Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano

Parcela considerável de pacientes com distúrbios de crescimento não têm a causa de seus quadros clínicos estabelecida, incluindo aproximadamente 50% dos pacientes com diagnóstico clínico de síndrome de Silver−Russell (SRS) e 10-20% dos pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS). O objetivo deste estudo foi investigar as causas genéticas e epigenéticas de distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida, numa contribuição para o entendimento de mecanismos que regulam o crescimento. O estudo compreendeu: (1) a investigação de microdesequilíbrios cromossômicos, por aCGH; (2) a análise do perfil de expressão alelo-específica de genes sujeitos a imprinting (IG), por pirossequenciamento (PSQ) ou sequenciamento de Sanger; (3) a investigação do padrão de metilação global em pacientes com restrição de crescimento, utilizando microarray de metilação. A casuística constituiu-se de 41 pacientes não aparentados, com distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida: (1) 25, com hipótese diagnóstica de SRS; (2) seis, com restrição de crescimento intrauterino e peso ao nascimento abaixo do 10º percentil, associados a outros sinais clínicos; (3) sete, com hipótese diagnóstica de BWS; e (4) três, com macrossomia pré-natal ou pós-natal, associada a outros sinais. A investigação de microdesequilíbrios cromossômicos foi realizada em 40 pacientes. Foram detectadas 58 variantes raras em 30/40 pacientes (75%): 40 foram consideradas provavelmente benignas (18 pacientes, 45%), 12, com efeito patogênico desconhecido (11 pacientes, 27,5%), duas, provavelmente patogênicas (um paciente, 2,5%) e quatro, patogênicas (três pacientes, 7,5%). Essas frequências são comparáveis àquelas descritas em estudos que investigaram CNV em grupos de pacientes com distúrbios de crescimento e outras alterações congênitas, incluindo SRS, e mostram a importância da investigação de microdesequilíbrios cromossômicos nesses pacientes. A diversidade dos microdesequilíbrios cromossômicos identificados é reflexo da heterogeneidade clínica das casuísticas. Neste estudo, muitos dos pacientes com hipótese diagnóstica de SRS e BWS apresentavam sinais clínicos atípicos, explicando a ausência neles das alterações (epi)genéticas que causam essas síndromes. A identificação de CNV características de outras síndromes reflete a sobreposição de sinais clínicos com BWS e SRS. A análise do perfil de expressão alelo-específica de IG foi realizada em um subgrupo de 18 pacientes com restrição de crescimento. Trinta IG com função em proliferação celular, crescimento fetal ou neurodesenvolvimento foram inicialmente selecionados. Após seleção de SNP transcritos com alta frequência na população, genotipagem de pacientes, genitores e indivíduos controle, determinação da expressão dos IG em sangue periférico e seu padrão de expressão (mono ou bialélico), 13 IG, expressos no sangue, tiveram a expressão alelo-específica avaliada, sete deles por PSQ e seis por sequenciamento de Sanger. Alterações no perfil de expressão de dois genes, de expressão normalmente paterna, foram detectadas em 4/18 pacientes (22%). Este estudo é o primeiro a utilizar pirossequenciamento e sequenciamento de Sanger na avaliação do perfil de expressão alelo-específica de IG, em pacientes com restrição de crescimento. Apesar de terem limitações, ambas as técnicas mostraram-se robustas e revelaram alterações de expressão alélica interessantes; entretanto, a relação dessas alterações com o quadro clínico dos pacientes permanece por esclarecer. A investigação da metilação global do DNA foi realizada em subgrupo de 21 pacientes com restrição de crescimento e em 24 indivíduos controle. Dois tipos de análise foram realizados: (1) análise diferencial de grupo e (2) análise diferencial individual. Na primeira análise, em que foi comparado o padrão de metilação do grupo de pacientes com quadro clínico sugestivo de SRS (n=16) com o do grupo controle (n=24), não houve indicação de hipo ou hipermetilação global no grupo SRS. Na segunda análise, foi comparado o padrão de metilação de cada um dos 21 pacientes com restrição de crescimento e dos 24 indivíduos controle, com o padrão de metilação do grupo controle. O número médio de CpG hipermetilados e de segmentos diferencialmente metilados (SDM) foi significativamente maior nos pacientes. Foram identificados 82 SDM hipermetilados, estando 57 associados a gene(s) (69,5%), em 16 pacientes, e 51 SDM hipometilados, 41 deles associados a gene(s) (80,4%), em 10 pacientes. A análise de ontologia genética dos 61 genes associados aos SDM hipo ou hipermetilados nos pacientes destacou genes que atuam no desenvolvimento e na morfogênese do sistema esquelético e de órgãos fetais, e na regulação da transcrição gênica e de processos metabólicos. Alterações de metilação em genes que atuam em processos de proliferação e diferenciação celulares e crescimento foram identificadas em 9/20 dos pacientes (45%), sugerindo implicação clínica. Não foi detectada alteração epigenética comum aos pacientes com diagnóstico clínico de SRS, explicável provavelmente pela heterogeneidade clínica. A investigação de metilação global, utilizando microarray, produziu novos dados que podem contribuir para a compreensão de mecanismos moleculares que influenciam o crescimento pré- e pós-natal. Na translocação aparentemente equilibrada - t(5;6)(q35.2;p22.3)dn, detectada em paciente com suspeita clínica de SRS, a interrupção de um gene, pela quebra no cromossomo 6, pode ser a causa do quadro clínico; alternativamente, a translocação pode ter impactado a regulação de genes de desenvolvimento localizados próximos aos pontos de quebra. A análise de expressão em sangue periférico mostrou que os níveis de cDNA do gene, interrompido pelo ponto de quebra da translocação, estavam reduzidos à metade. Além de sinais típicos da SRS, a paciente apresentava algumas características clínicas sugestivas de displasia cleidocraniana. Assim, a translocação t(5;6) pode ter alterado a interação de genes de desenvolvimento e seus elementos reguladores, levando à desregulação de sua expressão espaço-temporal, e resultando num fenótipo atípico, com características sobrepostas de mais de uma síndrome genética

Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para o monitoramento dos produtos das vias metabólicas do triptofano em linhagem celular de glioma humano

O metabolismo do triptofano (Trp) se dá pela via das quinureninas (QUIN), pela via serotoninérgica (SER) e pela via das aminas traço. A primeira gera QUIN e uma variedade de outros metabólitos secundários. Quando conduzida pela enzima indolamina 2,3 dioxigenase (IDO) contribui para os fenômenos de tolerância e imune escape de células tumorais; e quando conduzida pela triptofano 2,3 dioxigenase (TDO) no fígado, participa na síntese da niacina e NAD. A via SER leva à formação do neurotransmissor serotonina (SER), que pode gerar o hormônio melatonina (MEL), respectivamente e outros metabólitos biologicamente ativos. Outra via menos estudada, a via das aminas traço, produz produtos neuroativos. Dada a abrangência e importância das rotas metabólicas do Trp, nós desenvolvemos e validamos uma metodologia bioanalítica robusta, seletiva e sensível por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), acoplado espectrometria de massas (MS) para a determinação simultânea do Trp e seus 15 metabólitos. Para tanto, escolhemos para a avaliação das três vias, linhagens de glioma humano. A escolha por este tipo celular deveu-se ao grande interesse de estudos de metabolismo de Trp em células tumorais, no qual células de glioma tem sido modelo. Nos ensaios com as células de glioma acompanhamos os efeitos de um indutor e inibidores da primeira etapa de metabolização do Trp pela via das quinureninas, ou seja, IFN-γ (indutor da IDO), 1-metiltriptofano (1-MT; inibidor competitivo da IDO) e 680C91 (inibidor seletivo da TDO). Pudemos observar o impacto que a indução ou a inibição do primeiro passo teve sobre os metabólitos subsequentes e as diferenças no metabolismo das duas linhagens estudadas, A172 e T98G. A linhagem T98G só tem atividade de IDO, enquanto que a A172 tem tanto atividade IDO quanto TDO. A indução por IFN-γ mostrou que essa citocina não só atua na formação da via QUIN, mas possui um impacto modesto nas demais rotas. Observamos também que a inibição do 1-MT mostrou seu impacto nos metabólitos invdividualmente, do que a simples relação Trp-QUIN. Contudo, nosso resultados nos permitiu mostrar pela primeira vez a descrição completa dessas vias, em especial nessas linhagens celulares, podendo supor estratégias terapêuticas nessas rotas que estão relacionadas a progressão ou não tumoral.

