Estudo do potencial imunomodulador de Dehidroepiandrosterona (DHEA) na inflamação intestinal experimental

As Doenças inflamatórias intestinais (DII) são multifatoriais e sua etiologia envolve susceptibilidade genética, fatores ambientais, disbiose e ativação exacerbada do sistema imunológico no intestino. Essas doenças também tem sido relacionadas a baixos níveis de dehidroepiandrosterona (DHEA), um hormônio precursor de diversos esteroides e relacionado à modulação das respostas imunes. Porém, os mecanismos precisos que relacionam as ações deste hormônio com a proteção ou susceptibilidade à doença de Crohn ou colite ulcerativa ainda não são totalmente conhecidos. Sendo assim, este projeto buscou entender o papel imunomodulador do DHEA exógeno in vitro e in vivo durante a inflamação intestinal experimental induzida por dextran sulfato de sódio (DSS) em camundongos C57BL/6. Inicialmente, in vitro, DHEA inibiu a proliferação de células do baço de forma dose dependente nas concentrações de 5?M, 50?M ou 100?M, com diminuição da produção de IFN-?. Este hormônio não foi tóxico para células de linhagem mieloide, embora tenha causado necrose em leucócitos nas doses mais elevada (50 ?M e 100?M), o que pode ter influenciado a diminuição das citocinas in vitro. Nos ensaios in vivo, os camundongos tratados com DHEA (40 mg/Kg) foram avaliados na fase de indução da doença (dia 6) e durante o reparo tecidual, quando os animais expostos ao DSS e ao DHEA por 9 dias foram mantidos na ausência destas drogas até o dia 15. Houve diminuição do escore pós-morte, melhora no peso e nos sinais clínicos da inflamação intestinal, com redução de monócitos no sangue periférico com 6 dias e aumento de neutrófilos circulantes na fase de reparo tecidual (15 dias). Ainda, a suplementação com DHEA levou à redução da celularidade da lâmina própria (LP) e ao restabelecimento do comprimento normal do intestino. O uso deste hormônio também diminuiu a expressão do RNAm de IL-6 e TGF-?, enquanto aumentou a expressão de IL-13 no colón dos animais durante a fase de indução da doença, o que provavelmente ajudou na atenuação da inflamação intestinal. Além disso, houve acúmulo de linfócitos CD4+ e CD8+ no baço e diminuição apenas de linfócitos CD4+ nos linfonodos mesentéricos (LNM), indicando retenção das células CD4+ no baço após uso do DHEA. O tratamento foi também capaz de aumentar a frequência de células CD4 produtoras de IL-4 e diminuir CD4+IFN-?+ no baço, além de reduzir a frequência de CD4+IL-17+ nos LNM, sugerindo efeito do DHEA no balanço das respostas Th1/Th2/Th17 relacionadas à colite. Em adição, as células de baço dos animais tratados com DHEA e expostos ao DSS se tornaram hiporresponsivas, como visto pela diminuição da proliferação após re-estímulos in vitro. Finalmente, DHEA foi capaz de atuar no metabolismo dos camundongos tratados, levando à diminuição de colesterol total e da fração LDL no soro durante a fase de indução da doença, sem gerar quaisquer disfunções hepáticas. Com isso, podemos concluir que o DHEA atua por meio do balanço das respostas imunes exacerbadas, minimizando os danos locais e sistêmicos causados pela inflamação intestinal induzida por DSS.

Variabilidade intratípica de HPV 16 em relação à origem étnica e HLA de uma população de alto risco para o câncer do colo do útero

