Manipulación de la senescencia de alfalfa (Medicago sativa L.) por ingeniería genética

En plantas forrajeras como la alfalfa, la senescencia foliar produce tanto una pérdida de la biomasa de forraje como una reducción de la calidad del mismo. Una estrategia molecular para retrasar la senescencia mediante la ingeniería genética se basa en la expresión de la secuencia codificante de la isopentenil transferasa (ipt), enzima clave en la biosíntesis de citoquininas. Para lograrlo resulta crítico la utilización de promotores con expresión no constitutiva que permitan la producción sitio-específica y autorregulada de citoquininas. La manipulación de la senescencia constituye un objetivo particularmente atractivo en especies forrajeras. Se transformaron clones de alfalfa con las construcción AtMYB32-ipt, se logró la regeneración de 3 plantas transgénicas, las cuales fueron confirmadas por PCR al amplificar el transgen ipt. La expresión del transgen se confirmó por RT-PCR y a través de la técnica de Southern blot se observó un patrón de inserción múltiple. También se estableció el patrón de expresión de la construcción AtMYB32-gus, la cual se limitó a los tejidos vasculares, con cierta variabilidad de expresión en la parte aérea las plantas. Los fenotipos observados en las plantas AtMYB32-ipt fueron desde plantas normales a plantas que perdieron la dominancia apical con raíces necrosadas en su mayoría. Se evaluó la senescencia foliar a través de bioensayos de hojas de plantas que incorporaron el transgen ipt y plantas que no lo incorporaron, se observó una senescencia foliar retrasada en plantas transgénicas, se cuantificó dicho retraso a través de los contenidos de clorofila a y b, proteínas foliares totales y cambios en el perfil de las proteínas foliares en geles SDS-PAGE (subunidad mayor de Rubisco). Se observó a los 35 días un mayor contenido de clorofila a y b, proteínas foliares y una mayor intensidad de las bandas de la subunidad mayor de Rubisco en las plantas que incorporaron el transgen ipt

La impronta humana sobre la estructura y el funcionamiento de ecosistemas subtropicales secos

Durante años los ecólogos y biogeógrafos han reconocido a los regimenes climáticos y a las condiciones del substrato como controles dominantes de la estructura y el funcionamiento de los ecosistemas. En la actualidad, un conjunto nuevo de controles emerge de las intervenciones que los humanos imponen (asociadas a la densidad poblacional, la riqueza, y la conectividad del paisaje). En esta tesis se describen el uso del suelo, y las características estructurales y funcionales de la vegetación, y se estudian sus controles biofísicos y humanos en regiones subtropicales secas (con lluvias estivales) a nivel global. Estas regiones, originalmente dominadas por formaciones leñosas, albergan en la actualidad una gran diversidad de contextos humanos y formas de manejo. La distribución global de las regiones se determinó a partir de bases de datos climáticas y topográficas. La caracterización del contexto humano, el uso del suelo y la producción de bienes, y la composición de la vegetación, se apoyó en datos cartográficos, estadísticas subnacionales, archivos fotográficos, e imágenes satelitales de alta resolución espacial. La cuantificación del funcionamiento del ecosistema se basó en el uso de información radiométrica proveniente de sensores remotos. Se determinaron cinco regiones en América del Norte y del Sur, África, Asia y Australia, incorporando condiciones semiáridas a subhúmedas. Los análisis implicaron caracterizaciones a nivel regional y local (mayor a 6000 puntos de muestreo), discriminando sistemas de uso no cultivados y cultivados. El reemplazo de la vegetación no cultivada fue variable, desde regiones en donde predominan los cultivos (aproximadamente 75 por ciento en Asia), hasta regiones en donde la fracción del territorio bajo este uso es mínima (aproximadamente 3 por ciento en Australia). Las intervenciones humanas (remoción de biomasa, pastoreo, aplicación de subsidios, etc.) han creado una gran variedad de patrones de vegetación/paisaje internamente en cada región. Los sistemas no cultivados desplegaron un gradiente de decreciente cobertura leñosa o creciente ocurrencia de parches antropogénicos en todas las regiones, que finalmente resultó en una productividad más baja e inestable. Sudamérica presentó los paisajes más leñosos o conservados y los más altos valores de productividad, mientras que Asia y Australia presentaron la mayor transformación de la cobertura y los valores más bajos de productividad. Los paisajes cultivados desplegaron un gradiente de creciente escala de producción no relacionado claramente con la productividad promedio de la vegetación. Norteamérica y Australia se asocian al extremo de mayor escala, mientras que África y Asia al de menor escala (Asia presentó aspectos de ambos extremos). Sudamérica en tanto, presentó nuevamente los valores más altos de productividad, aún sin contar con los altos subsidios que reciben los cultivos de Asia y Norteamérica, mientras que África presenta los valores más bajos. La densidad poblacional explicó la fracción agrícola cuando se consideran todas las regiones, pero la conexión a los mercados adquiere importancia en aquellas regiones más ricas y menos pobladas (Australia y Sudamérica). A nivel paisaje la presión poblacional perdió importancia determinando las características de sistemas no cultivados, siendo el nivel de pobreza y la conectividad los factores determinantes del grado de modificación de la cobertura leñosa. En sistemas cultivados, la pobreza y la densidad poblacional determinaron la escala y el grado de industrialización de la producción. La disponibilidad hídrica demostró un poder explicativo igual o menor que los factores humanos determinando la cobertura y el funcionamiento del ecosistema. Este factor tuvo una mayor importancia para sistemas no cultivados que cultivados. Los efectos de la transformación de un paisaje no cultivado a cultivado sobre la productividad dependieron de las características estructurales y funcionales de la vegetación bajo ambos tipos de uso. Así, el reemplazo trajo aumentos en la productividad en Asia, Australia, Sudamérica (cuando se consideraron las prácticas de riego), y disminuciones en Norteamérica y África. La contextualización de las condiciones pasadas o actuales de los ecosistemas permitió adquirir una base empírica para interpretar procesos clave involucrados en las interacciones entre sociedad y naturaleza. Visiones comparativas como las seguidas en esta tesis por lo tanto ayudarían a explorar caminos alternativos y estrategias de manejo de ecosistemas en un mundo con demandas crecientes por alimento, y en donde sostener o incrementar el capital natural y social es el gran desafío. En este sentido, se analiza la situación actual del Chaco Sudamericano en comparación con las restantes regiones, y se señalan aquellos aspectos fundamentales que llevarían a procesos de degradación de los ecosistemas ante los cambios en el uso a los que está sujeta esta región.

