Purificação, modelagem e simulação da adsorção de bioprodutos por troca iônica em coluna de leito expandido

A produção de proteínas através de microrganismos tornou-se uma técnica muito importante na obtenção de compostos de interesse da indústria farmacêutica e alimentícia. Extratos brutos nos quais as proteínas são obtidas são geralmente complexos, contendo sólidos e células em suspensão. Usualmente, para uso industrial destes compostos, é necessário obtê-los puros, para garantir a sua atuação sem interferência. Um método que vem recebendo destaque especialmente nos últimos 10 anos é o uso da cromatografia de troca iônica em leito expandido, que combina em uma única etapa os passos de clarificação, concentração e purificação da molécula alvo, reduzindo assim o tempo de operação e também os custos com equipamentos para realização de cada etapa em separado. Combinado a este fato, a última década também é marcada por trabalhos que tratam da modelagem matemática do processo de adsorção de proteínas em resinas. Está técnica, além de fornecer informações importantes sobre o processo de adsorção, também é de grande valia na otimização da etapa de adsorção, uma vez que permite que simulações sejam feitas, sem a necessidade de gasto de tempo e material com experimentos em bancada, especialmente se é desejado uma ampliação de escala. Dessa forma, o objetivo desta tese foi realizar a modelagem e simulação do processo de adsorção de bioprodutos em um caldo bruto na presença de células, usando inulinase e C-ficocianina como objeto de estudo e purificar C-ficocianina utilizando resina de troca iônica em leito expandido. A presente tese foi então dividida em quatro artigos. O primeiro artigo teve como objeto de estudo a enzima inulinase, e a otimização da etapa de adsorção desta enzima em resina de troca iônica Streamline SP, em leito expandido, foi feita através da modelagem matemática e simulação das curvas de ruptura em três diferentes graus de expansão (GE). As máximas eficiências foram observadas quando utilizadas maiores concentrações de inulinase (120 a 170 U/mL), e altura de leito entre 20 e 30 cm. O grau de expansão de 3,0 vezes foi considerado o melhor, uma vez que a produtividade foi consideravelmente superior. O segundo artigo apresenta o estudo das condições de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica, onde foi verificado o efeito do pH e temperatura na adsorção e após construída a isoterma de adsorção. A isoterma de adsorção da C-ficocianina em resina Streamline Q XL feita em pH 7,5 e a 25°C (ambiente), apresentou um bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores qm (capacidade máxima de adsorção) e Kd (constante de equilíbrio) estimados pela equação linearizada da isoterma, foram de 26,7 mg/mL e 0,067mg/mL. O terceiro artigo aborda a modelagem do processo de adsorção de extrato não clarificado de C-ficocianina em resina de troca iônica Streamline Q XL em coluna de leito expandido. Três curvas de ruptura foram feitas em diferentes graus de expansão (2,0, 2,5 e 3,0). A condição de adsorção de extrato bruto não clarificado de C-ficocianina que se mostrou mais vantajosa, por apresentar maior capacidade de adsorção, é quando se alimenta o extrato até atingir 10% de saturação da resina, em grau de expansão 2,0, com uma altura inicial de leito de 30 cm. O último artigo originado nesta tese foi sobre a purificação de C-ficocianina através da cromatografia de troca iônica em leito expandido. Uma vez que a adsorção já havia sido estudada no artigo 2, o artigo 4 enfoca na otimização das condições de eluição, visando obter um produto com máxima pureza e recuperação. A pureza é dada pela razão entre a absorbância a 620 nm pela absorbância a 280 nm, e dizse que quando C-ficocianina apresenta pureza superior a 0,7 ela pode ser usada em como corante em alimentos. A avaliação das curvas de contorno indicou que a faixa de trabalho deve ser em pH ao redor de 6,5 e volumes de eluição próximos a 150 mL. Tais condições combinadas a uma etapa de pré-eluição com 0,1M de NaCl, permitiu obter C-ficocianina com pureza de 2,9, concentração 3 mg/mL, e recuperação ao redor de 70%.

