水稻颖花开裂突变体的鉴定及颖花开裂基因srs-1的定位

　　水稻(Oryza sativa L.) 颖花开裂 (split rice spikelet，SRS) 突变体是从水稻品系 8902s 花药培养得到的双单倍体群体中筛选出的同源异型突变体。以窄叶青8号为母本，SRS突变体为父本配制杂交组合，其F2群体中正常植株和突变植株的分离比例符合3:1，说明颖花突变性状是由单隐性基因决定的。 利用扫描电镜观察 SRS突变体花器官形态发生过程。其性状表现为内外稃变软变长，不抱合，在外稃基部又着生一朵花，两浆片基部融合，质地呈稃片状，雄蕊和雌蕊形态正常，且可育。该突变体的突变性状与拟南芥APETALA1的突变表现相似，说明两者在形态建成方面具有相似之处。由于 SRS 突变体第一轮和第二轮花器官发生了变化，根据 ABC 模型，srs-l基因应属于同源异型 A 组基因。 采用BSA法在F2群体中建立DNA正常池和突变池，利用RAPD技术筛选与突变基因srs-l连锁的分子标记。从520条随机引物中筛选出了引物S465能在两池间扩增出分子量为900 bp的差异片段，并证明其在F2群体中表现共分离。将此DNA片段克隆后作为RFLP探针pS465A，该探针与srs-l基因紧密连锁，在DH群体的RFLP分子连锁图谱上成功地将它们定位于第三染色体上。 本研究是利用水稻同源异型突变体为材料，研究水稻花器官发育基因的首例报道。

几种固氮菌突变种固氮酶的特性及晶体生长

一，缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白的晶体生长的研究进展 在一定的结晶条件下，缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白将从溶液中结晶出深棕色的短斜四棱柱晶体。PEG 8000、MgCl2、NaCl、Tris的浓度及缓冲液的pH对该蛋白的结晶及晶体生长影响的系统研究表明，它们的浓度和pH较低时，不出晶体;当pH高于8.0，随着前三种化合物浓度的逐渐提高，便在一周内出现大量小品体;再提高浓度后，便延长结晶时问但出质好、数少而个大的晶体;然后晶体随浓度的提高而又变小、变多、甚至晶质变差，直至不再出晶体。影响晶体生长的各因子的最适浓度随其它条件的改变而有所不同。当缓冲液的pH为8.2而PEG 8000，MgCl’、NaCI、蛋白质和Tris的浓度分别为1.86%、300 mmol/L、400 mmoUL、4.64g/L、53 mmo/L时，首次发现在一滴悬滴结晶液中只有一颗较大的优质晶体（最大两边线度均为0.16mm）。 二，从分别含Mn和Cr的培养基中生长的固氮菌突变种UW3中纯化的固氮酶的特性和结晶 缺失nifH基因的棕色固氮菌突变种UW3，在有钼环境中不能固氮生长，但能在无钼而含MnS01或Na2Cr01的无氮培养基中固氮生长。分别经超声破碎、加热除去部分杂蛋白、离子交换柱层析和Sephacryl S-200或S-300柱层析的分离纯化，分别得到二种固氮酶组分l蛋白。金属元素测定表明，这两种蛋白除含铁元素外还分别含有锰和铬元素。它们的吸收光谱、CD和AR谱互不完全相同，并都与OP-MoFe蛋白存在较大差异。含Mn固氮酶也能还原C2H2、质子和N2，对它们的还原的比活性都分别约为MoFe蛋白活性的50%。初步结果表明，这一突变种在这两种培养条件下都可能已表达了不同于已发现的三种固氮酶的新固氮酶组分l蛋白-MoFe、VFe和FeFe蛋白，分别为含Mn或Cr的固氮酶组分1蛋白，分别被称为uw3，-MnFe蛋白和UW3-CrFe蛋白。通过对PEG 8000、MgCI2、NaCI和缓冲液的种类和浓度等结晶条件的大量优化组合实验，首次获得uw3-MnFe蛋白和UW3-CrFe蛋白的的晶体。最大晶体为21.4×14.3×2.1μm。

