Efeito da estimulação purinérgica sobre a produção de melatonina em macrófagos da linhagem RAW 264.7

A melatonina é um hormônio produzido de forma rítmica e no período de escuro pela glândula pineal bem como de forma não rítmica por diversos tecidos e células imunocompetentes. É sintetizada pela acetilação e metilação da serotonina pela ação das enzimas arilalquilamina N-acetiltransferase (AA-NAT) e acetilserotonina -O-metiltransferase (ASMT) que levam à formação de N-acetilserotonina (NAS) e melatonina (MEL), respectivamente. Nos últimos anos temos demonstrado que síntese de melatonina pela pineal pode ser negativamente modulada por mediadores inflamatórios e pelo ATP que atua como co-transmissor juntamente com a noradrenalina liberada no terminal nervoso simpático que a inerva. Perifericamente, contudo, estes mediadores inflamatórios apresentam um efeito contrário induzindo a produção de melatonina em células imunocompetentes. Estas observações levaram à criação da hipótese de um eixo imune-pineal. Esse trabalho teve como objetivo verificar o efeito do ATP sobre produção de melatonina em macrófagos da linhagem RAW 264.7 Os dados desse trabalho mostram que o ATP é capaz de induzir de maneira dose dependente a produção de melatonina em macrófagos através da modulação das enzimas AA-NAT e ASMT. Foi demostrado também que esse efeito é mediado pelo receptor P2X7 e que a melatonina produzida age autocrina e paracrinamente aumentando a fagocitose de particulas de zimosan. Com isso, podemos concluir que o ATP é um ativador endógeno do eixo imune-pineal

Investigação do papel de SIGIRR/IL-1R8 no crosstalk entre células tumorais e o infiltrado leucocitário

Células tumorais desenvolvem diversas estratégias para escapar da identificação e eliminação pelo sistema imune. Dessa forma, a investigação dos mecanismos envolvidos na comunicação celular no microambiente tumoral e na desregulação local do sistema imune é crítica para uma melhor compreensão da progressão da doença e para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas mais eficazes. Nós aqui demonstramos que SIGIRR/IL-1R8, um importante regulador negativo de receptores de Interleucina-1 (ILRs) e receptores do tipo Toll (TLRs), apresenta expressão aumentada em uma linhagem celular epitelial mamária transformada pela superexpressão do oncogene HER2 e em tumores primários de mama, e promove o crescimento tumoral e metástase através da modulação da inflamação associada ao câncer e da atenuação da resposta imune antitumoral. Observamos que IL-1R8 tem sua expressão correlacionada com HER2 em tecidos mamários e sua alta expressão é fator de pior prognóstico em câncer de mama de baixo grau. Notavelmente, níveis aumentados de IL-1R8 foram observados especialmente nos subtipos HER2+ e Luminais de tumores de mama, e sua expressão aumentada em células epiteliais de mama transformadas por HER2 diminui a ativação da via de NF-κB e a expressão de diferentes citocinas pro-inflamatórias (IL-6, IL-8, TNF, CSF2, CSF3 e IFN-β1). Meio condicionado de células transformadas por HER2, mas não de variantes celulares com o gene IL-1R8 silenciado, induz a polarização de macrófagos para o fenótipo M2 e inibe a ativação de células NK. Em um modelo murino transgênico de tumorigênese espontânea mediada por HER2, MMTV-neu, verificamos que a deficiência de IL-1R8 (IL-1R8-/-neu) retardou o aparecimento de tumores e reduziu a incidência, a carga tumoral e a disseminação metastática. Contudo, não foram observadas diferenças significativas no crescimento tumoral quando animais IL-1R8-/-neu receberam medula óssea de animais IL-1R8+/+, confirmando um papel importante da expressão de IL-1R8 em células não hematopoiéticas na tumorigênese da mama. Tumores IL-1R8+/+neu apresentaram maiores níveis de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β e VEGF, e menores níveis da citocina imunomodulatória IFN-γ. Além disso, tumores que expressavam IL-1R8 apresentaram menor infiltrado de células NK maduras, células dendríticas (DCs) e linfócitos T-CD8+ e um maior infiltrado de macrófagos M2 e linfócitos T-CD4+. Coletivamente, esses resultados indicam que a expressão de IL-1R8 em tumores de mama pode representar um novo mecanismo de escape da resposta imune e suportam IL-1R8 como potencial alvo terapêutico.

