Influence of speciation in the bioavailability of cadmium to an isopod

Devido às actividades antropogénicas várias substâncias químicas têm sido introduzidas no meio ambiente em concentrações que de outro modo não ocorreriam de forma tão elevada naturalmente. Assim, o conhecimento acerca das características de um químico, tais como, o potencial para se acumular em diferentes níveis tróficos, a sua mobilidade dentro do ecossistema, a toxicidade específica e a bioacumulação, é fundamental para compreender os seus efeitos nos ecossistemas. Esta tese investiga a influência de especiação, na biodisponibilidade do cádmio (Cd) para o isópode Porcellio dilatatus, incluindo os efeitos de especiação do metal: (i) na assimilação do Cd, (ii) no modo como o Cd se distribui internamente no organismo, e (iii) como a sobrevivência e a reprodução são afectadas em isópodes terrestres. Num primeiro ensaio laboratorial avaliou-se a importância da transferência trófica na assimilação do Cd em P. dilatatus. Para tal analisou-se a eficiência de assimilação (EA) do Cd em isópodes, adicionado superficialmente ao alimento (alface) na forma de Cd(NO3)2 e contaminando o meio de crescimento da alface. A hipótese era de que a alface contaminada biologicamente através do cultivo em meio hidropónico contaminado teria uma maior proporção de complexos com proteína ou conjugado na forma de Cd (ex. Cd cisteína). A EA de Cd foi maior entre os isópodes que foram alimentados com o sal (71%, SE = 7%), do que entre os isópodes que se alimentaram de alface contaminada biologicamente (52%, SE = 5%), demonstrando-se assim num teste laboratorial que é provável que a especiação do Cd influencie a taxa de assimilação e acumulação do Cd. Na experiência alimentar que se seguiu, estudou-se em detalhe a especiação do metal comparando as EA do Cd conjugado com cisteína (Cd(Cys)2) e na forma de Cd(NO3)2, com os quais se contaminou gelatina com alface. A utilização de Cd-cisteína, proporcionou uma forma experimental para explorar a biodisponibilidade do Cd complexado dentro do tecido biológico. Como esperado, a EA de Cd em isópodes alimentados com nitrato de Cd (64%, SE = 5%) foi maior do que no caso de isópodes alimentados com o conjugado de cisteína (20%, SE = 3%). De seguida estudou-se a distribuição subcelular das espécies de Cd assimilado através de um processo de fraccionamento. Supunha-se que as diferenças de especiação de Cd reflectiria diferentes estratégias de compartimentalização, com consequências ao nível da detoxificação, armazenamento celular e distribuição subcelular do metal. O “sequestro” na forma de metal biologicamente detoxificado (BDM = proteínas estáveis ao calor - HSP e grânulos ricos em metal - RMG) foi maior nos isópodes alimentados com Cd(NO3)2, sugerindo que são mais eficientes na detoxificação de Cd (22%) do que quando alimentados com Cd(Cys)2 (15%). Foi também demonstrado que os isópodes alimentados com Cd(Cys)2 possuíam níveis de armazenamento de Cd superior nas fracções sensíveis ao metal (MSF = organelos e proteínas desnaturadas pelo calor - HDP) consideradas fracções potencialmente vulneráveis e afectando os isópodes em termos de toxicidade. As diferentes distribuições internas que se seguiram à assimilação e detoxificação das diferentes espécies de Cd foram finalmente avaliadas em termos da sobrevivência e reprodução dos isópodes. O tratamento com Cd(Cys)2 teve maior mortalidade, provavelmente devido à maior disponibilidade de Cd ingerido com implicações ao nível dos processos fisiológicos. Os isópodes alimentados com Cd(NO3)2 armazenaram o Cd nos MRG, como estratégia de detoxificação, sendo mais eficientes a detoxificar o Cd ainda que aumentando a concentração total do metal que se tornou menos tóxico para o isópode. Desta forma, o Cd nos grânulos não estava disponível para os processos fisiológicos e deixou de ser tóxico. Isso poderia estar relacionado com a resistência e tolerância aos metais devido à capacidade dos isópodes compartimentalizarem o Cd no hepatopâncreas, que actua como um mecanismo de detoxificação e contribui para a tolerância a altos níveis de cádmio. Em termos de parâmetros reprodutivos, observou-se uma redução de gestações e duração da gestação na presença de ambas as espécies de metal, mas no caso do Cd(Cys)2 as gravidezes não se concluíram. O número de jovens produzido por fêmeas alimentadas com Cd(NO3)2 foi menor do que no controlo, mas os pesos dos juvenis foram superiores. Finalmente sugere-se assim que esta abordagem seja considerada em estudos do movimento trófico de metais nas cadeias alimentares dado que se espera que a especiação de metais implique diferentes fluxos, dentro de uma dada cadeia trófica.