噬菌体434单链阻遏蛋白的高亲和力DNA结合序列的设计和筛选

一． 设计和筛选单链阻遏蛋白的高亲和力DNA结合序列 　　单链阻遏蛋白RRTRES是噬菌体434阻遏蛋白的衍生物，它是噬菌体434阻 遏蛋白的N端DBD(1-69位氨基酸)组成的共价二聚体。这个单链分子有两个DBD，一个是野生型噬菌体434的DBD-R，另一个是突变了的DBD - RTRES，二者用重组接头以头接尾的方式连接起来。在RTRES的α3-螺旋中．1、1、2、5位氨基酸与DNA识别紧密相关，它们分别为T、R、E、S。为了筛选出突变的RTRES的DNA结合位点，设计了核心序列为CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG随机DNA库，通过RRTRES与随机DNA库的体外结合和循环筛选。将筛选到的群体克隆并测序。通过与单链阻遏蛋白RRTRES的亲和力测定，对每一个筛选到的序列进行特性分析。结果表明，当结合位点（上述划线部分）为TTAC或TTCC时为最适操纵区序列。它们与单链阻遏蛋白RRTRES的亲和力很高，Kd值在1-10pM的范围。其中随机部分为TTTACG的操纵区与RRTRES的亲和力最高，Kd值约为lpM;当结合位点为TTAC时，平均Kd值为3pM：当结合位点为 TTCC时，Kd值在5-lOpM之间。天然噬菌体434阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的Kd值在nM数量级，与之相比，所筛选操纵区的亲和力明显提高。此外，亲和力大小还受到结合位点两侧的碱基的影响，特别是5'位碱基的影响。 　　表达纯化同源双突变的单链阻遏蛋白RTRESRTRE'根据RTRES的以上识别特一点，设计了一系列新的操纵区序列，它们的共有序列为GTAAGAAARNTTACN，或GGAAGAAARNTTCCN，并测定它们与RTRES RTRE之间的结合特异性。结果表明，它们可被RTRES RTRES特异识别，且亲和力也很高，Kd值在5-40pM之间。其中GTAAGAAAGTTTACG与RTRES RTRES之间结合的Kd值约为5pM。同样，表达了异源双突变的单链阻遏蛋白R*RTRES，然而它与 设计的相关操纵区的亲和力并不很高，Kd值约为lOOpM。利用本工作中的随机筛选和合理设计的原则，得到了新的具有特异性识别和高亲和力的蛋白一DNA相互作用。这个方法可望用于其他DBP的新的结合特异性的筛选。 二． 非同位素的方法筛选单链阻遏蛋白的最佳DNA结合序列初探 　　克隆和表达了带半胱氨酸尾的单链阻遏蛋白，利用已包被了马来酰胺的活性板可以与自由巯基结合的特性，将蛋白固定在活性板表面。体外筛选RTRES RTRES的最佳DNA结合序列，得到了一些与RTRES RTRES结合的序列，但Kd值nM数量级。此方法需进一步优化。

