypothèses. Nous avons d’abord proposé que différentes cellules présentatrices d’antigène (CPA) fournissent différents signaux au moment de la reconnaissance antigénique influençant ainsi le devenir des LT CD8+. Vu leur potentiel d’utilisation en immunothérapie, nous avons comparé la capacité d’activation des LT CD8+ par les lymphocytes B activés via le CD40 (CD40-B) et les cellules dendritiques (CD). Nous avons montré que l’immunisation avec des CD40-B induit une réponse effectrice mais, contrairement à l’immunisation avec des CD, pratiquement aucun LTm n’est généré. Les LTe générés sont fonctionnels puisqu’ils sécrètent des cytokines, ont une activité cytotoxique et contrôlent une infection avec Listeria monocytogenes (Lm). Nous proposons qu’une sécrétion plus faible de cytokines par les CD40 B ainsi qu’une interaction plus courte et moins intime avec les LT CD8+ comparativement aux CD contribuent au défaut de différenciation des LTm observé lors de la vaccination avec les CD40-B. Ensuite, nous posé l’hypothèse que, parmi les signaux fournis par les CPA au moment de la reconnaissance antigénique, la voie de signalisation Notch influence le développement des LTe, mais aussi des LTm CD8+ en instaurant un programme génétique particulier. D’abord, grâce à un système in vitro, le rôle de la signalisation Notch dans les moments précoces suivant l’activation du LT CD8+ a été étudié. Ce système nous a permis de démontrer que la voie de signalisation Notch régule directement l’expression de la molécule PD-1. Ensuite, grâce à des souris où il y a délétion des récepteurs Notch1 et Notch2 seulement chez les LT CD8+ matures, un rôle de la voie de signalisation Notch dans la réponse immune des LT CD8+ a été démontré. Nos résultats démontrent que suite à une infection avec Lm ou à une immunisation avec des CD, la signalisation Notch favorise le développement de LTe, exprimant fortement KLRG1 et faiblement CD127, destinés à mourir par apoptose. Toutefois, la signalisation Notch n’a pas influencé la génération de LTm. De façon très intéressante, l’expression des récepteurs Notch influence la production d’IFN- en fonction du contexte d’activation. En effet, suite à une infection avec Lm, l’absence des récepteurs Notch n’affecte pas la production d’IFN- par les LTe, alors qu’elle est diminuée suite à une immunisation avec des CD suggérant un rôle dépendant du contexte pour la voie de signalisation Notch. Nos résultats permettent une meilleure compréhension des signaux fournis par les différentes CPA et de la voie de signalisation Notch, donc des mécanismes moléculaires régulant la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immunitaire, ce qui pourrait ultimement permettre d’améliorer les stratégies de vaccination.

Rôle essentiel des cellules dendritiques dans l'immunité innée face a des streptocoques encapsulés

Streptococcus du Groupe B (GBS) et Streptococcus suis sont deux pathogènes encapsulés qui induisent des pathologies similaires dont la méningite et la septicémie chez les animaux et/ou les humains. Les sérotypes III et V du GBS et les sérotypes 2 et 14 du S. suis (utilisés dans cette étude) sont parmi les plus prévalents et/ou les plus virulents. La capsule polysaccharidique (CPS) définit le sérotype et est considérée comme un facteur de virulence essentiel pour les deux espèces bactériennes. Malgré que plusieurs études aient été réalisées au niveau des interactions entre ces streptocoques et les cellules de l’immunité innée, aucune information n’est disponible sur la régulation de la réponse immunitaire contre ces pathogènes par les cellules dendritiques (DCs) et leur interactions avec d’autres cellules, notamment les cellules ‘natural killer’ (NK). Dans cette étude, différentes approches (in vitro, ex vivo et in vivo) chez la souris ont été développées pour caractériser les interactions entre les DCs, les cellules NK et GBS ou S. suis. L’utilisation de mutants non encapsulés a permis d’évaluer l’importance de la CPS dans ces interactions. Les résultats in vitro avec les DCs infectées par GBS ou S. suis ont démontré que ces deux pathogènes interagissent différemment avec ces cellules. GBS est grandement internalisé par les DCs, et ce, via de multiples mécanismes impliquant notamment les radeaux lipidiques et la clathrine. Le mécanisme d’endocytose utilisé aurait un effet sur la capacité du GBS à survivre intracellulairement. Quant au S. suis, ce dernier est très faiblement internalisé et, si le cas, rapidement éliminé à l’intérieur des DCs. GBS et S. suis activent les DCs via différents récepteurs et favorisent la production de cytokines et chimiokines ainsi que l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation. Cette activation permet la production d’interferon-gamma (IFN-y) par les cellules NK. Cependant, GBS semble plus efficient à activer les DCs, et par conséquent, les cellules NK que S. suis. La production d’IFN-y, en réponse à la stimulation bactérienne, est principalement assurée par un contact direct entre les DCs et les cellules NK et ne dépend qu’en partie de facteurs solubles. De plus, nos résultats in vivo ont démontré que ces deux streptocoques induisent rapidement la libération d'IFN-y par les cellules NK lors de la phase aiguë de l'infection. Ceci suggère que les interactions entre les DCs et les cellules NK pourraient jouer un rôle dans le développement d’une réponse immune T auxiliaire de type 1 (T ‘helper’ 1 en anglais; Th1). Cependant, la capacité de S. suis à activer la réponse immunitaire in vivo est également plus faible que celle observée pour GBS. En effet, les CPSs de GBS et de S. suis jouent des rôles différents dans cette réponse. La CPS de S. suis empêche une activation optimale des DCs et des cellules NK alors que c’est l’opposé pour la CPS de GBS, indépendamment du sérotype évalué. En résumé, cette étude adresse pour la première fois la contribution des DCs et des cellules NK dans la réponse immunitaire innée lors d’une infection à GBS ou à S. suis et, par extension, dans le développement d’une réponse Th1. Nos résultats renforcent davantage le rôle central des DCs dans le contrôle efficace des infections causées par des bactéries encapsulées.