Estudio de una estrategia alternativa de ingeniería genética para incrementar la fijación biológica de nitrógeno atmosférico

Para satisfacer los altos rendimientos que impulsan la agricultura moderna la aplicación de fertilizantes nitrogenados ha sido fundamental. Dado que la base de la producción industrial de los fertilizantes químicos esta basado en el uso de combustibles fósiles, estos, actualmente, incrementan el costo económico debido a la disminución constante de las reservas de petróleo. Además, dada la baja eficiencia en el uso del fertilizante aplicado por parte de las plantas y el alto impacto ambiental debido a la emisión de óxido nitroso, resulta necesario emprender la búsqueda de nuevas estrategias para aumentar la concentración del nitrógeno fijado. Una de las propuestas para disminuir la aplicación de fertilizantes es el uso de microorganismos fijadores de nitrógeno; que ya son ampliamente utilizados en leguminosas por su capacidad de establecer asociaciones simbióticas; las cuales, lamentablemente, aún no han sido encontradas entre los principales cultivos de cereales. El objetivo del presente trabajo es la producción de una técnica de ingeniería genética que permita obtener bacterias fijadoras de nitrógeno recombinantes capaces de asociarse a distintos cultivos vegetales incrementando la productividad de los mismos. Para ello, los genes que sintetizan la nitrogenasa (nif), que están co-localizados en una isla genómica, en Pseudomonas stutzeri A1501 se transfirieron, vía el cósmido recombinante X940, a un promotor del crecimiento vegetal, Pseudomonas protegens Pf-5. La bacteria recombinante obtenida, P. protegens Pf-5 X940, fue capaz de crecer en medios de cultivo deficientes en nitrógeno o con el agregado de amonio; mostró una alta actividad nitrogenasa, liberando al medio de cultivo cantidades significativas de amonio y presentó expresión de los genes nif, sugiriendo que el proceso de fijación, en esta bacteria, es constitutivo. Las inoculaciones de especies vegetales (arabidopsis, alfalfa, festuca alta y maíz) con Pf-5 X940 aumentaron la concentración de amonio en el suelo y la productividad de las plantas en condiciones deficientes de nitrógeno. Estos resultados inician un nuevo camino hacia la producción efectiva de inoculantes recombinantes para la fijación de nitrógeno en un amplio rango de cultivos

Estudio de una estrategia alternativa de ingeniería genética para incrementar la fijación biológica de nitrógeno atmosférico

Para satisfacer los altos rendimientos que impulsan la agricultura moderna la aplicación de fertilizantes nitrogenados ha sido fundamental. Dado que la base de la producción industrial de los fertilizantes químicos esta basado en el uso de combustibles fósiles, estos, actualmente, incrementan el costo económico debido a la disminución constante de las reservas de petróleo. Además, dada la baja eficiencia en el uso del fertilizante aplicado por parte de las plantas y el alto impacto ambiental debido a la emisión de óxido nitroso, resulta necesario emprender la búsqueda de nuevas estrategias para aumentar la concentración del nitrógeno fijado. Una de las propuestas para disminuir la aplicación de fertilizantes es el uso de microorganismos fijadores de nitrógeno; que ya son ampliamente utilizados en leguminosas por su capacidad de establecer asociaciones simbióticas; las cuales, lamentablemente, aún no han sido encontradas entre los principales cultivos de cereales. El objetivo del presente trabajo es la producción de una técnica de ingeniería genética que permita obtener bacterias fijadoras de nitrógeno recombinantes capaces de asociarse a distintos cultivos vegetales incrementando la productividad de los mismos. Para ello, los genes que sintetizan la nitrogenasa (nif), que están co-localizados en una isla genómica, en Pseudomonas stutzeri A1501 se transfirieron, vía el cósmido recombinante X940, a un promotor del crecimiento vegetal, Pseudomonas protegens Pf-5. La bacteria recombinante obtenida, P. protegens Pf-5 X940, fue capaz de crecer en medios de cultivo deficientes en nitrógeno o con el agregado de amonio; mostró una alta actividad nitrogenasa, liberando al medio de cultivo cantidades significativas de amonio y presentó expresión de los genes nif, sugiriendo que el proceso de fijación, en esta bacteria, es constitutivo. Las inoculaciones de especies vegetales (arabidopsis, alfalfa, festuca alta y maíz)con Pf-5 X940 aumentaron la concentración de amonio en el suelo y la productividad de las plantas en condiciones deficientes de nitrógeno. Estos resultados inician un nuevo camino hacia la producción efectiva de inoculantes recombinantes para la fijación de nitrógeno en un amplio rango de cultivos