Morphobiometric and molecular characterization of Bursaphelenchus Fuchs, 1937 (Nematoda: Aphelenchoididae) species associated with Pinus pinaster Ainton in Portugal

Abstract - The genus Bursaphelenchus comprises almost 100 species mainly from the northern hemisphere, with conifers as the most important hosts. Among the various nematode species, the pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is the casual agent of pine wilt disease (PWD), and the most important forest pest for pines worldwide, classified as an A1 quarantine organism within the European Union. In 1999 this nematode was detected for the first time in Portugal and Europa associated with maritime pine, Pinus pinaster. Following detection, a national program denominated "Programa Nacional de Luta contra o Nemátodo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) was created to, among other objectives, determine the distribution of the PWN and its associated vector(s) and host(s), and therefore intensive surveys covering the entire country were conducted with thousands of wood samples and suspected insects being analyzed. This thesis presents the listing, distribution, frequency and the insects associated with Bursaphelenchus species found associated with maritime pine in Portugal, identifying and characterizing the various species by morphological, biometrical and molecular biology (ITS-RFLP and rDNA sequencing analysis) techniques. To achieve the objectives, a total of 4813 maritime pine wood samples and 3294 insects from 22 species and six families were individually analyzed. A total of nine Bursaphelenchus species were found, namely: B. antoniae, B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae and B. xylophilus, all of them (with the exception of B. xylophilus) being new records for Portugal. Some of the species appear to have a widespread distribution, such as B. leoni, B. teratospicularis and B. tusciae while others were very rarely found and apparently have a localized distribution range within the country, namely B. antoniae and B. mucronatus. The majority of the species is characteristic of the Mediterranean region and can also be found in countries such as Spain, Italy and Greece, reflecting the affinity of our fauna with those locations. The association of B. hellenicus and B. tusciae with maritime pine is here reported for the first time. Six of the Bursaphelenchus species were also found associated with insects, mainly from the family Scolytidae (Coleoptera). Some of these interactions were described for the first time, namely: B. hellenicus with both Ips sexdentatus and Hylurgus ligniperda, B. sexdentati with both H. ligniperda and Orthotomicus erosus and B. tusciae with H. ligniperda. The exclusive association of B. xylophilus with the cerambycid Monochamus galloprovincialis was also confirmed. The nematode's dauer juveniles were usually found in low numbers in the insect vectors (ca 10-100 per insect), although for B. xylophilus a few thousand specimens per insect were sometimes found. The location of the dauer juveniles differed according to the species, although they were more common under the elytra and wings of the adult insects. A species new to science was detected and formally described as B. antoniae, associated with Hylobius sp. (Coleoptera; Curculionidae) beetles. Morphologically, this new species is very similar to B. hylobianum, although it's distinct ITS-RFLP molecular pattern (with only the enzyme Haelll producing comparable restriction bands) and the failure of hybridization supported the two species as distinct entities. Additional phylogenetic analysis of the 18S rDNA sequence further supported the taxonomical proximity of B. antoniae with B. hylobianum. Concerning the PWN, detailed studies on the development and morphology of B. xylophilus were conducted, and comparative measurements of field-collected and laboratory-maintained populations demonstrated that nematodes from the second group displayed larger size in all morphometric parameters, which could derive from more adequate conditions of nourishment and/or temperature. Taxonomical studies on the development stages of B. xylophilus confirmed the existence of four propagative juvenile stages (J1,J2,J3 and J4), an adult stage with both sexes and two dispersal stages (jIII e jIV), with the measurements of the gonad length allowing the separation of the propagative stages. It is hoped that the acquired knowledge will be useful on future surveys of nematodes of the Bursaphelenchus genus collected from either wood material or insect vectors, and facilitate the correct distinction and identification of the various species which are now known to occur. ### Resumo - 0 género Bursaphelenchus compreende quase 100 espécies, distribuídas sobretudo nos países do hemisfério norte do globo terrestre. Embora algumas espécies já tenham sido detectadas em plantas herbáceas, os hospedeiros vegetais mais comuns deste género são as coníferas, particularmente pinheiros. 