Produção e purificação de biogás utilizando microalga spirulina sp. LEB-18

O crescimento da população mundial e a tentativa de substituição parcial dos combustíveis fósseis por novas fontes de energia têm levado a uma maior atenção quanto à possível escassez de alimentos e a carência de grandes áreas disponíveis para agricultura. Microalgas, por meio do metabolismo fotossintético, utilizam energia solar e gás carbônico como nutrientes para o crescimento. A microalga Spirulina pode ser utilizada como suplemento alimentar, na biofixação de CO2, como fonte de biocombustíveis e no tratamento de efluentes. A digestão anaeróbia da biomassa microalgal produz biogás e os resíduos deste processo podem ser utilizados como substrato para novos cultivos da microalga. O objetivo deste trabalho foi estudar a conversão de Spirulina sp. LEB-18 em biogás em escala piloto e produzir biomassa microalgal utilizando os efluentes bicarbonato e dióxido de carbono do processo anaeróbio como fonte de nutrientes. Spirulina foi utilizada como substrato na digestão anaeróbia para produção de biogás em escala piloto sob temperaturas variáveis (12- 38 °C). Efluente do processo anaeróbio foi adicionado (20 %, v/v) como fonte de carbono no cultivo da microalga para avaliar o crescimento e a composição da biomassa. A seguir foi avaliada a capacidade da microalga de remover CO2 presente no biogás através de biofixação para obtenção do biocombustível purificado. O biogás produzido sob as diferentes temperaturas apresentou entre 72,2 e 74,4 % de CH4, quando realizado nas temperaturas 12 a 21 °C e 26 a 38 °C, respectivamente. A redução na temperatura do processo anaeróbio provocou um decréscimo na conversão de biomassa em biogás (0,30 para 0,22 g.g-1 ), ocorrendo dentro da faixa adequada e segura para as bactérias metanogênicas (pH 6,9; alcalinidade entre 1706,0 e 2248,0 mg.L-1 CaCO3 e nitrogênio amoniacal 479,3 a 661,7 mg.L-1 ). Os cultivos de Spirulina sp. LEB-18 em efluente anaeróbio contendo 20 % (v/v) e meio Zarrouk modificado (NaHCO3 2,8 e 5,3 g.L-1 ) apresentaram velocidade específica máxima de crescimento entre 0,324 e 0,354 d-1 , produtividade volumétrica entre 0,280 e 0,297 g.L-1 .d-1 e produtividade areal entre 14,00 e 14,85 g.m-2 .d-1 , sem diferenças significativas (p > 0,05) entre as diferentes condições estudadas. Lipídios variaram entre 4,9 e 5,0 % com proporção de ácido linoleico maximizada nos meios com efluente e ácido alfa-linolênico reduzida nesses meios em comparação ao meio Zarrouk completo. Nos ensaios para avaliar a capacidade da microalga Spirulina sp. LEB-18 de remover CO2 contaminante no biogás, as máximas concentrações celulares e produtividades de biomassa variaram, respectivamente, entre 1,12 e 1,24 g.L-1 e 0,11 e 0,14 g.L-1 .d-1 , não apresentando diferenças significativas (p > 0,05) entre os ensaios. A maior fixação diária total (FDT) de dióxido de carbono obtida foi 58,01 % (v/v) em cultivos com adição de biogás contendo 25 % (v/v) CO2. Obteve-se biogás com 89,5 % (v/v) de CH4 após injeção em cultivos de Spirulina, no qual aproximadamente 45 % (v/v) do CO2 injetado foi fixado pela microalga, gerando biomassa para diversas aplicações e biogás purificado.