大蒜、绊根草中重金属抗性分子机制的研究

日益加剧的重金属污染已经危害到了全球的生态环境以及人类健康。在分子水平上阐明植物中的重金属抗性机制并应用于环境修复和绿色农业是植物科学和环境科学以及农业科学的交叉点和新的生长点。为了了解植物重金属抗性的分子机制，我们的研究主要是从重金属抗性植物材料大蒜(Allium sativumL．)和绊根草(Cynodon dactylon)中分离重金属抗性相关基因，并研究它们在重金属抗性机制中的功能。 在高等植物中有迹象表明，一种富含半胱氨酸的低分子量蛋白．类金属硫蛋白 (Metallothioneins Like，MTs Like)和一类具有Y-(Glu-Cys) n-Gly特殊结构的多肽一植物络合素(Phytochelatins，PCs)在重金属抗性机制中占有重要地位。然而人们对于同一种植物中这两种重金属结合肽作用的相互关系还缺乏了解，同时对于MT Like基因以及PCs合酶基因在同一种植物中的表达模式如金属离子专一性、时空表达特点等，还投有文献报道，因此本文将首先以这两个基因为切入点进行研究。 本研究采用RACE的方法，从大蒜中分离得到了类金属硫蛋白(MT-Like)的cDNA序列(GenBank Accession No.AY050510)，PCR和SoutheLrn Blot分析表明，大蒜基因组中不仅存在类金属硫蛋白基因，而且可能以基因家族的形式存在。对获得的MT Like cDNA进行的序列分析及同源性分析表明，大蒜MT Like cDNA含有一个完整的开放阅读框架，编码73个氨基酸，其中12个为半胱氨酸，占氨基酸总数的1 6.4%，并与其他植物如水稻、小麦、紫羊茅草中的类金属硫蛋白基因同源性较高，其中最高达89%。对该基因编码的氨基酸序列和结构分析表明在N-端、c-端结构域中分别含有3个典型的金属硫蛋白的结构模式Cys-Xaa-Cys，属于典型的Type-1类金属硫蛋白。这些Cys-Xaa-Cys特征结构表明大蒜MT Like基因编码的蛋白可以结合二价金属离子。重金属胁迫下大蒜根中MT Like基因在转录水平的表达检测表明，MT Like基因的表达受重金属离子Cu2+、Cd2+的诱导，暗示MT Like基因在大蒜对重金属的抗性中有重要作用。此外，用能谱电镜技术研究大蒜中重金属的积累与分布，以及用组织原位杂交技术分析MT Like基因的表达定位与重金属的积累、转运的关系已在进行之中。 植物络合素也是富含巯基的多肽化合物，在重金属抗性中起重要作用。由植物络合素结构中存在的Y一酰胺键或β-Ala可知PCs不是基因表达的直接产物，而是以GSH为前体的酶促反应产物。目前已知y一谷氨酰半胱氨酸二肽转肽酶(简称为PCs合酶，phytochelatin synthase，PCS)是PCs合成途径的关键酶，编码这一关键酶的基因目前已在小麦、拟南芥菜和裂殖酵母中克隆。由于这一基因在不同物种中的保守性较低，其克隆较困难。本研究通过设计植物络合素台酶基因简并引物，从大蒜中扩增得到了345bp的cDNA序列。序列分析和推测的氨基酸序列同源性比较表明，此序列的翻译产物与已知的植物络合素合酶同源性最高，此cDNA序列应为大蒜植物络合素合酶基因的部分cDNA序列(GenBank Accession No.AF384110)。目前大蒜植物络台素合酶基因的全长序列的扩增，以及这两种与重金属抗性有关的基因(MT Like，PCS)的表达模式仍在研究中。 本文还尝试了利用酵母重金属敏感突变株M379/8功能互补的方法从重金属抗性植物绊根革中分离新的重金属抗性相关基因。构建了用于转化的酵母质粒表达文库，探索了酵母转化体系建立的条件。曾尝试多种转化方法，并对其中的条件进行了优化改进。下一步的工作将集中在合适的酵母突变体的筛选或穿梭表达载体的选择标记基因替换上