Efeitos genotóxicos e bioquímicos de xenobióticos em animais aquáticos

No presente trabalho, foi estudado um largo espectro de efeitos genotóxicos e bioquímicos na tainha-garrento (Liza aurata). Nos Capítulos II e III são descritos os efeitos de exposição de curta duração ao fenantreno, um hidrocarboneto aromático policíclico (HAP). A exposição de curta duração (16 horas) demonstrou a capacidade deste composto induzir a actividade da enzima de fase I da biotransformação, etoxiresorufina O-desetilase (EROD), provocar decréscimos de integridade no ADN hepático e aumento de anomalias nucleares eritrocíticas (ANE). Em termos de respostas de stresse, os níveis plasmáticos de cortisol e glucose aumentaram face à exposição a este HAP. A exposição ao fenantreno induziu o decréscimo da glutationa peroxidase (GPx) nas guelras, enquanto que no fígado a actividade da GPx aumentou. No rim, a actividade da glutationa S-transferase (GST) foi inibida. Nas guelras, verificou-se um aumento da catalase. O fenantreno demonstrou igualmente a capacidade de induzir um aumento dos níveis de glutationa nas guelras e fígado. Estas respostas demonstraram a sensibilidade de L. aurata, a este HAP, realçando a especificidade das respostas em termos de órgãos. Apesar dos aumentos das defesas antioxidantes, o potencial tóxico deste composto foi demonstrado pelo aumento da peroxidação lipídica nos três órgãos. Nos capítulos seguintes, são descritas as respostas de L. aurata capturada na Ria de Aveiro, em locais com diferentes perfis de contaminação, inicialmente no Outono de 2005 (Capítulos III a IX) e posteriormente analisando respostas sazonais (Capítulos X e XI). A análise de respostas de stresse (cortisol, glucose e lactato) revelou que L. aurata capturada em Vagos (local contaminado por HAPs) apresentava níveis baixos de cortisol, enquanto que no Laranjo (local contaminado por mercúrio) apresentavam elevados níveis de glucose e lactato. Relativamente às hormonas do eixo hipotálamo – hipófise – tiróide (HHT), foram observados elevados níveis plasmáticos da hormona estimuladora da tiróide (TSH) nos organismos capturados no Laranjo, baixos níveis de tiroxina (T4) nos organismos da Barra (local sujeito a tráfego naval) e baixos níveis de triiodotironina (T3) no Rio Novo do Príncipe (próximo de um antigo efluente de pasta de papel), Laranjo e Vagos. A avaliação das defesas antioxidantes, dano oxidativo e genotóxico nas guelras, rim e fígado revelou diferenças significativas nas respostas dos órgãos. L. aurata capturada na Barra apresentou dano oxidativo nas guelras (Capítulo V). No rim foi detectada uma diminuição da integridade do ADN no Rio Novo do Príncipe e Vagos (Capítulo VI), enquanto que no fígado foi observado dano lipídico na Gafanha e Vagos (Capítulo VIII). O dano não esteve sempre associado a um decréscimo das defesas. As análises da água e do sedimento da Ria de Aveiro (Outono de 2005) revelaram elevadas concentrações de metais (Cd, Hg, Cu e Zn),principalmente, no Laranjo e Rio Novo do Príncipe. L. aurata capturada nestes locais apresentou os níveis mais elevados de metalotioninas hepáticas (Capítulo VII) que parecem responsáveis pela inexistência de danos no fígado (Capítulo VIII). O dano oxidativo no ADN, avaliado através da quantificação dos níveis plasmáticos de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (8-OHdG) e o dano clastogénico/aneugénico, avaliado através da quantificação da frequência de ANE, foram estudados, no Outono de 2005, em duas espécies de peixes (L. aurata e Dicentrarchus labrax - robalo) (Capítulo IX). Os resultados revelaram grande sensibilidade de D. labrax em termos de dano oxidativo no ADN na Gafanha, Rio Novo do Príncipe e Vagos, enquanto que L. aurata apresentou dano oxidativo apenas no Laranjo. O aumento da frequência de ANE apenas foi detectado em L. aurata, em Vagos, não se tendo detectado correlação entre estes dois parâmetros. O estudo sazonal (Maio de 2006 a Março de 2007) do dano oxidativo no ADN e frequência de ANE em L. aurata (Capítulo X) demonstrou a variação destes parâmetros com a estação do ano, apesar de não se ter verificado correlação com os parâmetros hidrológicos determinados. No entanto, no local de referência não se verificaram diferenças sazonais, o que sugere que estes biomarcadores reflectem variações de biodisponibilidade de contaminantes. A análise global dos resultados das diferentes estações do ano revelou que L. aurata capturada no Rio Novo do Príncipe e em Vagos apresentou maior susceptibilidade a dano oxidativo no ADN. No entanto, apenas L. aurata capturada em Vagos apresentou frequência de ANE superior à do local de referência. Os dados do estudo sazonal revelaram uma correlação entre dano oxidativo e ANE, sugerindo o stresse oxidativo como um possível mecanismo envolvido na formação de anomalias. A integridade do ADN das guelras, rim, fígado e sangue de L. aurata foi igualmente estudada ao longo de um ano (Capítulo XI), tendo-se verificado uma grande variabilidade ao longo deste período. Não foi demonstrada sensibilidade a um perfil de contaminação específico, tendo-se verificando variabilidade sazonal no local de referência. Globalmente, os resultados demonstraram a importância da utilização de uma bateria de biomarcadores na monitorização ambiental e a especificidade da resposta dos diferentes órgãos de L. aurata.