Purificação de C-ficocianina e sua incorporação em nanofibras

C-ficocianina (C-FC) é uma ficobiliproteína, de cor natural azul, com diversas aplicações na indústria alimentícia, farmacêutica e biomédica, dependendo do seu grau específico de pureza, que pode variar de 0,7 a 4,0, com respectivo aumento de seu valor comercial. Essa pureza é alcançada através de diversas técnicas de purificação, que podem ser aplicadas em diferentes sequências. Um destes processos de purificação de proteínas baseia-se na cromatografia de troca iônica, que utiliza trocadores que adsorvem as proteínas como resultado de interações iônicas entre a superfície da proteína e o trocador. Resinas e colunas de leito expandido podem ser utilizadas para aumentar a produtividade dessa técnica. É fundamental conhecer o perfil do processo de adsorção, para melhor aplicá-lo como ferramenta para o design e otimização de parâmetros operacionais. Outra tecnologia para o tratamento de biomoléculas é a ultrafiltração. Esta técnica é aplicável em larga escala, apresenta baixa complexidade de aplicação e pode ser realizada em condições brandas, minimizando o dano para o produto. Para aumentar a estabilidade da C-FC, e facilitar a sua aplicação, podem ser avaliadas técnicas recentes, não exploradas para este fim, como as nanofibras obtidas através do processo de electrospinning. Estas fibras possuem uma área superficial específica extremamente elevada devido a seu pequeno diâmetro. O objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros de adsorção e diferentes técnicas para purificação de C-ficocianina de Spirulina platensis e obter nanofibras poliméricas incorporadas de C-ficocianina. O trabalho foi dividido em quatro artigos. No primeiro artigo, foram avaliados os parâmetros e as isotermas de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica para leito expandido Streamline® DEAE. Verificou-se que o maior coeficiente de partição foi obtido em pH 7,5, nas temperaturas de 15 e 25 °C. As isotermas de adsorção da Cficocianina foram bem representadas pelos modelos de Langmuir, de Freundlich e de Langmuir-Freundlich, sendo os valores estimados para Qm e Kd obtidos pela isoterma de Langmuir foram, respectivamente, 33,92 mg.mL-1 e 0,123 mg.mL-1, respectivamente. No segundo artigo foi avaliada a purificação de C-FC até grau alimentar, utilizando ultrafiltração (UF). Com a membrana de 50 kDa, identificou-se que somente a temperatura e a aplicação de diferentes ciclos de diafiltração (DF) causaram influência significativa sobre a purificação e recuperação da C-ficocianina. Foram então aplicados o aumento gradativo da quantidade de ciclos, e a diafiltração previamente à ultrafiltração (DF/UF), onde obteve-se um extrato de Cficocianina com pureza de 0,95. No terceiro artigo foram propostos processos de purificação, envolvendo a utilização das diferentes técnicas para obtenção de C-FC com diferentes purezas. Determinou-se que a partir de cromatografia de troca iônica em leito fixo seguido de DF/UF, obtém-se C-FC para uso em cosméticos e a partir de precipitação com sulfato de amônio, e DF/UF obtém-se C-FC para uso em biomarcadores. Com uma sequência de precipitação com sulfato de amônio, DF/UF e cromatografia de troca iônica em leito fixo chega-se a C-FC de grau analítico. No último artigo, C-FC foi incorporada a nanofibras de óxido de polietileno (PEO) através de processo de electrospinning. Foram determinadas a condutividade da solução de C-FC/PEO, a estrutura e comportamento termogravimétrico das nanofibras formadas. Soluções de polímeros com concentração de 6 e 8% proporcionaram a formação de nanofibras com diâmetro médio inferior a 800 nm, homogêneas, sem a presença de gotas. A análise termogravimétrica identificou aumento na resistência térmica da C-FC incorporada nas fibras.

