Identification of protein complexes in Alzheimer's disease

A Doença de Alzheimer (AD) é a maior doença neurodegenerativa a nível mundial, e a principal causa de demência na população idosa. O processamento da proteína precursora de amilóide (APP) pelas β- e g- secretases origina o peptídeo Aβ, que agrega em oligómeros neurotóxicos e em placas senis. Estes são eventos-chave na patogénese da DA que levam à rutura da neurotransmissão sináptica, morte neuronal e inflamação neuronal do hipocampo e córtex cerebral, causando perda de memória disfunção cognitiva geral. Apesar dos grandes avanços no conhecimento do papel do processamento da APP na DA, a sua função fisiológica ainda não foi totalmente elucidada. Os mapas de interações proteína-proteína (PPI) humanos têm desempenhado um papel importante na investigação biomédica, em particular no estudo de vias de sinalização e de doenças humanas. O método dois-híbrido em levedura (YTH) consiste numa plataforma para a produção rápida de redes de PPI em larga-escala. Neste trabalho foram realizados vários rastreios YTH com o objetivo de identificar proteínas específicas de cérebro humano que interagissem com a APP, ou com o seu domínio intracelular (AICD), tanto o tipo selvagem como com os mutantes Y687F, que mimetizam o estado desfosforilado do resíduo Tyr-687. De facto, a endocitose da APP e a produção de Aβ estão dependentes do estado de fosforilação da Tyr-687. Os rastreios YTH permitiram assim obter de redes proteínas que interagem com a APP, utilizando como “isco” a APP, APPY687F e AICDY687F. Os clones positivos foram isolados e identificados através de sequenciação do cDNA. A maior parte dos clones identificados, 118, correspondia a sequências que codificam para proteínas conhecidas, resultando em 31 proteínas distintas. A análise de proteómica funcional das proteínas identificadas neste estudo e em dois projetos anteriores (AICDY687E, que mimetiza a fosforilação, e AICD tipo selvagem), permitiram avaliar a relevância da fosforilação da Tyr-687. Três clones provenientes do rastreio YTH com a APPY687F foram identificados como um novo transcrito da proteína Fe65, resultante de splicing alternativo, a Fe65E3a (GenBank Accession: EF103274), que codifica para a isoforma p60Fe65. A p60Fe65 está enriquecida no cérebro e os seus níveis aumentam durante a diferenciação neuronal de células PC12, evidenciando o potencial papel que poderá desempenhar na patologia da DA. A RanBP9 é uma proteína nuclear e citoplasmática envolvida em diversas vias de sinalização celulares. Neste trabalho caracterizou-se a nova interação entre a RanBP9 e o AICD, que pode ser regulada pela fosforilação da Tyr-687. Adicionalmente, foi identificada uma nova interação entre a RanBP9 e a acetiltransferase de histonas Tip60. Demonstrou-se ainda que a RanBP9 tem um efeito de regulação inibitório na transcrição mediada por AICD, através da interação com a Tip60, afastando o AICD dos locais de transcrição ativos. O estudo do interactoma da APP/AICD, modelado pela fosforilação da Tyr-687, revela que a APP poderá estar envolvida em novas vias celulares, contribuindo não só para o conhecimento do papel fisiológico da APP, como também auxilia a revelar as vias que levam à agregação de Aβ e neurodegeneração. A potencial relevância deste trabalho relaciona-se com a descoberta de algumas interações proteicas/vias de sinalização que podem que podem ser relevantes para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas na DA.

