Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para o monitoramento dos produtos das vias metabólicas do triptofano em linhagem celular de glioma humano

O metabolismo do triptofano (Trp) se dá pela via das quinureninas (QUIN), pela via serotoninérgica (SER) e pela via das aminas traço. A primeira gera QUIN e uma variedade de outros metabólitos secundários. Quando conduzida pela enzima indolamina 2,3 dioxigenase (IDO) contribui para os fenômenos de tolerância e imune escape de células tumorais; e quando conduzida pela triptofano 2,3 dioxigenase (TDO) no fígado, participa na síntese da niacina e NAD. A via SER leva à formação do neurotransmissor serotonina (SER), que pode gerar o hormônio melatonina (MEL), respectivamente e outros metabólitos biologicamente ativos. Outra via menos estudada, a via das aminas traço, produz produtos neuroativos. Dada a abrangência e importância das rotas metabólicas do Trp, nós desenvolvemos e validamos uma metodologia bioanalítica robusta, seletiva e sensível por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), acoplado espectrometria de massas (MS) para a determinação simultânea do Trp e seus 15 metabólitos. Para tanto, escolhemos para a avaliação das três vias, linhagens de glioma humano. A escolha por este tipo celular deveu-se ao grande interesse de estudos de metabolismo de Trp em células tumorais, no qual células de glioma tem sido modelo. Nos ensaios com as células de glioma acompanhamos os efeitos de um indutor e inibidores da primeira etapa de metabolização do Trp pela via das quinureninas, ou seja, IFN-γ (indutor da IDO), 1-metiltriptofano (1-MT; inibidor competitivo da IDO) e 680C91 (inibidor seletivo da TDO). Pudemos observar o impacto que a indução ou a inibição do primeiro passo teve sobre os metabólitos subsequentes e as diferenças no metabolismo das duas linhagens estudadas, A172 e T98G. A linhagem T98G só tem atividade de IDO, enquanto que a A172 tem tanto atividade IDO quanto TDO. A indução por IFN-γ mostrou que essa citocina não só atua na formação da via QUIN, mas possui um impacto modesto nas demais rotas. Observamos também que a inibição do 1-MT mostrou seu impacto nos metabólitos invdividualmente, do que a simples relação Trp-QUIN. Contudo, nosso resultados nos permitiu mostrar pela primeira vez a descrição completa dessas vias, em especial nessas linhagens celulares, podendo supor estratégias terapêuticas nessas rotas que estão relacionadas a progressão ou não tumoral.

Desempenho propulsivo de embarcações de pesca: estudo aplicado à melhoria das embarcações do Espírito Santo.

Este trabalho apresenta um procedimento simples e robusto para avaliação e análise do desempenho de instalações propulsoras de embarcações de pesca operando no Estado do Espírito Santo. O objetivo é verificar se as embarcações estão operando com baixa eficiência propulsiva, portanto, com consumo de combustível maior do que o desejável, e identificar possíveis ações de melhoria desta eficiência que poderiam ser implementadas com baixo custo. Tendo em vista as condições artesanais da construção e operação das embarcações de pesca no Espírito Santo, o procedimento foi desenvolvido de forma a poder ser aplicado com relativa facilidade pelas pessoas envolvidas na atividade pesqueira artesanal neste Estado. O procedimento envolve o levantamento de informações sobre a geometria do casco, as características da instalação propulsora existente e sobre alguns aspectos do desempenho das embarcações. Para este levantamento são propostos métodos e técnicas suficientemente simples para que possam ser facilmente aplicadas nos estaleiros. Com base nestes dados levantados implementou-se no procedimento proposto diversos algoritmos que permitem determinar o coeficiente propulsivo das embarcações de pesca e a perda de energia útil que ocorre tanto no motor, por conta de condições inadequadas de operação, quanto na transmissão desta energia para o hélice. Para a validação dos métodos e técnicas envolvidos neste procedimento e dos resultados fornecidos por ele, o mesmo foi aplicado em alguns cascos de embarcações de pesca disponíveis em estaleiros visitados no Estado. Para uma destas embarcações o procedimento foi aplicado em sua totalidade, permitindo identificar a baixa eficiência da instalação propulsora e algumas das possíveis causas que provocam a perda de energia útil no sistema. Finalmente, com base nesse exemplo de aplicação, um estudo de possíveis melhorias na instalação propulsora é apresentado ao final do trabalho.