Redução dos níveis de Ocratoxina A por ação da enzima peroxidase

A ocratoxina A é um composto formado a partir do metabolismo secundário de fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. Uma vez que a presença dessa micotoxina nos alimentos causa sérios danos à saúde humana e animal, surge o interesse pelo desenvolvimento de métodos que visem a redução dos seus níveis em diferentes matrizes. Diversos processos de descontaminação têm sido propostos, sendo que os métodos de redução biológica tem recebido destaque. Esses métodos consistem na aplicação de micro-organismos ou de suas enzimas, o que gera a biotransformação ou degradação da toxina produzindo metabólitos com menor ou nenhuma toxicidade. Diante disso, o objetivo geral do trabalho foi avaliar o efeito da peroxidase na redução dos níveis de ocratoxina A. As enzimas peroxidases testadas foram a comercial e a obtida do farelo de arroz. Para a extração enzimática foram utilizadas as frações granulométricas do farelo de arroz de 48 a 100 mesh, sendo estas frações caracterizadas quimicamente. A peroxidase foi extraída do farelo de arroz em tampão 10 mM pH 5,0 e purificada por partição trifásica, obtendo 77,1% de recuperação e 9,2 para o fator de purificação. O método utilizado para a extração da ocratoxina A do sistema aquoso foi por partição líquido-líquido utilizando como solvente o clorofórmio, sendo esse método validado segundo os parâmetros de linearidade (0,1 a 20 ng mL-1), coeficientes de correlação (0,9997) e de determinação (0,9994), e limites de detecção (0,02) e quantificação (0,03). A afinidade entre as peroxidases e a ocratoxina A foi verificada segundo os parâmetros de KM e Vmáx, resultando em 0,00027 mM e 0,000015 mM min-1, respectivamente, para a peroxidase comercial, e 0,0065 mM e 0,000031 mM min-1 para a obtida do farelo de arroz. Com relação aos percentuais de redução de ocratoxina A, foram avaliadas 3 proporções enzima:substrato (1:10, 1:5 e 8:1 para a comercial e 1:10, 1:5 e a com atividade de 0,063 U mL-1 para a do farelo), sendo que as proporções que forneceram maior redução foi a de 8:1 para a enzima comercial (0,063 U mL-1) e a correspondente a 0,063 U mL-1 para a enzima obtida do farelo. Os percentuais de redução de ocratoxina A foram de 59% para a peroxidase comercial em 300 min e 41% para a peroxidase do farelo de arroz em 1440 min. O efeito de adsorção da ocratoxina A pela enzima peroxidase foi descartado uma vez que foi realizada a sua hidrólise com a enzima pepsina e verificado um percentual de 2,7% de adsorção, demonstrando que a redução foi por ação enzimática. A enzima obtida de farelo de arroz com atividade de 0,063 U mL-1 foi aplicada em suco de uva tinto e branco. Observou-se que para o primeiro não houve redução significativa, enquanto que para o segundo a redução foi de 17%. Neste trabalho, então, foi possível verificar a capacidade de redução dos níveis da ocratoxina A pela enzima peroxidase, tanto em sistema aquoso como no suco de uva integral branco.

Síntese, extração e caracterização de biopolímeros de origem microalgal para desenvolvimento de nanofibras