A actividade sintética de hMSCs em contacto com vidros bioativos

Os vidros bioativos constituem um material apropriado para o preenchimento de defeitos ósseos, como alternativa a enxertos autólogos, uma vez que, quando expostos a fluidos fisiológicos promovem a formação de uma ligação com o tecido ósseo sob a forma de uma camada de hidroxiapatite carbonatada. No presente trabalho caracterizaram-se vidros bioativos sem conteúdo alcalino, cuja composição incide no sistema binário de diópsido (CaMgSi2O6) e fosfato de tricálcio (3CaO·P2O5), em função da sua molhabilidade, carga superficial, perfil de degradação, carácter bioativo em fluido fisiológico simulado e do seu comportamento in vitro em contacto com células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs). A medição do ângulo de contacto inicial de água sobre os vidros demonstrou o carácter hidrofílico dos vidros investigados. A determinação do potencial zeta mostrou que a carga superficial dos vidros é negativa, sendo mais negativa na composição Di-70. O estudo da biodegradação dos vidros, efetuado através da sua imersão em Tris-HCl, permitiu concluir que a perda de peso dos vidros foi reduzida. A caraterização in vitro em meio acelular foi efetuada através da imersão dos vidros numa solução de fluido fisiológico simulado (SBF) e verificou-se que estes possuem capacidade de formar uma camada de hidroxiapatite carbonatada à sua superfície após 7 dias, detetável por XRD, FTIR e SEM/EDS, sugerindo que este conjunto de vidros é potencialmente bioativo, e poderá estimular a proliferação e diferenciação celular. A resposta das hMSCs em cultura aos vidros bioativos foi avaliada em termos de atividade metabólica, morfologia, viabilidade, proliferação e diferenciação osteogénica e conclui-se que os biovidros Di-60 e Di-70 poderão constituir um suporte viável para a proliferação e diferenciação de hMSCs.

Integration of geochemical and biological modifications in mining areas: waters, sediments and diatoms

The development of mining activities over thousands of years in the region of Aljustrel is nowadays visible as a vast area of ore tailings, slag and host rocks of sulphides mineralization. The generation of acidic waters by the alteration of pyritic minerals - Acid Mine Drainage (AMD) - causes a significant impact on the river system both in the south of the village (Rib ª. Água Forte) and in the north of it (Rib ª. Água Azeda and Barranco do Farrobo), which is reflected in extremely low pH values (< 3) and high concentrations of As, Cd, Cu, Fe, Mn, Pb, Zn and sulphates. This study aimed to assess the environmental impacts extent, integrating geochemical (surface waters and stream sediments) and biological (diatoms) parameters. Three groups of sites were defined, based on sediments and water analysis, which integration with diatom data showed the same association of groups: Group 1- impacted, with acidic pH (1.9-5.1), high metal contents (0.4-1975 mg L-1) and Fe-Mg-sulphate waters, being metals more bioavailable in waters in cationic form (Me2+); mineralogically the sediments were characterized by phyllosilicates and sulphates/oxy-hydroxysulphate phases, easily solubilized, retaining a high amount of metals when precipitated; dominant taxon was Pinnularia aljustrelica (a new species); Group 2- slightly impacted, weak acid to neutral pH (5.0-6.8), metal contents not so high (0.2-25 mg L-1) and Fe-Mg-sulphate to Mg-chloride waters; dominant taxa were Brachysira neglectissima and Achnanthidium minutissimum; Group 3- unimpacted, alkaline pH (7.0-8.4), low metal contents (0-7 mg L-1) with Mg-chloride waters. In this group, metals were associated to the primary phases (e.g. sulphides), not so easily available; the existence of high chloride contents explained the presence of typical taxa of brackish/marine (e.g. Entomoneis paludosa) waters. Taxonomical aspects of the diatoms were studied (discovery of a new species: Pinnularia aljustrelica Luis, Almeida et Ector sp. nov.), as well as morphometric (size decrease of diatoms valves, as well as the appearance of deformed valves of Eunotia exigua in Group 1 and A. minutissimum in Group 2) and physiological (effective to assess the effects of metals/acidity in the photosynthetic efficiency through PAM Fluorometry) aspects. A study was carried out in an artificial river system (microcosm) that aimed to mimic Aljustrel’s extreme conditions in controlled laboratory conditions. The chronic effects of Fe, SO42- and acidity in field biofilms, inoculated in the artificial rivers, were evaluated as well as their contribution to the communities’ tolerance to metal toxicity, through acute tests with two metals (Cu and Zn). In general, the effects caused by low pH values and high concentrations of Fe and SO42- were reflected at the community level by the decrease in diversity, the predominance of acidophilic species, the decrease in photosynthetic efficiency and the increase of enzymatic (e.g. catalase, superoxide dismutase) and non-enzymatic activities (e.g. total glutathione and total phytochelatins). However, it was possible to verify that acidity performed a protective effect in the communities, upon Cu and Zn addition. A comparative study between Aljustrel mining area and New Brunswick mining area was carried out, both with similar mining and geological conditions, reflected in similar diatom communities in both mines, but in very different geographic and climatic areas.