Detecção e caracterização moleculares dos paramixovírus aviários tipo 1 em materiais provenientes de aves silvestres utilizando testes para a detecção dos vírus da família viral Paramyxoviridae

As aves silvestres são importantes reservatórios de vírus que podem acometer as aves domésticas. O monitoramento da circulação viral em aves silvestres é de extrema importância para garantir a sanidade dos plantéis avícolas. O presente estudo teve como objetivo 1) comparar dois testes moleculares de RT-PCR para a detecção dos vírus da família Paramyxoviridae em aves silvestres e sinantrópicas; 2) caracterizar os vírus detectados nestas amostras. Dois testes de RT-PCR e testes específicos de RT-PCR em tempo real (RRT-PCR) para o vírus da doença de Newcastle (NDV) e o metapneumovírus aviário (aMPV) foram utilizados para comparar o limite de detecção entre as amostras. As amostras de aves silvestres foram testadas por dois testes de RT-PCR. Um pequeno fragmento da região do sítio de clivagem do gene F das amostras positivas foi sequenciado. Os testes de RT-PCR foram validados com sucesso, mas apresentaram diferenças entre os limites de detecção quando comparados aos testes específicos de RRT-PCR utilizando diferentes vírus. No total, 100 amostras de aves (suabes) foram testados pelo teste RT-PCR que apresentou um limite de detecção similar entre os diferentes agentes virais. O teste selecionado foi capaz de detectar duas amostras de aves silvestres que foram também detectadas pelo testes específico para NDV e relacionadas às amostras de NDV vacinais do genótipo II da classe II referentes aos vírus de NDV lentogênico (113RQGR ↓ L117). Nosso estudo demonstra a deficiência na biosseguridade adotada pelos sistemas avícolas por permitir a saída dos vírus vacinais para as aves silvestres

Detecção dos herpesvirus humanos na mucosa oral de pacientes irradiados para tratamento de carcinoma epidermoide em região de cabeça e pescoço