Mercury in feral fish: distribution, accumulation and toxicity

O principal objectivo desta dissertação foi estudar a acumulação de mercúrio em vários tecidos de peixes marinhos, a sua relação com factores biológicos e as respectivas respostas bioquímicas. O trabalho realizado permitiu obter novos conhecimentos sobre a acumulação de mercúrio em peixes, possibilitando avaliar a influência da biodisponibilidade do elemento e as suas possíveis implicações no ambiente. O trabalho foi desenvolvido na Ria de Aveiro (Portugal), uma zona costeira onde existe um gradiente ambiental de mercúrio, o que oferece a oportunidade de estudar a sua acumulação e os seus efeitos tóxicos em condições realísticas. As amostragens foram efectuadas em dois locais considerados críticos em termos de contaminação por mercúrio – Largo do Laranjo (L1 e L2) e num local afastado da principal fonte de poluição, usado como termo de comparação (Referência; R); L1 e L2 corresponderam a locais moderadamente e altamente contaminados, respectivamente. Foram escolhidos juvenis de duas espécies ecologicamente diferentes e representativas da comunidade piscícola local, a tainha garrento (Liza aurata) e o robalo (Dicentrarchus labrax). Em cada local foram recolhidas amostras de água e de sedimento para determinação de mercúrio. Foram quantificadas as concentrações de mercúrio total (T-Hg) e orgânico (O-Hg) em vários tecidos dos peixes, escolhidos tendo em conta a sua função relativamente à toxicocinética e toxicodinâmica de metais. As respostas antioxidantes (Catalase- CAT, glutationa peroxidase- GPx, glutationa reductase- GR, glutationa –S-transferase- GST e conteúdo em glutationa total- GSHt), o dano peroxidativo (LPO) e o conteúdo em metalotioninas (MTs) foram também avaliados. A acumulação de T-Hg foi semelhante para as duas espécies de peixes estudadas, embora D. labrax tenha apresentado concentrações tendencialmente maiores. Ambas as espécies demonstraram capacidade de reflectir o grau de contaminação ambiental existente, indicando claramente que a acumulação depende da concentração ambiental. A acumulação revelou-se específica de cada tecido. O padrão da acumulação em L. aurata foi rim > fígado > músculo > cérebro > guelras > sangue e em D. labrax foi fígado > rim > músculo > cérebro ≈ guelras > sangue. Relativamente à acumulação de OHg, verificou-se que D. labrax exibiu concentrações mais elevadas que L. aurata. Todos os tecidos foram capazes de reflectir diferenças entre R e L2. Os níveis de O-Hg no fígado, músculo e nos conteúdos intestinais foram diferentes entre espécies, sendo mais elevados para D. labrax. As guelras e o intestino foram os tecidos onde se obtiveram os valores mais baixos de O-Hg e observaram-se valores idênticos para as duas espécies. Com excepção das guelras, as concentrações de O-Hg variaram em função do valor observado nos conteúdos intestinais, indicando que a alimentação é a via dominante da acumulação. As concentrações de O-Hg nos conteúdos intestinais revelaram ser uma informação relevante para prever a acumulação de O-Hg nos tecidos, pois verificou-se uma razão praticamente constante entre o teor de mercúrio no fígado, no músculo e nos conteúdos