Mecanismos e a influência de ferro lábil em processos nitrosativos intracelulares utilizando o indicador fluorescente 4,5 diamino fluoresceína

Neste trabalho foram investigados os mecanismos e o perfil cinético de processos nitrosativos do ponto de vista da nitrosação do indicador 4,5-diamino fluoresceina (DAF2) em células do tipo RAW 264.7. Também foi investigado o papel que ferro lábil (LIP) exerce em tais processos. O estudo cinético mostrou que a nitrosação do DAF2 é dependente de superóxido intracelular e se processa por dois mecanismos distintos denominados nitrosilação oxidativa e nitrosação. Observou-se que o perfil cinético da nitrosaçao do DAF2 sofre uma transição passando de dependente para independente com relação à concentração de NO, quando a concentração de NO se aproxima de 100-110nM. Este perfil está relacionado com a dinâmica de recombinação entre NO e O2¯ que dispara todo o processo de nitrosação do DAF2. No trabalho fica claro que processos nitrosativos que ocorrem pelos mesmos mecanismos podem apresentar perfis cinéticos completamente diferentes dependendo da localização onde ocorre a recombinação entre NO e O2¯. O ponto mais interessante foi a constatação de que quelantes permeáveis à membranas biológicas estimulam a nitrosação do DAF2 intracelular. Este efeito é decorrente da remoção de LIP intracelular que, surpreendementemente, apresenta papel antinitrosativo nas condições experimentais estudadas. O papel incomum antinitrosativo apresentado por LIP é analizado do ponto de vista da reação entre LIP e ONOO¯ que tem como produto nitrito, uma espécie não nitrosante. Estes resultados podem alterar a forma como LIP é visto em processos oxidativos e nitrosativos.

O estudo das células Tγδ na manutenção da tolerância materna em vacas gestantes

O sistema imunológico materno desempenha um papel importante no estabelecimento da gestação e desenvolvimento de concepto até início do parto. A hipótese deste projeto é que há um recrutamento de células Tγδ para o endométrio ao longo da gestação que expressam citocinas que favorecem o estabelecimento e manutenção da tolerância materna a antígenos fetais durante a gestação em bovinos. Experimento I Para estudar a dinâmica populacional das células do sistema imune no sangue periférico de não lactantes não prenhes (NLNP), vacas lactantes no 1º trimestre e vacas no 3º trimestre da gestação, as PBMCs foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll, seguido por protocolo de imunocitoquímica e analisadas em citômetro de fluxo para os anticorpos CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ e WC1+. As células analisadas tanto na região de linfócitos quanto na região de monócitos, não apresentaram diferença significativa entre os grupos analisados. Experimento II Para análise do perfil de expressão gênica das células Tγδ, foram coletadas amostras de sangue de vacas no 1º trimestre da gestação, vacas lactantes não prenhes (LNP) e vacas não lactantes não prenhes (NLNP). As células mononucleares foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll e células Tγδ foram analisadas quanto ao perfil de citocinas por qRT-PCR para os genes IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 e TNFA. A análise de expressão gênica mostrou tendência no aumento na expressão de IL1B, IL6 e TGFB2 em células PBMC em vacas NLNP quando comparado com vacas LNP e no 1º trimestre da gestação, enquanto que os outros genes analisados não apresentaram diferença significativa. Experimento III Fragmentos de endométrio, provenientes de abatedouro, foram coletados de vacas em 1º trimestre (33 a 35 dias de gestação), 2º trimestre (143 a 182 dias de gestação) e 3º trimestre de gestação (228 a 247 dias de gestação). Cortes congelados foram imunolocalizados e quantificados para as células do sistema imune CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+ e WC1+ por imunofluorescência. Nossos estudos mostraram aumento das células CD25+ e CD62L+ no endométrio no início da gestação. No meio da gestação, há um aumento das células WC1+ e CD14+. No final da gestação, observamos o aumento de CD14+, CD25+, CD18+ e CD62L+. Em suma, nossos dados sugerem que a modulação do sistema imune materno é específica para cada estágio da gestação, sendo que no início da gestação há um envolvimento de células T ativadas (CD25+) provavelmente para o estabelecimento de uma resposta ativa para tolerância dos antígenos fetais. Já no meio da gestação, há um recrutamento massivo de células Tγδ para o endométrio gravídico provavelmente para manter um microambiente de tolerância para o desenvolvimento fetal e no final da gestação células efetoras como macrófagos são recrutadas para o endométrio para auxiliar no processo do parto e involução uterina.