Étude de l’immunité mucosale génitale chez des femmes béninoises hautement exposées au VIH-1 séronégatives (HESN) et séropositives.

Introduction : Aujourd’hui, 35,3 millions de personnes vivent avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1 dans le monde ; l’Afrique subsaharienne concentre 70% des nouvelles infections et les femmes en représentent plus de la moitié. Le mode de transmission du VIH le plus répandu est par voie mucosale génitale suite à des relations sexuelles. Le tractus génital féminin (TGF) possède un milieu immunitaire complexe qui doit contrer l’invasion par des pathogènes tout en maintenant la tolérance/contrôle de la flore normale vaginale étant sous la pression de procréation sous influence des hormones sexuelles. De plus, les mécanismes favorisant ou prévenant l’infection du TGF par le VIH ne sont pas précisément identifiés. Hypothèse : Le contexte inflammatoire mucosal génital et la résultante de dialogues intercellulaires tel qu’entre les cellules épithéliales génitales (CEG) et les cellules dendritiques myéloïdes (mDC), qui sont des premières à rencontrer le virus aux portes d’entrée mucosales, modulent l’activité des lymphocytes qui est déterminante dans le type de réponse immunitaire élaborée par l’hôte. Méthodologie : Des spécimens provenant d’une cohorte de travailleuses du sexe (TS) recrutées à Cotonou au Bénin en Afrique subsaharienne ont été analysés. Nous avons caractérisé le milieu mucosal génital féminin hautement exposé au VIH de TS séronégatives (highly exposed seronegative; HESN) en comparaison avec celui de TS séropositives. Brièvement, les liquides cervicaux-vaginaux ont été déterminés par des techniques de multiplexes/Luminex ou par ELISA et le milieu cellulaire a été décrit suite à des analyses de cytométrie en flux (phénotypage et tri cellulaire). Résultats : Nous avons observé la présence augmentée d’un facteur soluble antiviral, immunomodulateur et antiprolifératif sécrété dans le TGF des TS HESN qui est l’interféron (IFN)-α. La présence augmentée de cette cytokine suggère l’existence possible de connexions intercellulaires clés qui pourraient mener à une régulation homéostatique du compartiment immunitaire génital permettant de contrôler l’infection par le VIH-1. En étudiant l’expression de molécules impliquées dans les voies de signalisation associées à la production d’IFN-α dans les CEG et les cellules myéloïdes du TGF, nous avons pu mettre en évidence l’existence d’un microenvironnement présentant un profil «tolérogénique/régulateur» dans le TGF des TS HESN. Conclusion : Nos observations nous ont permis d’élucider certaines hypothèses sur un potentiel mécanisme d’immunité naturelle protecteur chez les TS HESN. De plus, nous sommes des premiers à décrire une population myéloïde présentant des caractéristiques de DC «tolérogéniques» de par leur expression d’interleukine (IL)-10, de human leukocyte antigen (HLA)-G et de immunoglobulin-like transcript (ILT)-4 dans le TGF de TS HESN. Cette étude aura des implications majeures dans le développement de stratégies d’interventions préventives afin de moduler des conditions inflammatoires préexistantes ainsi établissant une défense mucosale rapide et durable contre le VIH-1.