A radioterapia para tratamento das neoplasias malignas em região de cabeça e pescoço é acompanhada de diversas complicações, decorrentes do comprometimento dos tecidos radiossensíveis localizados próximos ao tumor. Entre essas complicações a mucosite é a que merece maior destaque. A mucosite é uma reação tóxica inflamatória da mucosa oral causada pelo tratamento citorredutivo induzido pela radioterapia (RT) ou pela quimioterapia (QT). Ela manifesta-se com sinais de edema, eritema, úlcera e formação pseudomembrana, resultando em sintomas de ardência, que pode progredir para dor intensa e consequente prejuízo na alimentação e comunicação verbal. Infecções bacterianas, fúngicas ou virais podem acometer a mucosa bucal irradiada e exacerbar a manifestação da mucosite oral por meio da ativação de fatores de transcrição da resposta inflamatória. Existem poucos dados na literatura sobre a participação dos herpesvirus humanos na mucosite oral induzida pela radioterapia. A proposta desse trabalho foi avaliar a excreção oral dos herpesvirus humanos (HSV-1, HSV-2, EBV, CMV, VZV, HHV6, HHV7 e HHV8) e sua possível associação com o desenvolvimento e agravamento da mucosite oral, em pacientes diagnosticados com carcinoma epidermoide (CEC) de boca e orofaringe, submetidos à radioterapia associado à quimioterapia. Nesse estudo foram analisadas 158 amostras de lavado bucal, de 20 pacientes, submetidos à radioterapia para CEC em região de cabeça e pescoço, coletadas semanalmente, durante todo o tratamento. Foi realizada a extração do DNA dessas amostras e em seguida sua amplificação através da PCR utilizando dois conjuntos de primers: HSVP1/P2 para os subtipos HSV-1, HSV-2, EBV, CMV e HHV-8 e o VZVP1/P2 para os subtipos VZV, HHV-6 e HHV-7. As amostras positivas foram submetidas à digestão enzimática com enzimas de restrição BamHI e BstUI para determinação específica de cada um dos oito herpesvirus. Foi também avaliada clinicamente, a mucosite oral, em cada uma das coletas, seguindo os critérios da OMS e NCIC. As análises da amostra mostraram a excreção do EBV, HHV-6 e HHV-7, em todas as semanas de tratamento radioterápico, enquanto que a excreção do HSV1 não pode ser observada no momento da triagem. Considerando-se todos os períodos em conjunto (Triagem, semanas de radioterapia e Controle), a maior frequência foi de pacientes que excretaram EBV (55,0%), seguida daqueles que excretaram HHV-7 (20,5%). A frequência de excreção de EBV foi significativamente maior do que a dos demais vírus (Teste ?2, p<0.001 para todos os cruzamentos). A frequência de excreção de HHV-7 foi significativamente maior do que a de HSV-1 (5,9%) e HHV-6 (5,5%) (Teste ?2, p=0.001 para ambos os cruzamentos). Não houve diferenças estatísticas significantes entre as frequências de HSV-1 e HHV-6. Como conclusão, verificou-se uma correlação positiva entre a excreção oral do EBV e a presença de mucosite induzida pela associação de radioterapia e quimioterapia com graus >=2, sobretudo se considerarmos as três últimas semanas de radioterapia, período este em que a severidade da mucosite foi estatisticamente maior. Esses achados nos possibilitam inferir que o ambiente inflamatório local de mucosites com grau >=2 seja mais favorável para excreção oral do EBV.

Investigação da atividade apoptótica na abertura luminal dos ductos das glândulas salivares: análise comparativa entre modelo animal e humano

As glândulas salivares são estruturas essenciais para a manutenção da homeostase da cavidade oral pela síntese e secreção do fluido salivar. A disfunção ou perda permanente das glândulas salivares causadas por radioterapia, doenças inflamatórias ou desordens congênitas elevam principalmente o risco de infecções da mucosa oral e de estruturas dentárias, além de potencialmente prejudicar funções fisiológicas como fala, mastigação e paladar, diretamente interferindo na qualidade de vida dos indivíduos afetados. Os tratamentos atualmente disponíveis são apenas paliativos, ressaltando a necessidade de se compreender melhor os processos embriogênicos a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas capazes de regenerar as glândulas salivares. O princípio da formação das glândulas salivares baseia-se na coordenação de diversos processos morfogenéticos, e este trabalho foca particularmente em investigar a formação do espaço luminal do sistema de ductos, uma vez que a adequada abertura dos lumens é um processo essencial para a secreção salivar. Relata-se que a remoção das células centrais dos cordões sólidos epiteliais por morte celular apoptótica é o principal mecanismo de abertura do espaço luminal dos futuros ductos glandulares em camundongos. Porém, pouco se sabe sobre o controle temporal da apoptose durante o desenvolvimento glandular e sobre seu comportamento em glândulas salivares humanas. Neste trabalho, o perfil de expressão de diversas proteínas envolvidas na cascata apoptótica em glândulas salivares fetais humanas foi analisado de acordo com cada estágio morfogenético por imunoistoquímica (Bax, Bak, Bad, Bid, Bcl-2, Bcl-x, Bcl-xL, caspase-3 clivada, caspases-6, -7 e -9, apaf-1, survivina e citocromo c). As análises semi-qualitativas resultaram em negatividade apenas para as proteínas Bcl-2, Bad, Bid e caspase-3 clivada em todas as fases de desenvolvimento. A expressão nuclear de Bax e Bak foi identificada em presumidos espaços luminais em estágios precoces, enquanto Bcl-xL foi o fator antiapoptótico da família Bcl-2 que exibiu expressão nuclear mais importante. Caspases-6, -7 e -9 foram positivas em todas as fases, e a ausência de caspase-3 clivada sugere caspase-7 como principal caspase efetora da apoptose em desenvolvimento de glândulas salivares humanas. Ambos os componentes do complexo apoptossomo foram positivos durante o desenvolvimento glandular, e o inibidor survivina demonstrou mais positividade nuclear em estágios mais avançados. Ao observar a expressão de reguladores apoptóticos durante o desenvolvimento glandular humano, foram realizados experimentos funcionais com culturas de tecido glandular de camundongos para avaliar o papel das caspases durante a formação desta estrutura. Inicialmente detectou-se a atividade apoptótica em glândulas salivares de camundongos albinos no centro dos cordões epiteliais primários a partir de estágios precoces de desenvolvimento através de TUNEL e caspase-3 clivada. A partir disso, foi realizada a inibição apoptótica funcional in vitro durante o mesmo período, que resultou em ductos significativamente mais amplos e em defeitos morfológicos importantes nas estruturas luminal e acinar. Este trabalho evidenciou portanto atividade apoptótica durante a formação de glândulas salivares humanas e de camundongo, expressando-se em fases mais precoces do que reportadas anteriormente. Além disso, a ausência de Bad e Bid indica que a via intrínseca está mais ativa que a extrínseca, e distintos perfis de expressão da maioria das moléculas sugere adicionais funções não-apoptóticas durante a morfogênese glandular.