Efeitos do oxigênio umidificado e não umidificado via cateter nasal sobre o transporte mucociliar e muco nasal

O transporte mucociliar (TMC) é um mecanismo básico de defesa do sistema respiratório necessário na resistência à infecção. A efetividade desse mecanismo de defesa depende da composição e profundidade do muco, da integridade e da função dos cílios e da interação muco-cílio. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos crônicos do oxigenoterapia de baixo fluxo via cateter nasal com e sem umidificação sobre o TMC nasal, nas propriedades físicas do muco, na inflamação e nos sintomas de vias aéreas em pacientes com hipoxemia crônica com necessidade de oxigenoterapia domiciliar de longo prazo (>15 horas/dia). Dezoito pacientes (idade média de 68 anos, 7 do sexo masculino, índice de massa corpórea (IMC) médio de 26 kg/m2, 66% com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), 60% com hipertensão arterial (HAS) e ex-tabagistas) iniciando oxigenoterapia de baixo fluxo via cateter nasal foram randomizados para o grupo Oxigênio Seco (n=10) ou Oxigênio Umidificado (n=9). Os pacientes foram avaliados nos tempos: basal, 12 horas, 7 dias, 30 dias, 12 meses e 24 meses para o TMC nasal por meio do teste de trânsito da sacarina, as propriedades físicas do muco por meio de ângulo de contato, a inflamação por meio de quantificação do número total de células e diferenciais e da concentração de citocinas no lavado nasal assim como para sintomas por meio do questionário SNOT-20. O sintoma mais importante relatado por pacientes no basal foi tosse que melhorou após 7 dias de oxigenoterapia. No nosso estudo, os pacientes de ambos grupos apresentaram prolongamento significativo (40%) do TMC nasal ao longo do estudo. O lavado nasal mostrou um aumento das proporções de neutrófilos, das células caliciformes e da concentração do fator de crescimento epidermal (EGF) assim como reduções em macrófagos e concentrações de interferon alfa (IFN-alfa), interleucina (IL)-8 e IL-10 ao longo do estudo. Não houve alterações na proporção de células ciliadas, na concentração de IL-6 e no ângulo de contato do muco em ambos os grupos. A tosse e os sintomas de sono diminuiram significativamente em ambos os grupos. Nosso estudo sugere que a umidificação não tem impacto sobre o TMC nasal, as propriedades do muco, a inflamação e os sintomas em pacientes com baixo fluxo de oxigênio via cateter nasal (BFON)

Efeito das gorduras interesterificadas sobre o desenvolvimento da lesão aterosclerótica em camundongos knockout para o receptor de LDL