棕色固氮菌突变种(UW45、DJ54和DJ35)的缺失FeMoco钼铁蛋白的纯化、特性鉴定及结晶研究

一．棕色固氮菌突变种UW45、缺失nifH（DJ54）和缺失nifE(DJ35)突变种的钼铁蛋白的纯化、特性鉴定及结晶研究 棕色固氮菌突变种UW45的菌体破碎后，所得粗提物经两次DEAE 52柱层析后得到部分纯的nifB- MoFe蛋白和Fe蛋白。再经Sephacryl S-300和 DEAE柱的进一步纯化，便使nifB- MoFe蛋白基本达到SDS凝胶电泳纯。SDS-PAGE结果表明，nifB- MoFe蛋白具有与野生型棕色固氮菌（OP）MoFe蛋白相同的亚基种类和组成。此粗提物可为用NMF抽提的 OP MoFe蛋白的FeMoco激活，所得Fe蛋白具有与OP Fe蛋白相似的互补活性，可使OP MoFe的比活性达到2192 nmol C2H2/min/mg蛋白。FeMoco可使无互补活性的 nifB- MoFe蛋白与nifB- Fe蛋白组成具有可观放氢活性的固氮酶，使FeMoco显出的比活性接近文献报道的还原乙炔的最高值。对nifB- MoFe蛋白的结晶及晶体生长进行了的研究，初步探讨了结晶溶液各组分的种类和浓度、结晶方法和实验操作等与能否出现晶体及晶体的数目、大小、质量、形状和出晶时间等的相互关系。在结晶实验时，一次就得到了国内外尚未报道的该蛋白的短斜四棱柱的棕色晶体。目前所得的最大的晶体的二维边长都为0.1mm。初步结果表明，这种晶体可能就是nifB- MoFe蛋白的晶体。 从棕色固氮菌突变种DJ54中得到了ΔnifH MoFe蛋白;并参与了棕色固氮菌突变种DJ35的ΔnifE MoFe蛋白的分离纯化，所用方法与nifB- MoFe蛋白的分离纯化相似。对这两种突变种蛋白的特性和结晶进行了初步研究。在结晶实验时，也是一次就得到了国内外尚未报道的ΔnifH MoFe蛋白和ΔnifEMoFe蛋白的晶体。 二．新型固氮酶MnFe蛋白和CrFe蛋白的特性与结晶研究 在已有的工作基础上，分离纯化了几批MnFe蛋白和CrFe蛋白，并用部分纯的nifB- Fe蛋白进行活性互补，分别测定了MnFe蛋白和CrFe蛋白的底物还原活性。不断优化MnFe蛋白和CrFe蛋白晶体生长条件，获得了晶质良好的MnFe蛋白和CrFe蛋白的较大晶体。 在2001年的“神舟2号”飞船搭载实验中，MnFe蛋白的出晶率达到100%，所获得的晶体也比地面对照略厚些。继续进行MnFe蛋白和CrFe蛋白的空间计划的地面匹配实验，以满足对蛋白质样品的要求，以保证宇宙飞船“神舟3号”的蛋白质搭载实验获得更好的结果。

拟南芥AST基因的精细作图

拟南芥ast (anthocyanin spotted testa) 突变体是由碳离子束诱导产生的与花青苷生物合成有关的突变体，受单隐性核基因控制。由于花青苷的异常积累，突变体未成熟种子的种皮呈现紫红色的斑点;野生型植株幼嫩的种皮没有花青苷的异常积累，呈淡绿色。初步作图分析表明，AST基因定位于拟南芥第I号染色体上，并且位于SSLP分子标记nga280和CAPS分子标记PAB5之间。 AST基因与SSLP分子标记nga280紧密连锁，遗传距离为3.2cM;与CAPS分子标记PAB5相距较远，遗传距离为21.1cM。 采用DDRT-PCR的策略，分析野生型与突变型植株未成熟角果中基因表达的差异。通过调整DDRT-PCR中总RNA、锚定引物、随机引物、cDNA和dNTP等关键试剂的用量，优化了适用于银染检测的DDRT-PCR方法。PCR扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后，银染能检测到多而清晰的条带。泳道中的条带数最少为40个，最多达80个，平均为60个，条带大小分布在100bp-900bp范围，银染的灵敏度为5pg/mm2。此方法操作简便快速，灵敏度高，重复性好。采用这个改良的的方法，分析了拟南芥野生型和ast突变型植株未成熟角果中16,000个cDNA扩增产物条带，从中筛选出28个差异条带。二次PCR扩增后，进一步筛选出10个差异表达的cDNA条带，其中6个是野生型特异表达的，4个是突变型特异表达的。对这10个差异片段进行测序。BLASTN分析表明，这10个差异表达的cDNA片段与数据库中花青苷生物合成途径中的结构基因和调节基因序列没有同源性，表明用DDRT-PCR的方法克隆特定的AST基因有一定的局限性。 利用图位克隆（map-based cloning）的策略，对拟南芥AST 基因进行克隆。根据拟南芥数据库中的SNPs (simple nucleotide polymophisms) 序列和插入/缺失多态性（insertion/deletion polymorphisms）序列，设计了一系列分子标记。利用这些分子标记，对600个F2代有突变表型的植株进行重组子筛选，完成了对拟南芥AST基因的精细作图，成功地将AST 基因定位到BAC克隆T13M11上。初步确定该BAC克隆中的基因T13M11.8 可能是AST基因。该基因的DNA序列长1432bp，含有6个外显子和5个内含子，编码的蛋白与花青苷生物合成途径中的二氢黄酮醇4-还原酶有较高的同源性。功能互补实验正在进行当中。