Interaction entre ventilation mécanique et traumatisme à la moelle épinière : réponses inflammatoires pulmonaires et médullaires

Le traumatisme de la moelle épinière est à l’origine d’une inflammation locale importante caractérisée par l’augmentation massive des cellules inflammatoires et la présence de réactions oxydatives. Cette inflammation locale peut déclencher une réponse inflammatoire systémique par voie hématogène. Au niveau cervical, les lésions médullaires peuvent entraîner des faiblesses ou la paralysie des muscles respiratoires. Le patient, qui ne peut plus respirer de façon autonome, doit avoir recours à un support respiratoire. Bien que la ventilation mécanique soit la thérapie traditionnellement appliquée aux blessés médullaires souffrant d’insuffisance respiratoire, les études ont démontré qu’elle pouvait contribuer à promouvoir une réponse inflammatoire ainsi que des dommages pulmonaires. L’interaction entre le traumatisme médullaire et la ventilation mécanique, indispensable au maintien de l’équilibre des échanges respiratoires, est inconnue à ce jour. En voulant protéger les tissus, cellules et organes, l’organisme met en œuvre toute une panoplie de réponses inflammatoires à différents endroits. Nous pensons que ces réponses peuvent être altérées via l’interaction entre ce traumatisme et cette ventilation mécanique, sous l’influence de la principale source cellulaire de cytokines pour la défense de l’hôte, le macrophage, récemment classé en deux phénotypes principaux: 1) l’activation classique de type M1 et 2) l’activation alternative de type M2. Le phénotype M1 est conduit par le facteur GM-CSF et induit par l’interféron IFN-ɣ ainsi que le lipopolysaccharide. Le phénotype M2 quant à lui, est conduit par le facteur M-CSF et induit par les interleukines IL-4, IL-13 ou IL-21. M1 relâche principalement IL-1β, IL-6, TNF-α et MIP-1α tandis que M2 principalement IL-10 et MCP-1. Toutefois, nous ignorons actuellement par quel type d’activation se manifestera cette réponse immunitaire et si l’application de support respiratoire pourrait entraîner un risque inflammatoire additionnel au site du traumatisme. Nous ignorons également si la ventilation mécanique affecterait, à distance, les tissus de la moelle épinière via une inflammation systémique et amplifierait alors le dommage initial. Il n’existe pas à ce jour, de thérapie qui ait montré d’effet bénéfique réel envers une récupération fonctionnelle des patients blessés médullaires. Il paraît donc essentiel de déterminer si la ventilation mécanique peut moduler l’inflammation post-traumatique à la fois au niveau pulmonaire et au site de la lésion. Ce travail visait à caractériser les liens entre l’inflammation issue du traumatisme médullaire et celle issue de la ventilation, dans le but de fournir une meilleure compréhension des mécanismes inflammatoires activés dans ce contexte. L’étude a été menée sur un modèle animal. Elle consistait à évaluer : 1) si le traumatisme médullaire influençait les réponses inflammatoires pulmonaires induites par la ventilation mécanique, y compris le phénotype des macrophages alvéolaires et 2) si la ventilation pouvait altérer à distance, les tissus de la moelle épinière. L’impact de la blessure médullaire sur l’inflammation pulmonaire et locale, induite par la ventilation fut interprété grâce à l’analyse des cellules inflammatoires dans les lavages broncho-alvéolaires et dans les tissus prélevés à l’endroit de la blessure après 24 heures. Ces analyses ont démontré un profil spécifique des cytokines pulmonaires et médullaires. Elles ont révélé que la ventilation mécanique a engendré un environnement pro-inflammatoire en faveur d’un phénotype M1 chez les animaux ayant bénéficié de la thérapie respiratoire. Inversement, l’atteinte thoracique chez les animaux sans ventilation, a montré qu’une réponse immunitaire avait été activée en faveur d’un environnement anti-inflammatoire de phénotype M2. La lésion cervicale quant à elle a induit un profil de cytokines différent et les réponses au stress oxydatif dans le poumon induites par la ventilation ont été réduites significativement. De plus, une lésion médullaire a augmenté l’expression d’IL-6 et la ventilation a diminué l’IL-1β et augmenté le TNF-α dans les tissus de la moelle. Finalement, ces données ont fourni les premières évidences que la ventilation a induit d’avantage à un phénotype pulmonaire M1 et que le traumatisme médullaire a impacté spécifiquement les réponses inflammatoires et oxydatives dans le poumon. La ventilation a contribué non seulement à distance à une inflammation des tissus médullaires lésés mais aussi des tissus sains.

