Characterization of CDK5RAP2 as a novel regulator in the Hippo signaling pathway

CEP161 is a novel component of the Dictyostelium discoideum centrosome and is the ortholog of mammalian CDK5RAP2. Mutations in CDK5RAP2 are associated with autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a neurodevelopmental disorder characterized by reduced head circumference, a reduction in the size of the cerebral cortex and a mild to moderate mental retardation. Here we show that the amino acids 1-763 of the 1381 amino acids of CEP161 protein are sufficient for centrosomal targeting and centrosome association. AX2 cells over-expressing truncated and full length CEP161 proteins have defects in growth and development. Furthermore, we identified the kinase SvkA (severinkinase A) as its interaction partner which is the D. discoideum Hippo related kinase designated here as Hrk-svk. Hrk-svk is the direct homolog of human MST1. Both proteins co-localize at the centrosome. We further demonstrate that this interaction is also conserved in mammals. We were able to show that CDK5RAP2 interacts with MST1 and TAZ and it also down-regulates the transcript levels of TAZ in HEK293T cells. Taken together, our data on Dictyostelium CEP161 and human CDK5RAP2 supports the hypothesis that CDK5RAP2 as a novel regulator of Hippo signaling pathway. We propose that CDK5RAP2 mutations may lead to a decrease in the number of neurons and the subsequent reduction of brain size by regulating the hippo signaling pathway.

Entwicklung von neuen Radiomarkierungsverfahren und deren Anwendung zur Synthese von Radiotracern für die Positronen-Emissions-Tomographie

In den letzten 30 Jahren hat sich die Positronen Emissions Tomographie (PET) zu einem der wichtigsten Instrumente in der klinischen Diagnostik entwickelt. Neben den ständigen technischen Verbesserungen verdankt die PET ihren klinischen Stellenwert vor allem dem ihr inhärenten Potenzial, physiologische und biochemische Prozesse auf molekularer Ebene und in Echtzeit darzustellen. Aufgrund der wachsenden Zahl neuer und krankheitsspezifischer Radiotracer nimmt sie auch auf dem Gebiet der Wirkstoffentwicklung sowie beim Monitoring von pharmakologischen Interventionen eine immer wichtigere Rolle ein. Grundlegend hierfür ist einerseits das intelligente Design innovativer und selektiver molekularer Sonden mit der Fähigkeit zur Visualisierung molekularer Targets, die in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen involviert sind und andererseits die Entwicklung der dafür notwendigen fortschrittlichen Markierungsstrategien. Letzteres ist zentraler Bestandteil der radiochemischen Grundlagenforschung und Hauptgegenstand dieser kumulativen Promotionsarbeit, in dessen Rahmen ein neues „minimalistisches“ Protokoll zur Radiofluorierung ausgearbeitet wurde. Die Entwicklung der sog. „minimalistische“ Methode ermöglicht eine vereinfachte und zeitsparende Herstellung von unterschiedlichsten 18F-markierten Verbindungen, da sie weder der azeotropen Trocknung noch des Zusatzes einer Base oder anderer Additive bedarf. Das neue Radiomarkierungsverfahren umfasst eine direkte Elution von 18F- mittels alkoholischer Lösung der Ammonium-, Diaryliodonium- oder Triarylsulfoniumsalz Vorläufern. Nach Entfernung des Alkohols wird das resultierende [18F]Fluoridsalz in einem geeigneten Lösungsmittel erhitzt. Die hohe Effizienz der auf der „minimalistischen“ Methode basierenden Synthese bietet somit auch einen schnellen Zugang zu 18F-markierten Fluorbenzaldehyden ([18F]FBAs) in großen Aktivitätsmengen, was einen entscheidenden Vorteil für die Entwicklung neuer Markierungsmethoden mit Hilfe dieses Radiomarkierungsbausteins darstellt. Darauf aufbauend wurde, ausgehend von [18F]FBA, auf der Basis der Seyferth-Gilbert Homologisierung, ein innovatives Verfahren zur Synthese von bisher unbekannten 18F-markierten Fluorarylacetylenen entwickelt. Hierdurch konnten über Cycloadditions- und Kreuzkupplungsreaktionen unterschiedliche radiomarkierte Modellverbindungen sowie PET-Tracer hergestellt und somit die Vielseitigkeit der neuen radiomarkierten Synthone aufgezeigt werden. Die durch die „minimalistische“ Methode gesteigerte Effizienz der Synthese von [18F]FBA ermöglicht es ebenfalls, den bereits in der Literatur bekannten Markierungsbaustein C-(4-[18F]Fluorphenyl)-N-phenylnitron [18F]FPPN in ausreichenden Mengen zu produzieren und für die zielgerichtete Synthese diverser radiofluorierter -Lactame über die Kinugasa-Reaktion einzusetzen. Mit dem Erhalt der radiofluorierten β-Lactam-Peptid und -Protein-Konjugate in hohen radiochemischen Ausbeuten unter sehr milden Bedingungen, konnte die Eignung der Kinugasa-Reaktion als neues und leistungsstarkes Radiofluorierungsverfahren eindrucksvoll demonstriert werden. 