拟南芥bre突变体分析及小麦ver203F基因表达模式研究

第一部分 茎尖分生组织的中央部位是由干细胞组成，维持干细胞的动态平衡对于植物器官启动显得尤为重要。在拟南芥花序分生组织和花分生组织中分别有WUS/CLV和(WUS+LFY)/AG两个负反馈调节环控制着这一平衡，保证了花序分生组织的非决定性和花分生组织的决定性。 本文用T-DNA激活标签技术得到功能增强突变体bre，序列分析表明BRE就是干细胞特征基因WUSCHEL。定量RT-PCR表明在突变体的茎节间WUS大量表达，证实在WUS基因的调控区插入的4个35S增强子使WUS表达增强。突变体bre生长发育缓慢，茎弯曲，花器官数目改变，心皮发育加快。尤为突出的是在茎皮层直接分化出花分生组织。这些表型可能与WUS的表达增强有关。这说明WUS功能是多效的，除了在分生组织中决定干细胞命运、促进CLV和AG的表达外，还可能与生长素极性运输以及花分生组织特征基因的表达有关。 第二部分 春化作用是促进植物从营养生长向生殖生长转变的有效途径之一，作者所在实验室曾经分离到多个小麦春化相关基因。为研究春化期间它们在不同组织或不同细胞内的表达模式，首先建立并完善了RNA组织原位杂交系统。以春化相关基因ver203F为模板，采用地高辛为标记分子，借助体外转录制备RNA探针，分析了小麦胚芽和幼苗中ver203F的表达模式。结果表明：春化前和脱春化的胚芽中不表达ver203F，春化处理14天以上的胚芽幼叶表达ver203F,而且主要定位在叶的边缘分生组织细胞内，叶维管束和表皮组织未检测到转录物，胚芽鞘和茎尖分生组织中不表达。幼苗的侧芽中的幼叶有相同的表达模式。茉莉酸可以诱导ver203F的表达。．说明春化时的低温信号可能由幼叶接收，并有可能涉及到茉莉酸介导的信号转导途径。