Malnutrition, VIH et traitement antirétroviral dans les pays à ressources limitées

Introduction : Depuis les années 2000, la distribution du traitement antirétroviral hautement actif (TARVHA) dans les pays à bas et moyens revenus (PBMR) s’est accélérée. Dans ces milieux, l’épidémie du VIH s’est superposée à des conditions préexistantes de malnutrition. Le VIH et la malnutrition forment un cycle vicieux qui contribue à la détérioration des fonctions immunitaires et de l’état nutritionnel. Malgré l’accès au traitement, la malnutrition persiste comme déterminant de la progression de la maladie et de la mortalité chez les séropositifs. Par ailleurs, peu de données existent concernant les trajectoires et déterminants des statuts nutritionnels et immunologiques chez les patients débutant le TARVHA. Objectifs : Documenter les défis méthodologiques associés à la recherche nutritionnelle chez les personnes vivants avec le VIH (PVVIH) dans les PBMR. Investiguer les déterminants et trajectoires du statut nutritionnel à l’initiation et en cours du TARVHA. Investiguer l’association entre les fonctions immunologiques à l’initiation et au cours de la première année de TARVHA selon le statut nutritionnel. Méthodologie: Dans le cadre de la cohorte ATARAO (Mali), 250 PVVIH adultes naïfs au TARVHA ont été recrutés et suivis pendant 12 mois suite à l’initiation du traitement. Les données obtenues ont été jumelées à celles d’une étude prospective similaire provenant du Sénégal (n=372). Des analyses transversales et longitudinales ont été entreprises pour évaluer les covariables de la malnutrition à l’initiation et en cours de traitement. Parallèlement, la fiabilité des mesures anthropométriques collectées dans le cadre de la cohorte ATARAO a été documentée lors de deux sous-études. Finalement, une revue systématique de la littérature a été complétée pour investiguer la réponse immunologique selon le statut nutritionnel à l’initiation et en cours de traitement chez les PVVIH traités. Résultats: Seules les mesures de la taille et du poids se sont révélées fiables et ont pu être utilisées dans nos analyses prospectives. Le traitement a permis une amélioration initiale de l’état nutritionnel chez une majorité de patients. Par contre, ses effets ont atteint un plateau après 6 à 9 mois. Un an plus tard, la malnutrition persistait chez plusieurs patients vivants et actifs (entre 7 et 29 % selon la population et l’indicateur nutritionnel). Comme observé dans nos cohortes et revue systématique, l’attrition était fortement associée à la malnutrition. Par ailleurs, il n’existe pas de relation claire entre le statut immunologique et la malnutrition pré- ou post-HAART. La qualité et la quantité des évidences recensées ne nous permettent pas de tirer de conclusions définitives. Conclusions : Les évidences collectées suggèrent l’existence d’une association transversale et longitudinale entre les statuts nutritionnels et immunologiques chez les patients traités. Cependant, cette association ne fait pas consensus. L’état de la littérature ne nous permet pas de nous prononcer quant à l’impact de la malnutrition sur les fonctions immunologiques à l’initiation et eu cours de la première année de TARVHA. Les difficultés méthodologiques associées à la mesure de l’état nutritionnel ainsi que la forte attrition des patients malnutris suite à la mise sous traitement compliquent l’investigation de cette relation.

In vivo effect of deoxynivalenol (DON) naturally contaminated feed on porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection.

Deoxynivalenol (DON), also known as vomitoxin, is the most prevalent type B trichothecene mycotoxin worldwide. Pigs show a great sensitivity to DON, and because of the high proportion of grains in their diets, they are frequently exposed to this mycotoxin. The objective of this study was to determine the impact of DON naturally contaminated feed on porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection, the most important porcine viral pathogen in swine. Experimental infections were performed with 30 animals. Piglets were randomly divided into three groups of 10 animals based on DON content of diets (0, 2.5 and 3.5 mg/kg DON). All experimental groups were further divided into subgroups of 6 pigs and were inoculated with PRRSV. The remaining pigs (control) were sham-inoculated with PBS. Pigs were daily monitored for temperature, weight and clinical signs for 21 days. Blood samples were collected and tested for PRRSV RNA and for virus specific antibodies. Results of PRRSV infection showed that ingestion of diet highly contaminated with DON greatly increases the effect of PRRSV infection on weight gain, lung lesions and mortality, without increasing significantly viral replication, for which the tendency is rather directed toward a decrease of replication. These results suggest that PRRSV infection could exacerbate anorectic effect of DON, when ingested in large doses. Results also demonstrate a DON negative effect on PRRSV-specific humoral responses. This study demonstrate that high concentrations of DON naturally contaminated feed decreased the immune response against PRRSV and influenced the course of PRRSV infection in pigs.