Pesquisas com microalgas estão crescendo devido aos possíveis bioprodutos oriundos de sua biomassa, bem como as suas diferentes aplicabilidades. Microalgas podem ser cultivadas para a produção de biopolímeros com características de biocompatibilidade e biodegradabilidade. Nanofibras produzidas por electrospinning a partir de poli-β-hidroxibutirato (PHB) geram produtos com aplicabilidade na área de alimentos e médica. O objetivo deste trabalho foi selecionar microalgas com maior potencial para síntese de biopolímeros, em diferentes meios de cultivo, bem como purificar poli-β-hidroxibutirato e desenvolver nanofibras. Este trabalho foi dividido em cinco artigos: (1) Seleção de microalgas produtoras de biopolímeros; (2) Produção de biopolímeros pela microalga Spirulina sp. LEB 18 em cultivo com diferentes fontes de carbono e redução de nitrogênio; (3) Síntese de biopolímeros pela microalga Spirulina sp. LEB 18 em cultivos autotróficos e mixotróficos; (4) Purificação de poli-β- hidroxibutirato extraído da microalga Spirulina sp. LEB 18; e (5) Produção de nanofibras a partir de poli-β-hidroxibutirato de origem microalgal. Foram estudadas as microalgas Cyanobium sp., Nostoc ellipsosporum, Spirulina sp. LEB 18 e Synechococcus nidulans. Os biopolímeros foram extraídos nos tempos de 5, 10, 15, 20 e 25 d de cultivo a partir de digestão diferencial. Para os experimentos com diferentes nutrientes, foi utilizado como fonte de carbono, bicarbonato de sódio, acetato de sódio, glicose e glicerina modificando-se as concentrações de nitrogênio e fósforo. Os cultivos foram realizados em fotobiorreatores fechados de 2 L. A concentração inicial de inóculo foi 0,15 g.L-1 e os ensaios foram mantidos em estufa termostatizada a 30 ºC com iluminância de 41,6 µmolfótons.m -2 .s -1 e fotoperíodo 12 h claro/escuro. Para a purificação de PHB, foi utilizada a biomassa da cianobactéria Spirulina sp. LEB 18, cultivada em meio Zarrouk. Após a extração do biopolímero bruto, a amostra foi desengordurada com hexano e purificada com 1,2-carbonato de propileno. Foram determinadas as purezas e as propriedades térmicas no PHB purificado. O biopolímero utilizado para produzir as nanofibras apresentava 70 % de pureza. A técnica para produção de nanofibras foi o electrospinning. As microalgas que apresentaram máxima produtividade foram Nostoc ellipsosporum e Spirulina sp. LEB 18 com rendimento de biopolímero 19,27 e 20,62 % em 10 e 15 d, respectivamente, na fase de máximo crescimento celular. O maior rendimento de biopolímeros (54,48 %) foi obtido quando se utilizou 8,4 g.L-1 de NaHCO3, 0,05 g.L-1 de NaNO3 e 0,1 g.L-1 de K2HPO4. A condição que proporcionou maior pureza do PHB foi a 130 ºC e 5 min de contato entre o solvente (1,2-carbonato de propileno) e o PHB. As análises térmicas para todas as amostras foram semelhantes em relação ao PHB padrão (Sigma-Aldrich). A purificação com 1,2-carbonato de propileno foi eficiente para o PHB extraído de microalga, alcançando pureza acima de 90 %. A condição que apresentou menores diâmetros de nanofibras foi ao utilizar solução contendo 20 % de biopolímero solubilizado em clorofórmio. As condições do electrospinning que apresentou nanofibras com diâmetros de 470 e 537 nm foram, vazão 150 µL.h-1 , diâmetro do capilar 0,45 mm e voltagens entre 24,1 e 29,6 kV, respectivamente. A microalga Spirulina sp. LEB 18 produz PHB ao utilizar menores concentrações de nutrientes no meio de cultivo, que pode ser purificado com 1,2-carbonato de propileno. Este biopolímero possui aplicabilidade para produção de nanofibras.

A influência da incorporação de ácido α-eleosteárico, purificado e isolado do óleo de tungue, na dinâmica molecular de lipossomos

Este trabalho descreve o isolamento e purificação do ácido α-eleosteárico (α-ESA) a partir do óleo de tungue e sua caracterização por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de massas (GC-MS) e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C. O α-ESA apresenta atividades biológicas (antitumorais, anti-inflamatórias e antioxidantes), tornando-se importante compreender sua interação com membranas lipídicas. Assim, este trabalho também descreve resultados referentes ao efeito da incorporação de α-ESA na dinâmica molecular de lipossomos compostos por fosfatidilcolina. O sistema lipossomal puro e contendo α-ESA foi caracterizado através do uso de espectroscopia de UV-visível, FTIR, RMN e calorimetria de varredura diferencial (DSC). Como resultados da purificação do α-ESA, obtivemos uma pureza de 95,9% utilizando acetona como solvente de recristalização em detrimento dos 92,2% em solução etanólica. Na incorporação em lipossomos, observou-se uma maior interação do α-ESA com a parte polar, de interface e os primeiros metilenos da região apolar da fosfatidilcolina. Além disso, α-ESA apresentou um efeito de redução da fluidez de lipossomos. Os resultados contribuem para a geração de conhecimento para o desenvolvimento de novos sistemas farmacológicos.