0 nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus, é considerado a espécie mais importante deste género uma vez que é o agente causal da doença da murchidão dos pinheiros ("pine wilt disease"). Originário dos Estados Unidos, onde não causa grande impacte, o NMP foi introduzido em alguns países da Ásia (China, Japão, Coreia e Taiwan) e mais recentemente na Europa (Portugal). Nestas regiões é responsável pela destruição de milhares de hectares de coníferas, assumindo uma elevada importância económica. Em Portugal, depois da sua detecção em 1999, associado a Pinus pinaster, foi implementado um programa nacional "Programa Nacional de Luta contra o Nemátodo da Madeira do Pinheiro" (PROLUNP) que permitiu determinar a área afectada pela praga (a sul do rio Tejo, península de Setúbal) bem como definir e implementar estratégias de controlo e prevenção da disseminação do NMP a outras zonas de Portugal. Recentemente, em Junho de 2008, foi confirmada a presença de B. xylophilus em outras regiões de Portugal levando as autoridades oficiais a definir todo o território continental como zona afectada e de restrição. As prospecções intensivas realizadas nos últimos anos incluíram a recolha e análise de milhares de amostras de madeira de pinheiro bem como de insectos associados ao pinheiro bravo conduzindo à identificação de várias espécies de Bursaphelenchus. Assim, os estudos conduzidos neste trabalho tiveram como objectivos efectuar uma caracterização morfológica, biométrica e molecular das espécies associadas a P. pinaster em Portugal bem como a sua distribuição geográfica e abundância. Os estudos biométricos foram realizados com populações extraídas directamente do meio natural. Foi ainda realizada uma pesquisa que permitiu identificar os insectos a que estão associadas essas espécies, os seus possíveis vectores. Foram analisadas no total 4813 amostras de P. pinaster e 3294 insectos (22 espécies pertencentes a seis famílias diferentes). Foram identificadas um total de nove espécies: B. antoniae n. sp., B. hellenicus, B. leoni, B. mucronatus, B. pinasteri, B. sexdentati, B. teratospicularis, B. tusciae e B. xylophilus. Foram realizados estudos morfológicos e biométricos de todas as espécies com excepção de B. mucronatus; o reduzido número de exemplares encontrados em apenas uma amostra foram utilizados para efectuar o diagnóstico molecular desta espécie (ITS-RFLP). Apesar de ter havido, sempre que possível, a confirmação molecular, na maioria dos casos a caracterização morfológica e biométrica permitiu a correcta identificação das espécies. Contudo, foi imprescindível a análise molecular em algumas amostras, nomeadamente para a identificação de B. xylophilus e B. sexdentati; dada a grande semelhança entre B. xylophilus e B. mucronatus e tendo sido encontradas algumas populações de B. xylophilus que possuíam fêmeas com cauda mucronada, foi necessária a realização da confirmação molecular. Com excepção de B. xylophilus, todas as outras espécies foram reportadas pela primeira vez em Portugal. Juntamente com B. xylophilus, B. pinasteri foi a espécie encontrada nas amostras de madeira de pinheiro com maior frequência. Algumas destas espécies como B. leoni, B. teratospicularis e B. tusciae foram reportadas em diferentes localidades do norte, centro e sul de Portugal, apresentando uma vasta distribuição geográfica; este resultado está em consonância com a forte associação destas espécies a climas mediterrânicos tal como acontece em Espanha, França, Itália e Grécia. Em oposição, espécies como B. antoniae e B. mucronatus foram encontradas apenas numa ocasião na região centro (Leiria) e norte (Figueira da Foz) do país, respectivamente. Bursaphelenchus mucronatus é igualmente pouco frequente em Espanha onde ocorre sobretudo na região norte, na Galiza. Esta espécie preferirá climas mais frios, ocorrendo com uma maior frequência nas regiões de latitude norte; esta análise é corroborada pela presença constante em países como Alemanha, Finlândia, França, Noruega, Rússia e Suécia. A nível mundial são descritas neste trabalho pela primeira vez as associações das espécies B. hellenicus e B. tusciae ao hospedeiro vegetal P. pinaster.