Detecção de DNA de HPV no plasma para potencial identificação precoce de recidiva de câncer do colo de útero

O câncer do colo do útero constitui a terceira neoplasia maligna mais comum na população feminina, com aproximadamente 520 mil novos casos e 260 mil óbitos por ano e origina-se a partir da infecção genital persistente pelo Papiloma Vírus Humano (HPV) oncogênico. Os principais HPVs considerados de alto risco oncogênico são os tipos HPV-16 e 18, responsáveis por cerca de 70% de todos os casos de cânceres cervicais (CC) no mundo. Pacientes com CC apresentam taxa de recidiva variando de 8% a 49%. Dentro de dois anos de seguimento, 62% a 89% das recidivas são detectadas. Atualmente, os testes usados para detecção de recidiva são a citopatologia da cúpula vaginal e exames de imagem, porém ainda não estão disponíveis testes específicos. O DNA livre-circulante (cf-DNA) representa um biomarcador não-invasivo facilmente obtido no plasma e soro. Vários estudos mostram ser possível detectar e quantificar ácidos nucléicos no plasma de pacientes com câncer e que as alterações no cfDNA potencialmente refletem mudanças que ocorrem durante a tumorigênese. Essa ferramenta diagnóstica não-invasiva pode ser útil no rastreio, prognóstico e monitoramento da resposta ao tratamento do câncer. Portanto, o desenvolvimento e a padronização de testes laboratoriais não invasivos capazes de identificar marcadores tumorais e diagnosticar precocemente a recidiva da doença aumentam a chance de cura através da utilização dos tratamentos preconizados. Sendo assim, este estudo tem o objetivo de detectar o DNA de HPV no plasma de pacientes com CC para avaliar sua potencial utilidade como marcador precoce de recidiva. Um fragmento de tumor e sangue de pacientes com CC, atendidas no ICESP e HC de Barretos, foram coletados antes do tratamento. Entraram no estudo 137 pacientes nas quais o tumor foi positivo para HPV-16 ou 18, sendo 120 amostras positivas para HPV-16 (87,6%), 12 positivas para HPV-18 (8,8%) e cinco positivas para HPV-16 e 18 (3,6%). A média de idade das pacientes deste estudo foi de 52,5 anos. Plasma de 131 pacientes com CC da data do diagnóstico e de 110 pacientes do seguimento foram submetidas ao PCR em Tempo Real HPV tipo específico. A presença do DNA de HPV no plasma pré-tratamento foi observada em 58,8% (77/131) com carga viral variando de 204 cópias/mL a 2.500.000 cópias/mL. A positividade de DNA no plasma pré-tratamento aumentou com o estadio clínico do tumor: I - 45,2%, II - 52,5%, III - 80,0% e IV - 76,9%, (p=0,0189). A presença do DNA de HPV no plasma pós-tratamento foi observada em 27,3% (30/110). A média de tempo das recidivas foi de 3,1 anos (2,7 - 3,5 anos). O DNA de HPV foi positivo até 460 dias antes do diagnóstico clínico da recidiva. As pacientes com DNA de HPV no plasma apresentaram pior prognóstico, tanto sobrevida como o tempo livre de doença, em relação às que foram negativas. Nas pacientes com CC a presença de HPV no plasma de seguimento pode ser um marcador precoce útil para o monitoramento da resposta terapêutica e detecção de pacientes com risco aumentado de recidiva e progressão da doença.