Doseamento microbiológico de neomicina e bacitracina - desenvolvimento e validação de método rápido em microplacas

Os ensaios microbiológicos são utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana desde a descoberta do uso dos antibióticos. Apesar dos ensaios microbiológicos serem amplamente empregados para determinação da potência de antibióticos em formas farmacêuticas, uma vez que fornecem a medida da atividade biológica, apresentam limitações quanto a baixa reprodutibilidade e tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizar e validar ensaio colorimétrico rápido em microplaca para determinar a potência da neomicina e bacitracina em produtos farmacêuticos. Metodologias de análise fatorial e análise de superfície de resposta foram utilizadas no desenvolvimento e otimização da escolha do microrganismo, da composição do meio de cultura, da proporção de inóculo, e das concentrações de cloreto de trifeniltetrazólio e dos antibióticos. Os métodos otimizados foram validados pela avaliação da linearidade, precisão, exatidão e robustez. Análise estatística mostrou equivalência entre o método de difusão em ágar e o método colorimétrico rápido em microplaca para ambos antibióticos. Além disso, o ensaio em microplaca apresentou vantagens em relação à reprodutibilidade, sensibilidade, tempo de incubação e quantidades necessárias de meio de cultura e soluções para ambos os antibióticos.

Elaboração e validação de um instrumento de avaliação da transferência do Tratamento Diretamente Observado da tuberculose segundo a perspectiva de profissionais de saúde de nível médio e superior (ATP-IINFOC-TB)

Compreendendo a tuberculose enquanto problema de saúde pública, desde meados dos anos 1990 a Organização Mundial da Saúde recomenda ações de controle da doença, dentre estas a Directly Observed Treatment Short-Course (DOTS) que, junto às demais recomendações, é transferida e executada em diferentes cenários, sendo essa transferência merecedora de atenção e aprofundamento, o que deve ocorrer por meio da utilização de métodos válidos e confiáveis. Trata-se de um estudo metodológico, cujo objetivo é elaborar e validar um instrumento voltado à avaliação da transferência da política do Tratamento Diretamente Observado, segundo a perspectiva de profissionais de saúde, por meio das dimensões \"Informação\", \"Conhecimento\" e \"Inovação\". O estudo foi realizado em três fases, a saber: validação semântica, primeira fase do estudo de campo e segunda fase do estudo de campo. A validação semântica contou com 24 profissionais; a primeira fase do estudo de campo, com 101 profissionais; e a segunda fase do estudo de campo, com 401 profissionais. Na validação semântica, o instrumento foi ajustado segundo as sugestões dos entrevistados, tendo ocorrido também a retirada de dois itens dos 49 inicialmente propostos. Na primeira fase do estudo de campo, o instrumento não apresentou efeito floor and ceiling e foram retirados 8 itens com carga fatorial < 0,30 na Análise Fatorial Exploratória. O instrumento apresentou um bom alfa de Cronbach (?=0,87), e a dimensão \"Conhecimento\" apresentou alfa baixo (?=0,645). Na segunda fase do estudo de campo, o efeito floor and ceiling manteve- se ausente, com baixo coeficiente de correlação linear de Pearson (r), baixo ajuste (55%) e baixo alfa de Cronbach (?=0,61) para a dimensão \"Conhecimento\", tendo as dimensões \"Informação\" e \"Inovação\" atingido valores aceitáveis. Para o instrumento como um todo, o Alfa de Cronbach foi de 0,872. O KMO e o Teste de Esfericidade de Bartlett foram satisfatórios, permitindo a Análise Fatorial Confirmatória. Entretanto, identificou-se baixo valor de ajuste do modelo no CFI e RMSEA (0,576 e 0,088, respectivamente), com uma baixa correlação entre as dimensões propostas. Conclui-se que o instrumento elaborado é capaz de avaliar a transferência do TDO segundo a perspectiva de profissionais de saúde de nível médio e superior de forma unidimensional, sem a utilização das três dimensões inicialmente propostas

Padronização e validação de marcadores moleculares para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar

O diagnóstico da leishmaniose tegumentar (LT) baseia-se em critérios clínicos e epidemiológicos podendo ser confirmado por exames laboratoriais de rotina como a pesquisa direta do parasito por microscopia e a intradermorreação de Montenegro. Atualmente, os métodos moleculares, principalmente a reação da cadeia da polimerase (PCR), têm sido considerados para aplicação em amostras clínicas, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Este trabalho teve como objetivo a padronização e validação das técnicas de PCR-RFLP com diferentes iniciadores (kDNA, its1, hsp70 e prp1), visando o diagnóstico e a identificação das espécies de Leishmania presentes em amostras de DNA provenientes de lesões de pele ou mucosa de 140 pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar. Para tal, realizamos ensaios de: 1) sensibilidade das PCRs com os diferentes iniciadores, 2) especificidade dos ensaios utilizando DNAs de diferentes espécies de referência de Leishmania, de tripanossomatídeos inferiores e de fungos, 3) validação das técnicas de PCR-RFLP com os iniciadores estudados em amostras de DNA de lesões de pele ou mucosas de pacientes com LT. Os resultados dos ensaios de limiar de detecção das PCR (sensibilidade) mostraram que os quatro iniciadores do estudo foram capazes de detectar o DNA do parasito, porém em quantidades distintas: até 500 fg com os iniciadores para kDNA e its1, até 400 fg com hsp70 e até 5 ng com prp1. Quanto à especificidade dos iniciadores, não houve amplificação dos DNAs fúngicos. Por outro lado, nos ensaios com os iniciadores para kDNA e hsp70, verificamos amplificação do fragmento esperado em amostras de DNA de tripanossomatídeos. Nos ensaios com its1 e prp1, o padrão de amplificação com os DNAs de tripanossomatídeos foi diferente do apresentado pelas espécies de Leishmania. Verificou-se nos ensaios de validação que o PCR-kDNA detectou o parasito em todas as 140 amostras de DNA de pacientes e, assim, foi utilizado como critério de inclusão das amostras. A PCR-its1 apresentou menor sensibilidade, mesmo após a reamplificação com o mesmo iniciador (85,7% ou 120/140 amostras). Para os ensaios da PCR-hsp70, as amostras de DNA foram amplificadas com Repli G, para obter uma sensibilidade de 68,4% (89/140 amostras). A PCR-prp1 não detectou o parasito em amostras de DNA dos pacientes. Quanto aos ensaios para a identificação da espécie presente na lesão, a PCR-kDNA-RFLP-HaeIII e a PCR-its1- RFLP-HaeIII permitem a distinção de L. (L.) amazonensis das outras espécies pertencentes ao subgênero Viannia. A PCR-hsp70-RFLP-HaeIII-BstUI, apesar de potencialmente ser capaz de identificar as seis espécies de Leishmania analisadas, quando utilizada na avaliação das amostras humanas permitiu apenas a identificação de L. (V.) braziliensis. No entanto, é uma técnica com várias etapas e de difícil execução, o que pode inviabilizar o seu uso rotineiro em centros de referência em diagnósticos. Assim, recomendamos o uso dessa metodologia apenas em locais onde várias espécies de Leishmania sejam endêmicas. Finalmente, os resultados indicam que o kDNA-PCR devido à alta sensibilidade apresentada e facilidade de execução pode ser empregada como exame de rotina nos centros de referência, permitindo a confirmação ou exclusão da LT.

Aplicação de métodos geoestatísticos no estudo das distribuições espaciais de condutividade hidráulica em áreas do Sistema Aquífero Guarani (SAG) e do Sistema Aquífero Bauru (SAB) no Estado de São Paulo

A condutividade hidráulica (K) é um dos parâmetros controladores da magnitude da velocidade da água subterrânea, e consequentemente, é um dos mais importantes parâmetros que afetam o fluxo subterrâneo e o transporte de solutos, sendo de suma importância o conhecimento da distribuição de K. Esse trabalho visa estimar valores de condutividade hidráulica em duas áreas distintas, uma no Sistema Aquífero Guarani (SAG) e outra no Sistema Aquífero Bauru (SAB) por meio de três técnicas geoestatísticas: krigagem ordinária, cokrigagem e simulação condicional por bandas rotativas. Para aumentar a base de dados de valores de K, há um tratamento estatístico dos dados conhecidos. O método de interpolação matemática (krigagem ordinária) e o estocástico (simulação condicional por bandas rotativas) são aplicados para estimar os valores de K diretamente, enquanto que os métodos de krigagem ordinária combinada com regressão linear e cokrigagem permitem incorporar valores de capacidade específica (Q/s) como variável secundária. Adicionalmente, a cada método geoestatístico foi aplicada a técnica de desagrupamento por célula para comparar a sua capacidade de melhorar a performance dos métodos, o que pode ser avaliado por meio da validação cruzada. Os resultados dessas abordagens geoestatísticas indicam que os métodos de simulação condicional por bandas rotativas com a técnica de desagrupamento e de krigagem ordinária combinada com regressão linear sem a técnica de desagrupamento são os mais adequados para as áreas do SAG (rho=0.55) e do SAB (rho=0.44), respectivamente. O tratamento estatístico e a técnica de desagrupamento usados nesse trabalho revelaram-se úteis ferramentas auxiliares para os métodos geoestatísticos.