Genetic diversity of entomopathogenic nematodes (Nematoda: Steinernematidae and Heterorhabditidae) and the nematode Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) from continental Portugal

“Diversidade genética dos nemátodes entomopatogénicos (Nematoda: Steinernematidae e Heterorhabditidae) e do nemátode Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididade) em Portugal continental” Os nematodes entomopatogénicos são utilizados como agentes de controlo biológico. Para compreender a sua diversidade, foi realizada uma prospecção em Portugal. Cinco espécies, nomeadamente Steinernema feltiae, S. intermedium, S. kraussei, Steinernema sp. e Heterorhabditis bacteriophora foram identificadas. As sequências de ITS, região D2D3 do 28S rRNA, COXI e cytb foram utilizadas para estudar a diversidade genética das duas espécies mais abundantes, S. feltiae and H. bacteriophora, não tendo sido encontradas diferenças significativas entre isolados. O nemátode da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, provoca doença nos pinheiros tendo sido detectada pela primeira vez na Europa e em Portugal em 1999. Para avaliar a diversidade genética dos isolados Portugueses e identificar o padrão de propagação da doença, foram utilizadas a sequência da região IGS do 5.8S rRNA, e os genes cytb e cellulase, combinados com os padrões ISSR. Os padrões de ISSR mostraram elevada diversidade genética entre os recentes isolados Portugueses, sugerindo a possibilidade de uma nova introdução. As árvores filogenéticas dos genes da celulase e cytb sugeriram uma origem Asiática para os isolados Portugueses; ABSTRACT: Entomopathogenic nematodes are used as biocontrol agents. To understand their diversity, a survey was undertaken in Portugal. Five species, namely Steinernema feltiae, S. intermedium, S. kraussei, Steinernema sp. and Heterorhabditis bacteriophora were identified. The ITS, 28S rRNA D2D3 region, COXI and cytb sequences, used to study the genetic diversity of the two most abundant species, S. feltiae and H. bacteriophora, showed no significant differences among the isolates. Bursaphelenchus xylophilus causes severe disease in pine trees and was detected for the first time in Europe and in Portugal in 1999. To evaluate the genetic diversity of Portuguese isolates and identify disease spread pathways, the sequence of 5.8S rRNA IGS region, cytb and cellulase genes, combined with ISSR fingerprints were used. ISSR fingerprints show a high genetic variability among recent Portuguese isolates, suggesting the possibility of a new introduction. Phylogenetic trees based on cellulase and cytb genes suggests an Asian origin for Portuguese isolates.

Evolução geológica da região Peniche, Torres Novas, no contexto do Ensino da Biologia e Geologia

O trabalho que se apresenta centra-se na elaboração de um conjunto de materiais passível de ser utilizado pelos professores da área do Ensino da Biologia - Geologia, do ensino básico e secundário, com o intuito de lhes fornecer algumas das competências essenciais para a realização de saídas de campo na região de Peniche- Torres Novas. Neste sentido, o presente trabalho contempla uma primeira parte em que a geologia e a geomorfologia da região são caracterizadas de uma forma detalhada. Esta caracterização permite que, inicialmente, sejam construídas cartas, geomorfológica, litostratigráfica simplificada, tectónica e de zonamento geológico, e que, posteriormente, seja apresentado um esboço da evolução geológica da região ao longo dos tempos. Na segunda parte da dissertação pretende-se adaptar a geologia regional aos curricula dos vários níveis de ensino da Biologia - Geologia. Assim, após uma selecção dos conteúdos principais dos diferentes programas disciplinares, foram escolhidos e identificados locais com interesse geológico na região que, pelas suas características, são susceptíveis de serem visitados/estudados em saídas de campo. Por último, são apresentadas sugestões para a estruturação de roteiros de carácter geológico assim como um exemplo concreto de roteiro. ABSTRACT: The here presented essay is based on the elaboration of a set of materials which can be used by Biology and Geology, elementary and secondary school teachers, with the purpose of providing them with essential skills for field trips in the Peniche-Torres Novas region. Therefore, the essay comprises a first section where the region geology and geomorphology are fully characterized. To begin with, this characterization allows geomorphologic, simplified lithostratigraphical, tectonics and geological zoning charts to be built and later on to present an outline of the region's geological evolution throughout the times. The essay second section aim is to adapt the region geology to the different teaching levels of the Biology-Geology school curricula. That is, after a careful selection of the curricula main contents, the region geologically interesting places were chosen and identified, according to the features that make them worthwhile being visited/studied, when field trips are planned. To complete the essay, suggestions on how to structure geological roadmaps along with a roadmap example are presented.