Auswirkungen von Traumata auf Entstehung und Verlauf von somatoformen Beschwerden sowie die Wirksamkeit von psychodynamischer Psychotherapie bei dieser Patientengruppe

Zusammenhänge zwischen Trauma und Somatisierung wurden empirisch vielfach belegt. Zur Erklärung des Zusammenhangs bestehen verschiedene Theorien, u.a. die der unterbrochenen Handlung (Fischer, 2000, 2007), der unterbrochenen Informationsverarbeitung (Bering, 2011), der Dissoziation (Nijenhuis, 2004) und der Alexithymie (Krystal, 1979). Unklar ist, welche Art der Therapie traumatisierten, somatisierenden Patienten hilft, da die Psychosomatik als Outcome in der Traumatherapieforschung bislang häufig vernachlässigt wurde. In der vorliegenden Promotion wurde der Zusammenhang von Trauma und somatoformen Beschwerden sowie die Wirksamkeit psychodynamischer Psychotherapie bei dieser Patientengruppe untersucht. Hierzu wurde eine klinische, naturalistische Längsschnittstudie mit Prätest-Posttest-Design an einer Stichprobe ambulanter Psychotherapiepatienten durchgeführt. Die Ergebnisse (N = 248) zeigen, dass zwei Drittel der Somatisierungsvarianz mittels Traumata (insbesondere vor dem 6. Lj.), posttraumatischer und dissoziativer Symptomatik aufgeklärt werden können. Physische und sexuelle Gewalt sind die Subformen, die die stärksten Zusammenhänge mit Somatisierung aufweisen. Der Zusammenhang zwischen traumatischen Ereignissen und Somatisierung wird insbesondere durch PTBS-Symptomatik moderiert und durch Dissoziation partiell mediiert. Die längsschnittlichen Ergebnisse (n = 83) zeigen, dass nach psychodynamischer Psychotherapie (durchschnittlich 79 Std.) moderate bis große Effekte bezüglich der Verbesserung des Funktionsniveaus, der Reduktion der posttraumatischen, alexithymen, allgemeinpsychopathologischen, somatoformen und dissoziativen Symptome vorliegen. Entgegen der Hypothese liegt keine signifikante Veränderung der Inanspruchnahme des Gesundheitssystems vor. Negative Prädiktoren des Therapieverlaufs im Hinblick auf die Somatisierung sind Traumata (insbesondere vor dem 6. Lj.) sowie tendenziell starke Dissoziation und Alexithymie zu Therapiebeginn. Die Therapiedosis erweist sich als positiver, jedoch nicht signifikanter Prädiktor des Therapieerfolgs. Die Ergebnisse zeigen, dass somatoforme Symptome als Folge von Traumatisierung eher die Regel als die Ausnahme darstellen und durch Traumatherapie beeinflusst werden können. Sie verweisen zudem auf die Relevanz der Psychosomatik als Outcome in der Traumatherapieforschung. Zu diskutierende Limitationen der Untersuchung sind die reduzierte interne Validität des Feldstudiendesigns, das Fehlen einer Kontrollgruppe, die Auswahl der Outcome-Variablen inklusive des weitgehenden Fehlens multimodaler Bewertungen.

Proficiency and mechanisms of perturbation of mature T-cell homeostasis by the TCL1 family of oncogenes

In the first part of this thesis, the oncogenic potential of TCL1A family genes was comparatively evaluated by using gamma-retroviral vectors to introduce human TCL1A, MTCP1, and TML1 into hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells (HSC/HPC) of wild type mice that were transplanted into wild type recipients. TCL1A and MTCP1 recipient mice predominantly developed B-cell malignancies after a median survival of 388 days and 394 days, respectively. The presented data indicates that TCL1A and MTCP1 are oncogenes with comparable oncogenic potential and shows for the first time that MTCP1 is not only a T-cell oncogene, but is able to transform B cells as well. The third family member TML1 induced the development of immature T-cell malignancies in only a few mice. This study provides first evidence for its oncogenic function. Additionally, the transforming potential of compartment-targeted TCL1A variants was evaluated by retroviral expression of a membrane localizing myristoylated (myr-TCL1A) and a nuclear localizing (nls-TCL1A) variant. Recipients of HSC/HPC transduced with myr-TCL1A and nls-TCL1A predominantly developed B-cell malignancies after a median survival of 360 days and 349 days, respectively. There was a significantly shorter latency period for nls-TCL1A compared to the previously described generic TCL1A. Gene expression analysis revealed higher similarities between expression profiles of tumors induced by TCL1A and nls-TCL1A. Together these data implicate that TCL1A’s predominant oncogenic function might rely on its nuclear presence. The second part of this thesis aims to understand if and how TCR stimulation affects the transforming potential of TCL1A. Mature OT-1 T cells carrying monoclonal TCR’s that specifically recognize ovalbumin (OVA) were retrovirally transduced with TCL1A and repeatedly stimulated in vivo with OVA-peptides. TCR stimulated recipient mice of TCL1A transduced T cells showed a significantly accelerated leukemic outgrowth and a reduced median survival of 305 days, when compared to unstimulated recipients (417 days). These data strongly implicate a pro-leukemogenic cooperation of TCL1A and TCR signals that might be actionable in upcoming interventional designs.