Aplicação de peroxidase para degradação de deoxinivalenol

Deoxinivalenol (DON), uma das principais micotoxinas encontradas em matrizes alimentares, é um composto químico que possui em sua estrutura um anel epóxido que lhe confere alto grau de toxicidade. A aplicação de enzimas em processos de degradação de DON vem se destacando, pela estabilidade durante o processo reacional e baixo custo de produção. O objetivo desse trabalho foi estudar o potencial de peroxidase proveniente de farelo de arroz (FA) e farelo de soja (FS) para degradar DON. As condições de obtenção da PO a partir de FA foram definidas por planejamento experimental DCCR 23 , sendo extraída de 5 g de farelo com 50 mL de tampão fosfato 0,04 mol L-1 pH 5, agitados orbitalmente durante 60 min a 100 rpm, e para a PO obtida de FS as condições diferenciaram somente quanto a solução extratora, tampão fosfato 0,01 mol L-1 pH 4,7. A técnica que apresentou melhores índices de purificação para a enzima foi a partição trifásica apresentando fator de purificação e recuperação de 5,6 e 50 % para a obtida de FA e 13,61 e 50 % para FS. A PO de FA apresentou maior atividade em tampão fosfato 5 mmol L-1 pH 5,5 para as formas bruta e pura, diferindo na temperatura de reação de 25 °C e 10 °C, KM de 0,15 e 0,06 mmol L-1 e Vmáx de 769 e 667 U mg-1 , respectivamente. A PO de FS as condições foram: tampão fosfato 5 mmol L-1 pH 5, reação a 35 e 30 °C durante 10 e 5 min, KM de 0,17 e 0,05 mmol L-1 e Vmáx de 196 e 182 U mg-1 , respectivamente. A PO de FA demonstrou maior estabilidade em pH 5 enquanto que a de FS em pH 6, ambas enzimas apresentaram maior estabilidade térmica a 0 °C, as massas moleculares encontradas por eletroforese foram 41 e 34 kDa, respectivamente. Ao final das etapas de obtenção, purificação e caracterização obteve-se uma atividade específica de 116 e 794 U.mg-1 , e 4363 e 17453 U g-1 , respectivamente para PO de FA e FS. A determinação de DON e De-DON foi realizada por HPLC-DAD e LC-ESI-MS/MS para avaliação dos ensaios de degradação. A enzima comercial HRP, mostrou maior potencial de redução sobre DON (55% após 1 h de reação), no entanto em 3 h de reação, a concentração inicial da micotoxina DON foi verificada, o que evidencia que a redução pode ocorrer por adsorção ou por formação de um composto de degradação que apresente a mesma massa molecular. O emprego da enzima PO obtida de FA e FS na degradação necessita de uma avaliação cinética micotoxicologica para definição das condições de redução significativa dos níveis de DON.

Obtenção e caracterização de queratinase de bacillus sp. P45 a partir de coprodutos e aplicação na produção de queijos cremosos enriquecidos com chia e quinoa