Quid petis? um estudo sobre o processo de doutoramento

"Sem resumo feito pelo autor"; - O grau de doutor é, na maioria dos países, o mais elevado grau concedido pelas universidades. Sendo considerado como um grau de "excelência", pauta-se, geralmente, por elevados padrões de exigência, certificando que o seu detentor, não apenas tem capacidade para realizar investigações de forma autónoma, como pode, dessa forma, contribuir de forma original e inovadora para o progresso do conhecimento. Enquanto grau de "excelência" tem servido como critério de certificação de professores universitários, sendo também um referente de qualidade dos cursos ministrados nas universidades e indicativo do desenvolvimento técnico e científico das diferentes sociedades. Considerada como potenciadora do desenvolvimento científico, cultural e tecnológico das sociedades, a formação de doutores envolve avultados recursos financeiros e humanos, num investimento nem sempre "rentável" a curto prazo. Ao mesmo tempo, numa sociedade globalizada e caracterizada pela ideia de "aprendizagem ao longo da vida", o número de pessoas que frequentam cursos de pós-graduação tem vindo a crescer de forma sistemática, colocando novos desafios e exigências às instituições de formação. Estas novas realidades têm obrigado a uma reflexão sobre a natureza e finalidades do doutoramento, numa tentativa de responder às necessidades sociais e económicas e aos interesses das pessoas em formação, mantendo embora o carácter de excelência do grau e os requisitos necessários à sua obtenção. No entanto, e talvez devido ao seu carácter ainda exclusivista e minoritário, a educação pós-graduada tem sido relativamente pouco estudada. Ao contrário do que acontece relativamente a outros niveis de ensino (mesmo superior), e apesar de gozar de um certo prestígio, a educação pós-graduada tem sido votada a um certo "esquecimento", o que levou mesmo um professor emérito da Universidade de Harvard a considerá-la como o "soft under-belly of the research university" (Bowen & Rudenstine,1992, p. xv). Mas a educação pós-graduada pode ser considerada como um fértil campo de investigação (Kogan, 1993), quer no domínio da Psicologia, quer no dominio de outras áreas científicas, susceptivel de um vasto campo de pesquisas, desde definição de padrões de qualidade à análise de processos desenvolvimentais em jogo ao longo do processo de doutoramento. 0 processo de doutoramento configura-se como um processo moroso e exigente, obrigando a um grande investimento intelectual e pessoal, ao longo de vários anos e, muitas vezes, em detrimento da vida familiar e profissional e de outros interesses sociais e culturais. 0 intenso envolvimento da pessoa nos trabalhos, assim como a sua longa duração podem fazer com que o processo de doutoramento seja vivenciado de forma problemática, originando sentimentos de desânimo e dúvidas relativamente às capacidades para obter o grau. Mas, por outro lado, os trabalhos de doutoramento, proporcionando conhecimentos especializados numa dada área do saber e dotando a pessoa de maiores competências científicas e intelectuais, conduzem a uma gradual e crescente autonomia, transformando o estudante de doutoramento num académico, inserido numa comunidade cientifica e de investigação. Assim, mais do que um conjunto de trabalhos e actividades que, ao fim de um tempo mais ou menos longo, conduzem à redacção de uma tese e à obtenção de um grau académico, o doutoramento pode ser encarado um processo de desenvolvimento, que, implicando a totalidade da pessoa e da sua vida, conduz a mudanças nas formas como concebe a realidade e se relaciona com ela. Envolve uma opção de vida — a vida académica, devotada ao estudo e à investigação — e, como tal, obriga a abdicar de outras opções, num processo que pode ser doloroso. Implica um estudo aprofundado de um dado tema, possibilitando que a pessoa se vá tornando especialista, alargando os seus conhecimentos e competências, num processo de aprendizagem que implica a (re)construção de significados, de um modo pessoal e idiossincrático (Entwistle, 1986; Salmon,1992); é, assim, um processo de construção de conhecimento, que pode proporcionar à pessoa concepções mais relativizadas do mundo teórico e conceptual que a rodeia. Relaciona-se com o desenvolvimento profissional e, como tal, tem repercussões na identidade da pessoa. Ao longo deste processo, os problemas sentidos (derivados essencialmente do intenso envolvimento nos trabalhos, que decorrem geralmente num grande isolamento físico e intelectual) podem contribuir para vivências negativas e pouco satisfatórias da experiência do doutoramento. É neste quadro que o papel do orientador pode ser decisivo, não apenas no apoio científico que pode prestar, mas também, e essencialmente, no suporte emocional, ajudando a transformar as crises em factores de desenvolvimento. Tendo em conta estes diferentes aspectos, procurou-se com este trabalho contribuir para uma melhor compreensão do processo de doutoramento, tal como ele é vivenciado pelos próprios doutorandos. Centrando-se nos estudantes de doutoramento, privilegia, naturalmente, a sua percepção do processo, em detrimento de outras pessoas envolvidas (orientadores, fia, ... ); não se esquece, contudo, a sua importância na forma como o processo é vivenciado. 0 primeiro capítulo - 0 Grau de Doutor está dividido em quatro grandes partes. Na primeira procura-se fazer um breve historial da evolução desde grau académico, desde o seu aparecimento nas universidades europeias até à reforma da Universidade de Berlim, implementada por Wilhelm von Humboldt, que lança as bases para o estabelecimento da "universidade de investigação". A segunda parte centra-se na universidade portuguesa, desde a sua fundação à actualidade, numa breve análise da sua evolução e com particular ênfase no processo de atribuição do grau de doutor e dos cerimoniais associados. Na terceira parte procura-se fazer uma análise comparativa do grau de doutor em diferentes países, dando relevo aos requisitos necessários à sua atribuição, à organização dos estudos doutorais, à ligação entre os sistemas universitário e de investigação e, ainda, a diversas problemáticas relacionadas com o processo de doutoramento nesses países. Finalmente, a quarta parte debruça-se sobre alguns problemas e perspectivas do grau de doutor na actualidade, com particular ênfase na discussão da sua natureza e objectivos e na análise dos requisitos exigidos e do tempo necessário à sua obtenção. 0 segundo capítulo - 0 Processo de Doutoramento - centra-se fundamentalmente em questões relacionadas com a forma como estudantes de doutoramento experienciam os trabalhos conducentes ao grau de doutor e divide-se em duas grandes partes. A primeira tem a ver directamente com as vivências e perspectivas dos estudantes ao longo do processo, em torno de duas grandes vertentes: problemas experienciados e a relação de orientação. Com base na revisão bibliográfica efectuada e tendo em conta os resultados de pesquisas realizadas em alguns países com estudantes de doutoramento, procurou-se sistematizar, o mais exaustivamente possível, os principais aspectos relacionados com estas temáticas, nomeadamente os que se prendem com vivências sentidas como problemáticas ao longo do processo, quer as de índole pessoal, quer as relacionadas com os trabalhos, e a relação de orientação.