小麦春化相关基因元件克隆分析与小麦矮化突变体的研究

一、 春化相关基因全长cDNA序列及其启动子的克隆与分析研究 通过建立小麦（Triticum aestivum. L. cv Jingdong No.1）胚芽春化cDNA文库，以春化相关基因VER2的3’端序列为探针，筛选获得全长1195 bp cDNA序列，它编码300个氨基酸。在VER2中存在植物疾病抗性反应蛋白和茉莉酸诱导凝集素两种蛋白的结构域。另外在VER2蛋白中存在核定位信号和多种磷酸酶的作用位点，VER2可能参与了多种调控途径。 以VER2基因的cDNA为探针，利用改进的池式PCR以及高密度膜杂交筛选的方法，从小麦TAC基因组文库中获得41,788 bp的基因组克隆，该序列含有11个基因，其中VER2基因位于第三个基因。VER2基因组序列含有3个内含子，4个外显子与cDNA序列100%同源。通过对转录起始点和转录终止点的分析，进一步证明从cDNA文库筛选得到的VER2基因为全长序列。 对VER2基因的上游启动子区域进行分析，发现基因上游启动子区存在三个小的重复序列，每个片段有482 bp，另有两个较大的重复序列，每个片段有2,161 bp。对上游2.8 kb启动子区（不含重复序列）的响应元件分析，其包括ABA响应元件（ABRE）、茉莉酸甲酯响应元件（Me-JARE）、胚乳特异性表达元件、参与淀粉酶合成的元件以及存在类似GA响应元件（ATAACAAAC）如ATAACATAC等等。根据VER2基因上游6 kb序列结构特点，将VER2启动子区域进行缺失突变形成10个片段，分别以GUS和GFP为报告基因构建成瞬间表达载体和植物表达载体等四类质粒。通过基因枪方法将最大片段（6 kb）驱动GFP报告基因的瞬间表达载体转入经春化处理或未春化处理的小麦幼叶中，结果发现GFP在春化处理的幼叶中表达，而在未春化处理的幼叶中不表达，说明VER2基因的启动子驱动基因转录受春化处理调控。 二、 小麦矮化突变体的研究 通过对小麦矮化突变体gaid遗传生理分析发现该突变体为半显性阻断GA信号途径，由此发现在赤霉素信号途径中，α-淀粉酶的诱导一定程度上通过某些与株高相关的基因控制。突变体gaid呈现对高浓度的脱落酸更敏感，当ABA浓度达到10-6M时，突变体的生长几乎完全受到了抑制，而野生型的生长需要ABA浓度达到10-5M时才能完全受到抑制。通过突变体gaid对乙烯等抑制型生长调节剂的响应实验研究，首次提出GA调控植物伸长生长存在两条信号途径，即GA基础水平信号途径（GA basal level signaling pathway）和GA正常水平信号途径（GA normal level signaling pathway），而乙烯以及高浓的GA合成抑制剂（如PAC）是通过第一条途径（GA基础水平信号途径）起作用。光形态建成中对植株生长的抑制作用存在独立于GA的信号途径。 突变体gaid的根系在强光照（63.5 Es-1m-2）和培养基内（低氧）的生长条件下，表现出弯曲、变短、加粗等异常性状，而随光照强度的减弱，这种根系异常生长的表型也减弱，在暗培养中则完全消失，但无论在哪种环境条件下，相对野生型对照而言，突变体的种子根短、侧根少。低浓度的ABA（10-8M）可以恢复突变体gaid根系在强光低氧条件下的正常生长发育。然而利用IAA及其极性运输的抑制剂（TIBA）、乙烯生物合成前提物（ACC）及合成抑制剂（AOA）处理突变体gaid，并没有发现突变体根系的生长发育得到恢复。 突变体gaid可能是一个新的属于小麦GA信号途径中的负调控基因（GAID）发生了突变或超表达，导致其负调控作用增强，呈现半显性的矮化突变。在与另一已知小麦GA信号途径中的负调控基因RHT的关系研究上发现，GAID可能对RHT蛋白磷酸化后的降解途径起抑制作用。通过双向电泳发现突变体gaid与野生型对照（京冬1号）在生长过程中存在差异蛋白，这将有助于对GA信号途径分子机理的深入研究。