As proteases constituem 60-65% do mercado global das enzimas industriais e são utilizadas na indústria de alimentos no processo de amaciamento de carne, na síntese de peptídeos, preparo de fórmulas infantis, panificação, cervejarias, produtos farmacêuticos, diagnósticos médicos, como aditivos na indústria de detergentes e na indústria têxtil no processo de depilação e transformação do couro. Proteases específicas produzidas por micro-organismos queratinolíticos são chamadas de queratinases e distinguem-se de outras proteases pela maior capacidade de degradação de substratos compactos e insolúveis como a queratina. Atualmente, processos que apontem o uso total das matérias-primas e que não resultem em impactos negativos ao meio ambiente tem ganhado destaque. Dentro desta temática, destacam-se a reutilização da farinha de penas residual durante o cultivo do Bacillus sp. P45 para produção de proteases e a biomassa residual de levedura, ambas com elevados teores de proteínas, podendo ser utilizadas no cultivo do Bacillus sp. P45 para obtenção de proteases. O objetivo deste trabalho foi obter a enzima queratinase purificada em grandes quantidades, sua caracterização, bem como a sua aplicação em processos de coagulação enzimática do leite para o desenvolvimento de um queijo cremoso enriquecido com farinha de chia e quinoa. Além disso, aplicar diferentes coprodutos para produção de enzimas proteolíticas e queratinolíticas. A presente tese foi dividida em quatro artigos: no primeiro foi realizado a obtenção da queratinase purificada em maiores quantidades e a determinação dos parâmetros de estabilidade térmica e a influência de componentes químicos na atividade enzimática. A obtenção da enzima em maiores quantidades alcançou fatores de purificação de 2,6, 6,7 e 4,0 vezes, paras 1º SAB, 2º SAB e diafiltração, respectivamente. A recuperação enzimática alcançou valores de 75,3% para o 1º SAB, 75,1% no 2º sistema e 84,3% na diafiltração. A temperatura de 55ºC e o pH 7,5 foram determinados como ótimos para atividade da enzima queratinase. O valor da energia de desativação (Ed) médio foi de 118,0 kJ/mol e os valores de z e D variaram de 13,6 a 18,8ºC, e 6,9 a 237,3 min, respectivamente. Além disso a adição de sais (CaCl2, CaO, C8H5KO4 e MgSO4) elevou a atividade da enzima na presença destes compostos. O segundo artigo apresenta a aplicação da queratinase como coagulante de leite bovino e sua aplicação na obtenção de queijo cremoso enriquecido com chia e quinoa. A enzima mostrou atividade de coagulação semelhante ao coagulante comercial, na concentração de 30mg/mL. A enzima purificada foi empregada de forma eficiente na fabricação do queijo cremoso, que apresentou valores de pH de 5,3 e acidez de 0,06 a 0,1 mol/L, com elevação durante os 25 dias de armazenamento. O terceiro artigo apresenta o perfil do queijo cremoso enriquecido com farinha de chia e quinoa, o qual apresentou alto índice de retenção de água (>99,0%) e baixos valores de sinérese (<0,72%). Elevados teores de fibras foi verificado (3,0 a 5,0%), sugerindo seu consumo como fonte de fibras. As análises microbiológicas foram de acordo com a legislação vigente. Na análise sensorial foi verificado altos valores de suavidade ao paladar e verificado maiores valores de consistência e untabilidade nas amostras com maiores concentrações de nata e quinoa. O quarto artigo traz a extração de β-galactosidase por ultrassom e o uso da biomassa residual da levedura, bem como o uso de farinha de penas residuais como substrato para obtenção de proteases. O ultrassom foi eficiente para ruptura celular e extração de β-galactosidase, apresentando alta atividade (35,0 U/mL) e rendimento (876,0 U/g de biomassa). A maior atividade proteolítica (1300 U/mL em 32 h) e queratinolítica (89,2 U/mL) verificadas ocorreram utilizando-se a biomassa e a farinha de penas residuais, respectivamente. Maior produtividade proteolítica (40,8 U/mL/h) foi verificado no meio utilizando biomassa residual como substrato. Já a maior produtividade queratinolítica (2,8 U/mL/h) foi alcançada utilizando farinha de penas reutilizada.