Evolução da população do fungo nematófago Pochonia chlamydosporia -isolado PcMR, após inoculação, no solo e na raiz do tomateiro cultivado em estufa

O fungo Pochonia chlamydospoia é um potencial agente de controlo biológico dos nemátodes-das-galhas-radiculares. Com este trabalho, pretendeu-se avaliar a eficácia de inoculações de clamidósporos no solo, no estabelecimento de uma população do fungo no solo e na raiz de tomateiro em estufa com níveis de densidade iguais ou superiores aos considerados como necessários para um eficaz controlo dos nematodes-das-galhas-radiculares. Ao longo de dois anos de ensaio, fórum efetuadas inoculações do isolado PcMR e avaliada a densidade de fungo no solo e na raiz, As inoculações efetuadas permitiram estabelecer uma população de P. chlamydosporia no solo e atingir os valores de densidade pretendidos. No entanto, os valores pretendidos para colonização da raiz pelo fungo foram atingidos apenas no primeiro ano. Foi igualmente demonstrada a capacidade do fungo em se manter no solo durante longos períodos de tempo mesmo na ausência de cultura e em condições adversas de humidade e temperatura. /ABSTRACT: Pochonia chlamydosporia is a potential root-knot nematode biological control agent. The aim of this work was to evaluate the effectiveness of chlamydospore inoculations at the soil, for the establishment at both soil and greenhouse tomato root, of a fungus population in density levels equal or superior to those considered as needed for an effective control of root-knot nematode. Along two years, several inoculations using the Portuguese isolate PcMR were made and the density of fungus at the soil and roots studied. These inoculations allowed the establishment of a population of P. chlamydosporia at the soil and achieve the desired density values. However, only in the first year of assay, the desired values of root colonization by fungus were achieved. lt was also demonstrated that P. chlamydosporia can survive for itself at the soil for a long period of time even in the absence of plant culture and in adverse moist and temperature conditions.