A performance do silêncio na música contemporânea para oboé

O presente estudo tem como objectivo entender todo o universo anexo à performance do silêncio na música clássica contemporânea. Numa nova perspectiva: o estudo do impacto da ansiedade num músico que se observa e que observa a sua interação com o contexto artístico que o rodeia, são estudadas todas as variáveis com influência directa no acto de percepção e gestão dos momentos de ausência de som. Tendo por base os princípios da investigação qualitativa foi criado um modelo teórico de análise na área dos estudos em performance. Este modelo foi aplicado em dois recitais realizados na Universidade de Aveiro e num concerto do Remix Ensemble da Casa da Música do Porto. O uso de ferramentas de pesquisa: O teste do Cortisol e o uso do colete Vitaljacket®, permitiu observar comportamentos fisiológicos no performer e no público nunca antes relatados. Os principais resultados desta investigação permitem aferir a elevada complexidade do fenómeno perceptivo e performativo do silêncio na música contemporânea. A pesquisa realizada permitiu observar que o silêncio na música contemporânea acontece num contexto de elevada ambiguidade semântica e que a duração dada a este num concerto, está directamente dependente do quadro fisiológico observado no performer no momento do concerto. Foi ainda possível aferir que a repetição, numa data posterior, de um mesmo programa de concerto provoca uma acentuada descida dos níveis de ansiedade no performer e essa descida altera a forma como este gere, em concerto, os momentos de silêncio. As conclusões alcançadas em sede de investigação reforçam a pertinência deste estudo. São postas à prova concepções altamente empíricas sobre a performance dos silêncios em música contemporânea. As asserções formuladas têm impacto a nível pedagógico e didático. São apontadas direcções de investigação futura no sentido da valorização do estudo da gestão dos momentos de silêncio em performance.

Alkali-free bioactive glasses for bone regeneration

Bioactive glasses and glass-ceramics are a class of third generation biomaterials which elicit a special response on their surface when in contact with biological fluids, leading to strong bonding to living tissues. The purpose of the present study was to develop diopside based alkali-free bioactive glasses in order to achieve good sintering behaviour, high bioactivity, and a dissolution/ degradation rates compatible with the target applications in bone regeneration and tissue engineering. Another aim was to understand the structure-property relationships in the investigated bioactive glasses. In this quest, various glass compositions within the Diopside (CaMgSi2O6) – Fluorapatite (Ca5(PO4)3F) – Tricalcium phosphate (3CaO•P2O5) system have been investigated. All the glasses were prepared by melt-quenching technique and characterized by a wide array of complementary characterization techniques. The glass-ceramics were produced by sintering of glass powders compacts followed by a suitable heat treatment to promote the nucleation and crystallization phenomena. Furthermore, selected parent glass compositions were doped with several functional ions and an attempt to understand their effects on the glass structure, sintering ability and on the in vitro bio-degradation and biomineralization behaviours of the glasses was made. The effects of the same variables on the devitrification (nucleation and crystallization) behaviour of glasses to form bioactive glass-ceramics were also investigated. Some of the glasses exhibited high bio-mineralization rates, expressed by the formation of a surface hydroxyapatite layer within 1–12 h of immersion in a simulated body fluid (SBF) solution. All the glasses showed relatively lower degradation rates in comparison to that of 45S5 Bioglass®. Some of the glasses showed very good in vitro behaviour and the glasses co-doped with zinc and strontium showed an in vitro dose dependent behaviour. The as-designed bioactive glasses and glass–ceramic materials are excellent candidates for applications in bone regeneration and for the fabrication of scaffolds for tissue engineering.