Nas últimas décadas, diversos estudos têm demonstrado os efeitos nocivos dos ácidos graxos trans à saúde. Consequentemente, diversas agências reguladoras de saúde e sociedades responsáveis pela elaboração de diretrizes nutricionais recomendaram a redução do consumo desses ácidos graxos. Deste modo, a indústria de alimentos vem adequando seus produtos a fim de substituir os ácidos graxos trans por gorduras interesterificadas, porém seus efeitos sobre o desenvolvimento da aterosclerose não foram ainda totalmente elucidados. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de gorduras interesterificadas contendo principalmente ácido graxo palmítico ou esteárico sobre o desenvolvimento da aterosclerose. Desta forma, camundongos knockout para o receptor de LDL (LDLr-KO) recém-desmamados foram alimentados por 16 semanas com dietas hiperlipídicas (40% do valor calórico total sob forma de gordura) contendo principalmente ácidos graxos poli-insaturados (POLI), trans (TRANS), palmítico (PALM), palmítico interesterificado (PALM INTER), esteárico (ESTEAR) ou esteárico interesterificado (ESTEAR INTER) para determinação de concentrações plasmáticas de colesterol total e triglicérides; perfil de lipoproteínas; conteúdo de lípides (Oil Red O) e colágeno (Picrosirius Red) e infiltrado de macrófagos (imuno-histoquímica) na área de lesão aterosclerótica; expressão e conteúdo proteico de citocinas na aorta; dosagem das citocinas secretadas por macrófagos de peritônio estimulados ou não com lipopolissacarídeo (LPS); efluxo celular de colesterol mediado pela apo-AI e HDL2. Os resultados mostraram que os animais que consumiram a gordura interesterificada contendo ácido palmítico (PALM INTER) desenvolveram importante lesão aterosclerótica em comparação aos grupos PALM, ESTEAR, ESTEAR INTER e POLI, resultados confirmados pelo conteúdo de colágeno na lesão. Apesar do processo de interesterificação não ter alterado as concentrações plasmáticas de lípides, conforme verificado entre os grupos PALM vs PALM INTER e ESTEAR vs ESTEAR INTER, o acúmulo de colesterol na partícula de LDL foi similar entre os grupos PALM INTER e TRANS. Além desse efeito sobre o perfil de lipoproteínas, macrófagos do peritônio de camundongos que consumiram PALM INTER secretaram significativamente mais IL-1beta, IL-6 e MCP-1 em comparação aos demais grupos. Esse efeito pró-inflamatório foi confirmado na aorta, onde se observou maior expressão de TNF-alfa e IL-1beta para o grupo PALM INTER em comparação a PALM. Tal insulto inflamatório foi similar ao provocado por TRANS. Esses efeitos deletérios do PALM INTER podem ser parcialmente atribuídos ao acúmulo de colesterol nos macrófagos, promovido pelo prejuízo no efluxo de colesterol mediado pela apo-AI e HDL2, bem como aumento da expressão de receptores envolvidos na captação de LDL modificada (Olr-1) e diminuição daqueles envolvidos na remoção intracelular de colesterol (Abca1 e Nr1h3) na parede arterial. Como conclusão, as gorduras interesterificadas contendo ácido palmítico favorecem o acúmulo de colesterol nas partículas de LDL e em macrófagos, ativando o processo inflamatório, o que conjuntamente contribuiu para maior desenvolvimento de lesão aterosclerótica

Alterações na resposta imune inata e adaptativa induzidas por Escherichia coli enteroinvasora em modelo murino

Durante uma infecção, uma complexa seqüência de eventos é inkiada após a invasão do hospedeiro por microrganismos patogênicos. Escherichia coli enteroinvasora (EIEC), assim como Shigella, causa disenteria através da invasão da mucosa do cólon, levando à destruição tecidual e inflamação. Para que ocorra um processo infeccioso, porém, são necessários inóculos de 102 Shigella e 106 EIEC. Foram avaliados aspectos da resposta inflamatória desencadeada pela infecção por EIEC em modelo murino, comparativamente a Shigella. A infecção de macrófagos J774 por EIEC resultou em fagocitose bacteriana, comprometimento da viabilidade do macrófago e produção de citocinas. Macrófagos de camundongos C57BU6 infectados com EIEC produziram NO, que parece ser importante no controle da infecção. Foi observado que camundongos INOS nocaute apresentaram maior produção de citocinas pró-inflamatórias e maior letalidade após infecção do que os selvagens. EIEC induziu a migração de granulócitos e monócitos para o peritônio, e a secreção de citocinas por estas células. Houve proliferação de linfócitos em resposta aos antígenos solúveis de EIEC, mas não foi detectada produção de citocinas por estes linfócitos.Comparativamente a Shigella, EIEC escapou mais lentamente do macrófago, induziu menor produção de citocinas pró-inflamatórias e NO, e menor ativação dos linfócitos T. Estes dados sugerem o desafio com EIEC desencadeia uma resposta menos severa no hospedeiro do que Shigella, o que explicaria a forma mais branda de disenteria e resolução mais rápida do processo infeccioso causado por EIEC.