A infecção por papilomavirus é a principal causa de desenvolvimento de neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC) e câncer do colo do útero (CCU). Estudos epidemiológicos têm demonstrado que a persistência do genoma viral encontra-se associado a variantes moleculares específicas de papilomavirus humano (HPV) de alto risco. As moléculas HLA de classe II têm um importante papel na resposta imune. Associações entre HLA e CCU ou infecção por HPV tem sido demonstrado em diferentes populações. O nosso objetivo foi verificar se a variabilidade de HLA-DRB1 e DQB1 estavam associada ao CCU e NIC III em mulheres de Belém, uma população formada pelos 3 principais grupos étnicos humanos e uma área de alto risco para o CCU no Norte do Brasil. Foi investigada a existência de diferenças na distribuição de alelos HLA entre mulheres com CCU e NIC III portadoras de diferentes variantes de HPV-16 e mulheres citologicamente normais. Os genes HLA DQB1 e DRB1 foram tipados pelo método de PCR-SSO em 95 casos e 287 controles de mulheres com citologia normal atendidas em um centro de prevenção do colo do útero na mesma cidade. As variantes de HPV-16 foram tipadas por sequenciamento de um fragmento da região controladora do genoma viral (LCR). O polimorfismo na posição 350 do gene E6 foi tipado baseado em um protocolo de hibridização em pontos, para identificar a alteração na posição 350T→G. A magnitude das associações foi estimada por odds ratio (OR) e os respectivos intervalos de confiança (IC), ajustados para potenciais fatores de confusão. Uma associação positiva foi observada entre CCU e os haplótipos DRB1* 150 l-DQB1*0602, DRB1*04-DQB1*0301 e DRB1*1602-DQB1*0301. Ao contrário, DRB1*01-DQB1*0501 mostrou um efeito protetor. Os alelos DRB1*0804, DQB1*0402 apresentaram efeito protetor contra positividade por HPV. O alelo DQB1*0502 e o grupo DRB1*15 foram positivamente associados. Os nossos resultados mostram que as associações positivas de DRB1*1501 e DRB1*1602 podem ser atribuídas a variantes asiático-americanas quando comparado a variantes européias. O risco conferido a DRB1*1501 foi encontrado associado tanto a variantes E6350G quanto a variantes E6350T, entretanto, o maior efeito foi devido às variantes E6250T. A associação positiva de DRB1*1602 foi significativa somente no grupo de mulheres positivas para E6350G. Estes resultados estão de acordo com a composição étnica da população estudada bem como um maior potencial oncogênico de certas variantes. Nossos dados sugerem que a contribuição dos alelos HLA na susceptibilidade genética ao CCU difere de acordo com a distribuição das variantes de HPV em uma dada região geográfica ou grupo étnico.

Genetic diversity and susceptibility to Vip3Aa20 protein in Brazilian populations of Helicoverpa armigera and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae)

Helicoverpa armigera (Hübner) was officially reported in Brazil in 2013. This species is closely related to Helicoverpa zea (Boddie) and has caused significant crop damage in Brazil. The use of genetically modified crops expressing insecticidal protein from Bacillus thuringiensis (Berliner) has been one of the control tactics for managing these pests. Genetically modified maize expressing Vip3Aa20 was approved to commercial use in Brazil in 2009. Understanding the genetic diversity and the susceptibility to B. thuringiensis proteins in H. armigera and H. zea populations in Brazil are crucial for establishing Insect Resistance Management (IRM) programs in Brazil. Therefore, the objectives of this study were: (a) to infer demographic parameters and genetic structure of H. armigera and H. zea Brazil; (b) to assess the intra and interspecific gene flow and genetic diversity of H. armigera and H. zea; and (c) to evaluate the susceptibility to Vip3Aa20 protein in H. armigera and H. zea populations of Brazil. A phylogeographic analysis of field H. armigera and H. zea populations was performed using a partial sequence data from the cytochrome c oxidase I (COI) gene. H. armigera individuals were most prevalent on dicotyledonous hosts and H. zea individuals were most prevalent on maize crops. Both species showed signs of demographic expansion and no genetic structure. High genetic diversity and wide distribution were observed for H. armigera. A joint analysis indicated the presence of Chinese, Indian, and European lineages within the Brazilian populations of H. armigera. In the cross-species amplification study, seven microsatellite loci were amplified; and showed a potential hybrid offspring in natural conditions. Interespecific analyses using the same microsatellite loci with Brazilian H. armigera and H. zea in compare to the USA H. zea were also conducted. When analyses were performed within each species, 10 microsatellites were used for H. armigera, and eight for H. zea. We detected high intraspecific gene flow in populations of H. armigera and H. zea from Brazil and H. zea from the USA. Genetic diversity was similar for both species. However, H. armigera was more similar to H. zea from Brazil than H. zea from the USA and some putative hybrid individuals were found in Brazilian populations.Tthere was low gene flow between Brazilian and USA H. zea. The baseline susceptibility to Vip3Aa20 resulted in low interpopulation variation for H. zea (3-fold) and for H. armigera (5-fold), based on LC50. H. armigera was more tolerant to Vip3Aa20 than H. zea (≈ 40 to 75-fold, based on CL50). The diagnostic concentration for susceptibility monitoring, based on CL99, was fairly high (6,400 ng Vip3Aa20/cm2) for H. zea and not validated for H. armigera due to the high amount of protein needed for bioassays. Implementing IRM strategies to Vip3Aa20 in H. armigera and H. zea will be of a great challenge in Brazil, mainly due to the low susceptibility to Vip3Aa20 and high genetic diversity and gene flow in both species, besides a potential of hybrid individuals between H. armigera and H. zea under field conditions.