O sistema dois-hidrido de levedura para confirmação da sinalização de APP Tipo-Noth

Inúmeras potenciais funções foram sugeridas para a APP (Proteína Precursora de Amilóide de Alzheimer), contudo, fisiologicamente, a função precisa da APP não foi ainda desvendada. A APP tem características consistentes com a função de molécula-receptora, capaz de reconhecer sinais extracelulares. Também relevante para este trabalho, é o facto de que a sinalização através de RIP (Proteólise Intramembranar Regulada) tem consequências na expressão génica, como no caso da sinalização tipo-Notch. Tal como a proteína Notch, a APP é processada resultando num fragmento C-terminal designado por AICD (Domínio Intracelular da APP). Neste trabalho é focado o papel importante na sinalização nuclear desempenhado pelo fragmento AICD, especificamente através da interacção com proteínas adaptadoras, promovendo a transcrição. Com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da base molecular da DA (Doença de Alzheimer), torna-se importante investigar as vias de localização nuclear do AICD e o seu envolvimento na transcrição génica, possivelmente afectando proteínas até agora não associadas à DA. Por estes motivos é fundamental a identificação de novas proteínas que interajam com a APP. Um rastreio foi efectuado, utilizando o sistema Dois-Híbrido em Levedura, para identificar interacções específicas do AICD no cérebro humano e, assim, caracterizar o interactoma do AICD. Foi feito o rastreio de aproximadamente 1.1x108 clones de uma biblioteca de cDNA de cérebro humano com o domínio C-terminal da APP com a mutação Y687E, que mimetiza o estado fosforilado. De experiências anteriores deste laboratório sabemos que a tirosina-687 afecta a localização subcelular da APP e é também consensual que a fosforilação é importante nos mecanismos de transdução de sinais, daí a utilização deste mutante parecer apropriada. O rastreio originou 55 clones positivos que foram analisados para identificar proteínas que interagem com a APP. Dois clones são particularmente importantes, a RanBPM e a Transportin-SR2, visto que estão associadas ao transporte de proteínas para o núcleo e confirmam a sinalização nuclear da APP. ABSTRACT: Many putative functions for APP (Alzheimer’s amyloid precursor protein) have been suggested, although the precise physiological function of APP remains to be elucidated. APP has characteristics consistent with it having a role as a receptor, capable of mediating extracellular signals. Also of relevance to the work described here is that RIP (Regulated Intramembrane Proteolysis) signalling can have consequences in gene expression, similar to Notch signalling. Like the latter, APP is processed by RIP resulting in a C-terminal fragment known as AICD. Here we test the hypothesis that the AICD fragment may play an important role in nuclear signalling, specifically by interacting with adaptor proteins potentiating transcription. Therefore, in order to contribute to our understanding of the molecular basis of AD (Alzheimer’s disease) it is important to investigate the pathways of AICD nuclear targeting and its involvement in gene transcription, possibly affecting other proteins hitherto not associated with AD. Thus, it is important to identify AICD binding proteins. A Yeast Two-Hybrid (YTH) screen was performed to identify human brainspecific AICD binding proteins, and thus characterize the AICD interactome. The screen of approximately 1.1 x108 clones from a human brain cDNA library was carried out using the AICD fragment with an Y687E mutation, which mimics phosphorylation on that residue. From previous work carried out in the laboratory we know that tyrosine-687 phosphorylation affects subcellular localization of APP, and it is also recognized that phosphorylation events are important in signal transduction mechanisms, hence the use of this mutant is appropriate. The YTH screen yielded 55 positive clones that were analysed and several novel brain-specific APP binding proteins were identified. Two clones were particularly important, RanBPM and Transportin-SR2, being that they are associated with the nuclear transport of proteins, and support the nuclear signalling for APP.

Characterization of PPP1 interacting proteins in male reproduction

A fosforilação reversível de proteínas é um importante mecanismo de controlo em eucariotas. A fosfoproteína fosfatase 1 (PPP1) é uma fosfatase de serina/treonina envolvida em vários processos celulares. Existem três isoformas da subunidade catalítica (α/CA, δ/β/CB e γ/CC) com pequenas diferenças nos terminais amino e carboxílico. O gene PPP1CC sofre ainda splicing alternativo para produzir duas isoformas, a PPP1CC1 ubíqua e a PPP1CC2 enriquecida em testículo e específica de esperma. A localização e especificidade de substratos da PPP1 está dependente da formação de complexos oligoméricos com proteínas que interagem com a PPP1 (PIPs). O objetivo principal desta tese foi estudar novas PIPs, específicas de testículo e esperma, a fim de melhor caracterizar o papel desta fosfatase e dos respetivos complexos na reprodução em mamíferos. Com este fim, estudou-se a presença, localização e possíveis funções de uma PIP previamente conhecida, PPP1R2, e de duas novas PIPs, PPP1R2P3 e Tctex1d4. PPP1R2 e PPP1R2P3 estão presentes em esperma humano colocalizando com a PPP1CC2, na cabeça e na cauda. A hipótese é que as holoenzimas localizadas na cabeça terão um papel na reação acrossómica, enquanto que as holoenzimas presentes no axonema são relevantes para o controlo da motilidade flagelar. De seguida foram estudados os pseudogenes da PPP1R2, em termos de história evolutiva e de possíveis funções. Na espécie humana, a PPP1R2 tem 10 pseudogenes, 7 deles específicos de primatas. Estudos de bioinformática e dados de expressão mostram que os PPP1R2P1/P3/P9 são os pseudogenes com maior probabilidade de serem transcritos e traduzidos. Também identificámos o PPP1R2P9 em esperma humano e mostrámos que alguns pseudogenes poderão estar associados a estados fisiopatológicos. Isto indica que o processo de evolução poderá estar ligado á formação de novos genes ou ao controlo do mRNA da PPP1R2. A sobre-expressão da PPP1R2 ou PPP1R2P3 em testículo de ratinho também foi realizada, para caracterizar os mecanismos envolvidas na função dos complexos PPP1R2/PPP1R2P3-PPP1CC2 na espermatogénese e fisiologia dos espermatozoides. A dineína de cadeia leve, Tctex1d4, foi encontrada como interagindo com a PPP1C e como estando presente em testículo de ratinho e em esperma humano. Demonstrámos que a Tctex1d4 e a PPP1 colocalizam no centro organizador de microtúbulos e nos microtúbulos e que o motivo de ligação à PPP1 presente na Tctex1d4 parece ser importante para manter a PPP1 no centro organizador de microtúbulos e/ou para disromper ou atrasar o seu movimento ao longo dos microtúbulos emergentes. Estes resultados abrem novos caminhos para os possíveis papéis do complexo Tctex1d4-PPP1 na dinâmica dos microtúbulos, motilidade do esperma, reação acrossómica e na regulação da barreira hemato-testicular, provavelmente, através da via de sinalização do TGFß. A análise do motivo de ligação à PPP1 mostra que este é altamente conservado entre os mamíferos, com exceção das Pikas, sugerindo que esta perda aconteceu antes da radiação das Pikas, há 6-20 milhões de anos atrás. Através de um rastreio por mutações demonstrámos que a capacidade da Tctex1d4 se ligar à PPP1 é mantida nas Pikas, embora o motivo de ligação à PPP1 esteja disrompido. Este estudo abre portas para novas descobertas na área da reprodução mostrando o papel da PPP1CC2 na espermatogénese e fisiologia do esperma.