intestinais. A percentagem de O-Hg no músculo e no fígado variou de acordo com o grau de contaminação ambiental e com o tipo de assimilação preferencial do elemento (alimentação vs. água), sugerindo que o fígado exerce um papel protector em relação à acumulação de mercúrio nos outros órgãos. Ambas as espécies de peixes demonstraram ser boas sentinelas da contaminação ambiental com mercúrio (T-Hg e O-Hg), sendo o cérebro e o músculo os tecidos que melhor reflectiram o grau de acumulação com o elemento. A análise conjunta dos dados de bioacumulação e de respostas ao stress oxidativo permitiram estabelecer uma relação entre as concentrações de mercúrio nas guelras, fígado, rim e cérebro e a sua toxicidade. As respostas do cérebro aos efeitos tóxicos do mercúrio revelaram ser específicas de cada espécie. Enquanto que para o cérebro de L. aurata se verificou um decréscimo de todos os parâmetros antioxidantes estudados nos locais contaminados, sem haver evidência de qualquer mecanismo compensatório, no D. labrax observaram-se respostas ambivalentes, que indicam por um lado a activação de mecanismos adaptativos e, por outro, o decréscimo das respostas antioxidantes, ou seja, sinais de toxicidade. Embora em ambas as espécies de peixe fosse evidente uma condição pró-oxidante, o cérebro parece possuir mecanismos compensatórios eficientes, uma vez que não se verificou peroxidação lipídica. As respostas antioxidantes do cérebro de D. labrax foram comparadas em diferentes períodos do ano - quente vs. frio. O período quente mostrou ser mais crítico, uma vez que no período frio não se verificaram diferenças nas respostas entre locais, ou seja, a capacidade antioxidante do cérebro parece ser influenciada pelos factores ambientais. As guelras revelaram susceptibilidade à contaminação por mercúrio, uma vez que se verificou uma tendência para o decréscimo da actividade de CAT em L2 e ausência de indução em L1. O fígado e o rim demonstraram mecanismos adaptativos face ao grau de contaminação moderada (L1), evidenciados pelo aumento de CAT. O rim também demonstrou adaptabilidade face ao grau elevado de contaminação (L2), uma vez que se verificou um aumento GST. Embora o grau de susceptibilidade tenha sido diferente entre os órgãos, não se verificou peroxidação lipídica em nenhum. A determinação do conteúdo em MTs em D. labrax e em L. aurata revelou que este parâmetro depende não só da espécie, mas também do tecido em causa. Assim, em D. labrax foi observado um decréscimo de MTs no cérebro, bem como a incapacidade de síntese de MTs no sangue, guelras, fígado, rim e músculo. Em L. aurata observou-se um aumento do conteúdo em MTs no fígado e no músculo. Estes resultados indicam que a aplicabilidade das MTs como biomarcador de exposição ao mercúrio parece ser incerta, revelando limitações na capacidade de reflectir os níveis de exposição ao metal e por consequência o grau de acumulação. Este trabalho comprova a necessidade de se integrarem estudos de bioacumulação com biomarcadores de efeitos, de modo a reduzir os riscos de interpretações erróneas, uma vez que as respostas nem sempre ocorrem para os níveis mais altos de contaminação ambiental com mercúrio.