Ação fotodinâmica da C-Ficocianina, pigmento extraído da Spirulina platensis, nas linhagens tumorais humanas K562 (não MDR) e K562 – Lucena 1 (MDR)

A C-ficocianina (C-FC), um pigmento comum nas cianobctérias e um dos mais abundantes constituintes da Spirulina platensis, vem sendo estudada por possuir várias propriedades como antioxidante, hepatoprotetora, antiinflamatória e inibidora da enzima COX-2. Alguns autores atribuem também a C-FC um efeito oxidante quando ela é o agente fotossensibilizante utilizado na terapia fotodinâmica (TFD), podendo ser um importante agente no tratamento do câncer. Entretanto ainda pouco se sabe sobre a ação da C-FC, como substância fotosensibilizante, no tratamento de ação fotodinâmica (AFD) em modelos biológicos. A AFD provoca a fotooxidação de substratos biológicos através da geração de espécies reativas de oxigênio produzidas pela associação entre um determinado comprimento de onda, uma substância fotosensível e oxigênio. Existem dois caminhos que levam a morte celular pelo processo de fotooxidação conhecidos como mecanismo do tipo I e tipo II. No mecanismo tipo I são gerados radicais como o radical ânion superóxido e radical hidroxila, enquanto no mecanismo do tipo II a espécie reativa de oxigênio gerada é o oxigênio singlete (1O2). A TFD da C-PC possui muitas vantagens em relação ao uso das hematoporfirinas e seus derivados, como rápida preparação e fácil purificação, ampla faixa de absorção do UV e visível, nenhum efeito local, e significativa redução da fotosensibilidade em tecidos normais por ter uma rápida metabolização em vivo. As pesquisas que avaliam os possíveis efeitos celulares da AFD têm sido também estendidas para as células tumorais que adquirem fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR). A MDR é um fenômeno no qual células tumorais, selecionadas resistentes a um agente quimioterápico, adquirem resistência a outras drogas, 5 aparentemente não relacionadas. O fenótipo MDR é multifatorial, mas o mecanismo melhor estudado é a super expressão da glicoproteína-P, que é uma proteína de membrana capaz de fazer a extrusão de quimioterápicos para fora de célula. Com isso o objetivo deste estudo é avaliar a sensibilidade das linhagens celulares que expressem (Lucena) ou não (K562) o fenótipo MDR à AFD do pigmento C-FC, extraído da cianobactéria S. platensis, e propor um possível mecanismo de ação. A extração da C-PC foi feita no Laboratorio de Microbiologia e Engenharia de Bioprocesos (FURG). Diferentes concentrações de C-PC (0.025, 0.05, 0.10, 0.20 e 0.40 mg/ml para os testes de PDA da C-PC e 0.05, 0.10, 0.20, 0.40 e 0.60 mg/ml para os testes no escuro) foram usadas. O número de células viáveis foi avaliada imediatamente, 24 h e 48 h após o tratamento com C-PC ou PDA da C-PC através de exclusão por azul de trypan. A concentração de 0.05 mg/ml foi utilizada para determinar o possível papel da Pgp na resposta da linhagem Lucena e a concentração de 0.10 mg/ml foi utilizada nos testes de peroxidação lipídica (LPO), de produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e quantificação de apoptose/necrose. A PDA da CPC causou uma diminuição no número de células viáveis em ambas linhagens K562 (não MDR) e Lucena (MDR), sendo que a linhagem MDR foi menos sensível que a não MDR. Já nos testes realizados no escuro, nenhuma toxicidade foi encontrada para as duas linhagens. Nenhuma alteração na resistência da linhagem Lucena foi encontrada quando o modulador verapamil foi colocado durante o tratamento de APD com C-PC e até às 48h de acompanhamento após o tratamento. Também não foi encontrada diferença significativa de lipoperoxidação (LPO) mas houve uma tendência de aumento na produção de ROS, que foi mais evidente na linhagem K562. Além disso a linhagem Lucena apresentou uma produção basal de ROS significativamente maior que a K562. Nos testes de apoptose/necrose nenhuma diferença foi encontrada entre as células controle e tratadas em ambas linhagens. Os resultados encontrados neste estudo sugerem que a C-PC possa ser um potente agente fotosensibilizante, tanto para linhagens não MDR quanto para linhagens MDR e também que o mecanismo tipo II esteja envolvido em maior parte no efeito observado na PDA da C-PC, mas uma menor participação do mecanismo tipo I não pode ser descartada.