Análise de ligação do gene de resistência Zym-2 com marcadores microssatélites e reação de acessos de meloeiro ao Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)

As viroses causam perdas significativas na cultura do melão. Dentre essas, o vírus do mosaico amarelo da abobrinha-de-moita (Zucchini yellow mosaic virus- ZYMV) possui grande importância para a cultura e é encontrado em todos os locais de plantio de cucurbitáceas. O controle desse vírus através da resistência genética é a forma mais eficiente de manejo. O acesso PI414723 é a única fonte de resistência de meloeiro ao ZYMV. Essa resistência é oligogênica e supostamente condicionada por três genes dominantes: Zym-1, Zym-2 e Zym-3. A localização cromossômica do gene Zym-1 já foi confirmada no grupo de ligação 2, próximo ao marcador CMAG36. Entretanto, a localização de Zym-2 ainda carece de confirmação experimental, muito embora existam evidências de sua localização no grupo de ligação 10 (LGX). Sendo assim, um dos objetivos do presente trabalho foi confirmar a localização do gene Zym-2 através de análises de ligação com marcadores microssatélites (SSRs). Para tanto, foi utilizada uma população F2 derivada do cruzamento PI414723 x \'Védrantais\'. As plantas foram inoculadas mecanicamente com o isolado RN6-F, patótipo 0, duas vezes em um intervalo de 24 h. A confirmação da infecção e a quantificação dos títulos virais nas plantas F2 foram realizadas através do teste PTA-ELISA. O DNA genômico das plantas foi extraído da primeira folha verdadeira e utilizado nas reações de PCR com primers específicos para SSRs selecionados pertencentes ao LGX. Observou-se uma distribuição assimétrica de classes de absorbância e maior frequência de indivíduos F2 na classe com menor valor (0,1 a 0,2), sugerindo a existência de um gene de efeito maior. O teste chi-quadrado mostrou que todos os marcadores segregaram na frequência esperada (1:2:1), exceto o marcador CMCT134b. A ligação do Zym-2 aos marcadores foi confirmada por meio de regressão linear simples. Dos marcadores analisados, a regressão linear foi significativa para MU6549 e CMBR55, com p-valores de 0,011 e 0,0054, respectivamente. As análises de ligação mostraram que as ordens e as distâncias entre os marcadores condizem com os mapas presentes na literatura. Um segundo objetivo do estudo foi o de avaliar a reação ao ZYMV de 42 acessos de meloeiro oriundos da região Nordeste do Brasil, com o intuito de explorar novas fontes de resistência. Foram realizados dois experimentos utilizando a mesma metodologia citada anteriormente. O título viral médio entre os acessos variou de 0,123 a 0,621 no experimento 1 e de 0,019 a 0,368 no experimento 2. Alguns acessos apresentaram consistentemente baixos títulos virais, próximos aos do acesso resistente PI414723 e dos controles negativos (plantas não inoculadas da cultivar \'Védrantais\'). Portanto, estes acessos mostram-se como potenciais fontes de resistência ao vírus para o emprego em programas de melhoramento.