Efeitos da imunossupressão sobre a depuração mucociliar de ratos: comparação entre dois esquemas de terapia tríplice

INTRODUÇÃO: O transplante de pulmão é parte fundamental no tratamento das doenças terminais do pulmão, constituindo uma modalidade terapêutica eficaz para pacientes com doença pulmonar incapacitante, progressiva e em estágio final. No entanto, as drogas imunossupressoras usadas para evitar a rejeição do enxerto podem causar efeitos colaterais em diversos tecidos. O sistema mucociliar, presente nas vias aéreas, é um dos principais mecanismos de defesa do trato respiratório e pode ser alterado por ação das drogas imunossupressoras. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o sistema mucociliar traqueobrônquico de ratos submetidos a dois esquemas de terapia tríplice imunossupressora. MÉTODOS: Foram utilizados 90 ratos machos Wistar distribuídos em 3 grupos conforme o tratamento: controle (C) = solução salina; terapia 1 (TI) = tacrolimus + micofenolato de mofetil + prednisona; terapia 2 (TII) = ciclosporina + azatioprina + prednisona. Após o período de tratamento (7, 15 ou 30 dias), os animais foram sacrificados e realizadas as seguintes medidas: transportabilidade do muco (TM), frequência de batimento ciliar (FBC), quantificação de muco neutro e ácido, velocidade de transporte mucociliar (VTMC), e contagem total e diferencial de células no lavado broncoalveolar (LBA). RESULTADOS: A TM não foi afetada pelas terapias em nenhum dos tempos estudados. Ambas as terapias causaram significativa redução da FBC dos animais tratados por 7 e 15 dias. A produção de muco neutro foi menor nos animais tratados com a TI por 7, 15 e 30 dias. Porém, com a TII, essa redução ocorreu apenas aos 7 dias. Por outro lado, a quantidade de muco ácido foi significativamente maior em todos os animais tratados com as duas terapias. Todos os animais tratados com as terapias imunossupressoras apresentaram redução da VTMC nos três tempos. Houve aumento do número total de células e de macrófagos e neutrófilos no grupo TI em 7 dias. CONCLUSÕES: Ambas as terapias imunossupressoras foram prejudiciais ao transporte mucociliar das vias aéreas de ratos, tanto pela redução da FBC e da VTMC, quanto pela maior produção de muco ácido e menor produção de muco neutro. A TI foi mais prejudicial ao sistema mucociliar em comparação à TII

Avaliação do tratamento com um inibidor para serinoprotease em modelo experimental de enfisema induzido por exposição à fumaça de cigarro