Organic contaminants in urban soils: major inputs and potential risks

Urban soil quality may be severely affected by hydrophobic organic contaminants (HOCs), impairing environmental quality and human health. A comprehensive study was conducted in two contrasting Portuguese urban areas (Lisbon and Viseu) in order to assess the levels and potential risks of these contaminants, to identify sources and study their behaviour in soils. The concentrations of HOCs were related to the size of the city, with much higher contamination levels observed in Lisbon urban area. Source apportionment was performed by studying the HOCs profiles, their relationship with potentially toxic elements and general characteristics of soil using multivariate statistical methods. Lisbon seems to be affected by nearby sources (traffic, industry and incineration processes) whereas in Viseu the atmospheric transport may be playing an important role. In a first tier of risk assessment (RA) it was possible to identify polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in Lisbon soils as a potential hazard. The levels of PAHs in street dusts were further studied and allowed to clarify that traffic, tire and pavement debris can be an important source of PAHs to urban soils. Street dusts were also identified as being a potential concern regarding human and environmental health, especially if reaching the nearby aquatic bodies. Geostatistical tools were also used and their usefulness in a RA analysis and urban planning was discussed. In order to obtain a more realistic assessment of risks of HOCs to environment and human health it is important to evaluate their available fraction, which is also the most accessible for organisms. Therefore, a review of the processes involved on the availability of PAHs was performed and the outputs produced by the different chemical methods were evaluated. The suitability of chemical methods to predict bioavailability of PAHs in dissimilar naturally contaminated soils has not been demonstrated, being especially difficult for high molecular weight compounds. No clear relationship between chemical and biological availability was found in this work. Yet, in spite of the very high total concentrations found in some Lisbon soils, both the water soluble fraction and the body residues resulting from bioaccumulation assays were generally very low, which may be due to aging phenomena. It was observed that the percentage of soluble fraction of PAHs in soils was found to be different among compounds and mostly regulated by soil properties. Regarding bioaccumulation assays, although no significant relationship was found between soil properties and bioavailability, it was verified that biota-to-soil bioaccumulation factors were sample dependent rather than compound dependent. In conclusion, once the compounds of potential concern are targeted, then performing a chemical screening as a first tier can be a simple and effective approach to start a RA. However, reliable data is still required to improve the existing models for risk characterization.

Combined effects of chemical and natural stressors to soil organisms and plants

Nas últimas décadas, a Terra tem experimentado um aquecimento global e mudanças nos padrões de precipitação. Muitos estudos sobre a avaliação de risco de agrotóxicos em organismos não-alvo foram realizados com base em protocolos padronizados, com condições abióticas controladas. Mas, em campo, os organismos são expostos a flutuações de vários fatores ambientais, bem como a poluentes, que podem alterar os limites de tolerância dos organismos aos stressores naturais, bem como alterar a toxicidade ou biodisponibilidade do químico em causa. Considerando isso, o principal objetivo deste trabalho foi o de avaliar de que modo e em que medida os fatores ambientais (temperatura, humidade do solo e radiação UV) podem interagir uns com os outros ou afetar a toxicidade do carbaril para invertebrados do solo e plantas. Para isso, foram utilizadas quatro espécies padrão: Folsomia candida, Eisenia andrei, Triticum aestivum e Brassica rapa, e simulados diferentes cenários climáticos, com vários parâmetros letais e subletais analisados. A exposição combinada foi analisada utilizando, quando possível, a ferramenta MIXTOX, com base no modelo de referência de acção independente (IA) e possíveis desvios, assim como rácios sinergísticos/antagonísticos (a partir de valores de EC50/LC50), quando a dose-resposta de um dos stressores não foi obtida. Todos os fatores de stress aplicados isoladamente causaram efeitos significativos sobre as espécies testadas e sua exposição combinada com carbaril, apresentaram respostas diferenciadas: para as minhocas, a seca e temperaturas elevadas aumentaram os efeitos deletérios do carbaril (sinergismo), enquanto o alagamento e temperaturas baixas diminuíram sua toxicidade (antagonismo). Para os colêmbolos, o modelo IA mostrou ser uma boa ferramenta para prever a toxicidade do carbaril tanto para temperaturas altas como para as baixas. Para as duas espécies de plantas foram encontradas diferenças significativas entre elas: em termos gerais, as interações entre carbaril e os stressores naturais foram observadas, com sinergismo aparecendo como o padrão principal relacionado com a radiação UV, solos secos e temperaturas elevadas, enquanto o padrão principal relacionado com temperaturas baixas e stress de alagamento foi o antagonismo. Quando os efeitos de dois stressores naturais (radiação UV e humidade do solo) em plantas foram avaliados, uma interação significativa foi encontrada: a seca aliviou o efeito deletério da radiação UV em T. aestivum e o alagamento aumentou os seus efeitos, mas para B. rapa a adição de ambos os stresses de água causou um aumento (sinergismo) dos efeitos deletérios da radiação UV para todos os parâmetros avaliados. Portanto é necessário que as diferenças sazonais e latitudinais, bem como as mudanças climáticas globais, sejam integradas na avaliação de risco de contaminantes do solo.