Effet de différents ratios d’acides linoléique/α-linolénique et de l’entérolactone sur les marqueurs du métabolisme des lipides, d’inflammation et de stress oxydatif dans un modèle in vitro de culture de tissus hépatiques bovins

Chez la vache laitière à haut rendement, la période de transition entourant la parturition est généralement accompagnée d’un déficit énergétique, d’un métabolisme des lipides perturbé et d’une augmentation de l’inflammation et du stress oxydatif. Afin d’améliorer la balance énergétique et de diminuer certains effets négatifs associés à la période de transition, il est fréquent que les producteurs administrent des diètes riches en lipides (ex. Mégalac®, riche en acide palmitique) aux vaches laitières à haut rendement. Par exemple, l’ajout de lipides saturés à la ration améliore la balance énergétique et diminue l’accumulation des triglycérides dans le foie. Cependant, plusieurs troubles métaboliques demeurent, tels que l’inflammation et le stress oxydatif, pouvant être observés entre autres au niveau du foie. Comme alternative aux lipides saturés, l’ajout d’acides gras polyinsaturés (AGPIs) pourrait contribuer à améliorer la balance énergétique tout en diminuant certains effets négatifs associés à la période de transition. Toutefois, les AGPIs sont sujets aux phénomènes de peroxydation ce qui pourrait augmenter le stress oxydatif chez l’animal. Pour limiter ces dommages oxydatifs, l’utilisation de la graine de lin entière, riche en acides gras oméga-3 (n-3) et en lignans (antioxydants), en supplément alimentaire apparaît comme une avenue prometteuse. Des travaux antérieurs rapportent qu’une supplémentation en différents dérivés de la graine de lin (ex. AGPIs, lignans) module l’expression de certains gènes impliqués dans la réponse au stress oxydatif et le métabolisme des lipides dans la glande mammaire de la vache laitière. Cependant, il n’existe aucune étude rapportant l’effet de divers composés de la graine de lin sur le métabolisme lipidique et certains marqueurs de stress oxydatif dans le foie de la vache laitière. Ce projet de recherche a été réalisé afin de déterminer les effets de différents ratios d’acides linoléique (LA)/acide alpha-linolénique (ALA) (n-6/n-3, AGPI) en présence ou non d’entérolactone (ENL, lignan mammalien) sur (1) l’expression hépatique de gènes liés au métabolisme des lipides, au processus inflammatoire et au stress oxydatif, (2) les dommages aux lipides et aux protéines et (3) l’activité de l’enzyme superoxyde dismutase (SOD) dans le foie de la vache laitière en début de lactation. Un modèle in vitro de culture de tissu hépatique en tranches minces a été utilisé puisqu’il permet de préserver les interactions cellules-matrice et entre les cellules. Les gènes sélectionnés ont été choisis en se référant à diverses études antérieures et incluent certains gènes différentiellement exprimés dans le foie et la glande mammaire de la vache laitière en période de transition. Des régulateurs de la transcription (ex. MLXIPL et SREBF1), de même que leurs gènes cibles ont été priorisés. Les tissus issus de biopsies hépatiques de vaches Holstein en début de lactation ont été mis en culture et soumis à huit traitements composés de différents ratios d’AGPIs n-6/n-3, d’ENL et d’une combinaison des deux. Suite à ces traitements, les niveaux d’ARNm des gènes sélectionnés ont été mesurés par PCR quantitatif (RT-qPCR). Les dommages aux lipides ont été mesurés par l’essai des « thiobarbituric acid reactive substances » (TBARS) et les dommages aux protéines par une analyse des protéines carbonyles. Finalement, un essai enzymatique a été effectué pour mesurer l’activité de la SOD, une enzyme jouant un rôle dans le système de défense contre les radicaux libres. Les résultats de cette étude démontrent que l’ajout d’AGPIs (LA et ALA) dans le milieu de culture augmente l’expression de certains gènes liés au stress oxydatif (NQO1, PRDX3, PTGS2 et SOD1) et diminue l’expression de plusieurs gènes liés à l’activité lipogénique (ACACA, FASN, SCD et SREBF1). L’addition d’ENL dans le milieu de culture augmente l’abondance de l’ARNm des gènes cibles de MLXIPL, soit FASN et SCD, deux gènes impliqués dans l’activité lipogénique. Cette régulation à la hausse suggère qu’une supplémentation en tourteau ou en farine de lin (riche an lignans) en début de lactation pourrait avoir des effets non désirés et augmenter le risque de stéatose hépatique. Les analyses de peroxydation des lipides ont révélés une augmentation des dommages aux lipides en présence des AGPIs et un retour aux valeurs du traitement contrôle lorsque l’ENL est ajouté aux AGPIs. Une augmentation similaire est observée pour l’activité de la SOD avec l’ajout des AGPIs au milieu de culture, ainsi qu’un retour aux valeurs contrôle lorsque l’ENL est ajouté aux AGPIs. Ces résultats suggèrent qu’une supplémentation en graines de lin entières serait bénéfique en début de lactation puisque les AGPIs pourraient diminuer l’activité lipogénique au niveau du foie, alors que les lignans présents naturellement dans l’écorce de la graine de lin, pourraient réduire le stress oxydatif et les dommages aux lipides provoqués par des niveaux élevés en AGPIs.

Identification of protein targets of nevirapine reactive metabolites using click chemistry and mass spectrometry-based differential proteomics

Abstract : Adverse drug reactions (ADRs) are undesirable effects caused after administration of a single dose or prolonged administration of drug or result from the combination of two or more drugs. Idiosyncratic drug reaction (IDR) is an adverse reaction that does not occur in most patients treated with a drug and does not involve the therapeutic effect of the drug. IDRs are unpredictable and often life-threatening. Idiosyncratic reaction is dependent on drug chemical characteristics or individual immunological response. IDRs are a major problem for drug development because they are usually not detected during clinical trials. In this study we focused on IDRs of Nevirapine (NVP), which is a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor used for the treatment of Human Immunodeficiency Virus (HIV) infections. The use of NVP is limited by a relatively high incidence of skin rash. NVP also causes a rash in female Brown Norway (BN) rats, which we use as animal model for this study. Our hypothesis is that idiosyncratic skin reactions associated with NVP treatment are due to post-translational modifications of proteins (e.g., glutathionylation) detectable by MS. The main objective of this study was to identify the proteins that are targeted by a reactive metabolite of Nevirapine in the skin. The specific objectives derived from the general objective were as follow: 1) To implement the click chemistry approach to detect proteins modified by a reactive NVP-Alkyne (NVP-ALK) metabolite. The purpose of using NVP-ALK was to couple it with Biotin using cycloaddition Click Chemistry reaction. 2) To detect protein modification using Western blotting and Mass Spectrometry techniques, which is important to understand the mechanism of NVP induced toxicity. 3) To identify the proteins using MASCOT search engine for protein identification, by comparing obtained spectrum from Mass Spectrometry with theoretical spectrum to find a matching peptide sequence. 4) To test if the drug or drug metabolites can cause harmful effects, as the induction of oxidative stress in cells (via protein glutathionylation). Oxidative stress causes cell damage that mediates signals, which likely induces the immune response. The results showed that Nevirapine is metabolized to a reactive metabolite, which causes protein modification. The extracted protein from the treated BN rats matched 10% of keratin, which implies that keratin was the protein targeted by the NVP-ALK.