Introdução: Demonstramos previamente que em modelo experimental de enfisema pulmonar induzido por instilação de elastase, o inibidor de serinoprotease rBmTI-A promoveu a melhora da destruição tecidual em camundongos. Considerando que o tabagismo é o principal fator de risco para o desenvolvimento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e que o modelo de exposição à fumaça de cigarro é considerado o que melhor mimetiza esta doença em humanos, este estudo teve por objetivo verificar a ação do inibidor para serinoproteases rBmTI-A sobre os processos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento do enfisema pulmonar, em modelo de exposição ao tabaco. Métodos: Para a indução do enfisema pulmonar, os animais foram expostos à fumaça de cigarro (duas vezes ao dia/ 30 minutos/ 5 dias por semana/ durante 12 semanas), e os animais controle permaneceram expostos ao ar ambiente. Dois protocolos de tratamento com o inibidor rBmTI-A foram realizados. No primeiro, os animais receberam duas administrações do inibidor rBmTI-A ou de seu veículo (Solução Salina 0,9%) por via intranasal, sendo a primeira após 24h do término das exposições ao cigarro e outra, 7 dias após à primeira instilação do inibidor. No segundo protocolo, os animais receberam 3 administrações do inibidor rBmTI-A, durante o tempo de exposição (1ª dose: 24h antes do início da exposição à fumaça de cigarro; 2ª dose: um mês após o início da exposição; 3ª dose: dois meses após o início). Após o término dos protocolos de exposição e tratamento, os animais foram submetidos aos procedimentos para coleta dos dados de mecânica respiratória e avaliação do Intercepto Linear Médio (Lm). Para o segundo protocolo, realizamos também as medidas para quantificação de fibras de colágeno e elástica, da densidade de células positivas para MAC-2, MMP-12 e 9, TIMP-1, Gp91phox e TNFalfa; no parênquima através de imunohistoquímica, contagem de células polimorfonucleares além da expressão gênica de MMP-12 e 9 no pulmão através de RT-qPCR. Resultados e Discussão: O tratamento com o inibidor para serinoprotease rBmTI-A atenuou o desenvolvimento do enfisema pulmonar apenas no segundo protocolo, quando foi administrado durante a exposição à fumaça de cigarro. Embora os grupos Fumo-rBmTIA e Fumo-VE apresentem aumento de Lm comparados aos grupos controles, houve uma redução deste índice no grupo Fumo-rBmTIA comparado ao grupo Fumo-VE. O mesmo comportamento foi observado para as análises de proporção em volume de fibras de elástica e colágeno no parênquima. Além disto, observamos aumento de macrófagos, MMP-12, MMP-9 e TNFalfa; nos grupos expostos à fumaça de cigarro, mas o tratamento com o inibidor rBmTI-A diminuiu apenas a quantidade de células positivas para MMP-12. Na avaliação da expressão gênica para MMP-12 e 9, não observamos diferença entre os grupos experimentais e o mesmo comportamento foi observado para a quantidade de células polimorfonucleares no parênquima. Além disso, observamos aumento de GP91phox e TIMP-1 nos grupos tratados com rBmTIA. Conclusões: Tais resultados sugerem que o inibidor rBmTI-A não foi efetivo como tratamento da lesão após a doença instalada. Entretanto, atenuou o desenvolvimento da doença quando administrado durante a indução do enfisema, possivelmente através do aumento de GP91phox e TIMP-1, acompanhados pela diminuição de MMP-12.

Caracterização de nanopartículas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipossoma e avaliação da eficiência de entrega gênica a células de mamífero.

Em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA, a eficiência e a segurança dos vetores que transportam o material genético terapêutico possuem papel fundamental. Vetores não virais são considerados mais seguros, mas menos eficientes em relação aos vetores virais. Em parte, isso se deve à falta de estudos sistemáticos e comparativos no que diz respeito às características físico-químicas desses vetores quando em soluções biológicas e o efeito delas sobre a eficiência de entrega gênica. O objetivo deste trabalho é avaliar o efeito do pH, da força iônica e do tipo tampão de complexação sobre as características físico-químicas de nanopartículas pDNA-protamina e pDNA-protamina-lipofectamina, visando à entrega gênica para diferentes linhagens celulares. Para isso, nanopartículas formadas em diferentes condições foram caracterizadas através de ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e potencial zeta. Os estudos indicaram que o pH, a força iônica, o tipo de tampão e a presença de meio de cultura e soro no ambiente de complexação alteram significativamente o tamanho, a polidispersidade e o potencial zeta das partículas formadas. Finalmente, buscou-se avaliar o efeito dessas características sobre a eficiência de transfecção in vitro de células de macrófagos IC21 e células HeLa. Os estudos de transfecção em células Hela indicam que tanto a composição como as condições de formação das partículas influenciam significativamente a eficiência de transfecção.