Desenvolvimento e validação de metodologia para determinação de resíduos de pesticidas piretróides por HPLC em feijão

Um método rápido utilizando cromatografia liquida (LC) foi desenvolvido para determinação simultânea de 7 pesticidas piretróides (bifentrina, cipermetrina, fenpropatrina, fenvalerato, permetrina, lambda-cialotrina, e deltametrina). Os resíduos são extraídos com acetona e a partição realizada de acordo com o método multi-resíduos DFG-S19, substituindo diclorometano por acetato de etila/ciclohexano (1+1) e purificação usando cromatografia de permeação a gel com uma coluna Biobeads SX3 e acetato de etila/ciclohexano (1+1) como eluente. A separação por LC é realizada com uma coluna LiChrospher 100 RP-18 e acetonitrila/água (8+2) como fase móvel. Os pesticidas são detectados em 212nm. As recuperações dos 7 pesticidas piretróides em amostras de feijão fortificadas em 0,010; 0,100; e 1,000 mg/kg ficaram entre 71-105%. A diferença particular deste método é o limite de quantificação, os quais ficaram entre 0,004-0,011 mg/kg, abaixo de muitos outros métodos de LC descritos na literatura. A cromatografia a gás (GC) com detector de captura de elétrons é mais sensível que a LC, mas o método com LC facilita a identificação dos picos. A GC apresenta muitos picos enquanto a LC apresenta apenas um para a maioria dos piretróides. A análise com LC é uma boa alternativa para a determinação de resíduos de piretróides em feijão. Durante o ano de 2005, um total de 48 amostras de feijão comercializadas na cidade de São Paulo, foram analisadas. Nenhum resíduo de pesticida piretróide foi detectado nas amostras.

Extração de casos de teste utilizando Redes de Petri hierárquicas e validação de resultados utilizando OWL.

Este trabalho propõe dois métodos para teste de sistemas de software: o primeiro extrai ideias de teste de um modelo desenvolvido em rede de Petri hierárquica e o segundo valida os resultados após a realização dos testes utilizando um modelo em OWL-S. Estes processos aumentam a qualidade do sistema desenvolvido ao reduzir o risco de uma cobertura insuficiente ou teste incompleto de uma funcionalidade. A primeira técnica apresentada consiste de cinco etapas: i) avaliação do sistema e identificação dos módulos e entidades separáveis, ii) levantamento dos estados e transições, iii) modelagem do sistema (bottom-up), iv) validação do modelo criado avaliando o fluxo de cada funcionalidade e v) extração dos casos de teste usando uma das três coberturas de teste apresentada. O segundo método deve ser aplicado após a realização dos testes e possui cinco passos: i) primeiro constrói-se um modelo em OWL (Web Ontology Language) do sistema contendo todas as informações significativas sobre as regras de negócio da aplicação, identificando as classes, propriedades e axiomas que o regem; ii) em seguida o status inicial antes da execução é representado no modelo através da inserção das instâncias (indivíduos) presentes; iii) após a execução dos casos de testes, a situação do modelo deve ser atualizada inserindo (sem apagar as instâncias já existentes) as instâncias que representam a nova situação da aplicação; iv) próximo passo consiste em utilizar um reasoner para fazer as inferências do modelo OWL verificando se o modelo mantém a consistência, ou seja, se não existem erros na aplicação; v) finalmente, as instâncias do status inicial são comparadas com as instâncias do status final, verificando se os elementos foram alterados, criados ou apagados corretamente. O processo proposto é indicado principalmente para testes funcionais de caixa-preta, mas pode ser facilmente adaptado para testes em caixa branca. Obtiveram-se casos de testes semelhantes aos que seriam obtidos em uma análise manual mantendo a mesma cobertura do sistema. A validação provou-se condizente com os resultados esperados, bem como o modelo ontológico mostrouse bem fácil e intuitivo para aplicar manutenções.