固氮菌突变种DJ35钼铁蛋白和UW3细菌铁蛋白的纯化、特性、晶体生长及鉴定

一、棕色固氮菌突变种DJ35固氮酶钼铁蛋白的纯化、体外重组及结晶研究 　　棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ35的菌体破碎后，所得的未经加热的粗提物经DEAE Cellulose 52柱层析后得到部分纯的钼铁蛋白（ΔnifE Av1）和铁蛋白(Av2)。部分纯的ΔnifE Av1再经Sephacryl S-300和Q-Sepharose Fast Flow柱层析进一步纯化，便首次得到SDS凝胶电泳检测为基本纯的ΔnifE Av1。SDS-PAGE及Western blotting的结果表明，ΔnifE Av1具有与野生型棕色固氮菌钼铁蛋白(OP Av1)相同的亚基种类和组成（α2β2）。质子还原活性测定表明，在与Av2进行活性互补时ΔnifE Av1不具有明显的质子还原活性，而与从OP Av1抽提出的FeMoco抽提液保温后便可与Av2实现活性互补。这表明，ΔnifE Av1是一种缺失FeMoco的钼铁蛋白。 　　将ΔnifE Av1用过量的邻菲啰啉(o-phenanthroline)厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，便得到部分丢失Fe的ΔnifE Av1©。在同时存在Av2和MgATP发生系统的条件下，ΔnifE Av1©, 而不是处理前的ΔnifE Av1，可为由KMnO4或Na2CrO4、高柠檬酸铁、Na2S、Na2S2O4 和二硫苏糖醇组成的含Mn或含Cr重组液(RS-Mn或RS-Cr)显著激活，但在缺少MgATP或Av2的条件下，RS-Mn和RS-Cr则不能激活ΔnifE Av1©。这就表明，RS-Mn和RS-Cr对ΔnifE Av1©的激活都需要邻菲啰啉的预处理及Av2和MgATP的同时存在。从分别缺失nifZ和nifB点突变的固氮菌突变种DJ194和UW45中纯化得到的钼铁蛋白，ΔnifZ Av1和NifB- Av1，经邻菲啰啉厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，也分别得到部分丢失Fe的ΔnifZ Av1©和NifB- Av1©。与ΔnifE Av1©一样，这两种蛋白在Av2和MgATP同时存在时也可被RS-Cr和含Mo重组液（RS-Mo）明显激活。 　　为获得可供X-射线衍射的ΔnifE Av1的大单晶，对组成蛋白质沉淀剂的各种化合物的种类和浓度、缓冲液的pH值、结晶方法及蛋白样品的批次、浓度等结晶条件进行了大量优化研究。首次获得了ΔnifE Av1的深棕色短斜四棱柱晶体，并对其蛋白组成进行了鉴定。 二、铬铁蛋白中残存的棕色固氮菌细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定 　　从无钼、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白。在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现，棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现。SDS-和厌氧天然-PAGE皆表明，棕色晶体主要由与Av1类似大小的亚基（~60 kD）组成，而砖红色晶体则主要由~20 kD亚基组成。Western-blotting表明只有~60 kD亚基可与OP Av1的抗体发生反应，而~20 kD亚基则无这种反应。在部分纯的CrFe蛋白中，~20 kD的蛋白含量远低于~60 kD蛋白的含量，表明由这种小亚基组成的蛋白只是CrFe蛋白中的一种污染蛋白。用3,5-二氨基苯甲酸染色的天然电泳表明，形成砖红色和棕色晶体的蛋白是迁移率不同的两种含铁蛋白。质谱分析表明，该晶体蛋白为棕色固氮菌的细菌铁蛋白（AvBF）。分辨率为2.34 Å的X-射线衍射结果也表明，砖红色晶体属于H3空间群，晶胞参数为a = 124.965 Å, b= 124.965 Å 和 c = 287.406 Å。首次完成的结构解析也表明，这种砖红色晶体确为24聚体的AvBF。 关键词：棕色固氮菌突变种DJ35和UW3; ΔnifE Av1; 铬铁蛋白; 细菌铁蛋白; 纯化和特性; 体外激活组装; 晶体生长及组成鉴定

含铬或锰的新型固氮酶的纯化, 特性和结晶—棕色固氮菌突变种UW3中CrFe蛋白和MnFe蛋白的研究

以含MnSO4或Na2CrO4的无钼无氨的修改Burk’s培养基， 培养不能合成含钼固氮酶体系的棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii Lipmann) 突变种UW3， 发现在一定浓度范围内， MnSO4或Na2CrO4的加入有助于促进其生长。 菌体生长和C2H2还原活性曲线测定结果表明， 这种促进作用很可能是通过Mn或Cr取代Mo， 参与组装固氮酶中心原子簇， 从而影响固氮活性而实现的。 利用阴离子交换 (DEAE-52和Q-Sepharose FF) 和凝胶过滤 (Sephacryl S-200) 柱层析从两种菌体中纯化得到固氮酶组分Ⅰ蛋白 (分别命名为MnFe蛋白和CrFe蛋白)， 并对其进行了特性研究。 厌氧天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 和SDS-PAGE结果显示， 两种蛋白均为两种亚基组成的四聚体。 亚基可以与OP MoFe蛋白抗体发生免疫反应， 分子量分别略小于野生种OP MoFe蛋白的α和β亚基。 CrFe蛋白的C2H2还原活性， Ar下放氢活性和固氮活性分别相当于OP MoFe蛋白的36%， 38%和43%， 而MnFe蛋白活性相当于OP MoFe蛋白的50%左右， 并且两种蛋白与OP MoFe蛋白具有相似的固氮电子利用率。 对两种蛋白金属含量的测定证实其中分别含有Mn和Cr， 但仍存在少量Mo污染。 与OP MoFe蛋白相比，这两种蛋白圆二色谱的摩尔椭圆率 ([θ]) 除在450nm较接近外，在可见光区的其它波长处均显著降低。 与DT还原OP MoFe蛋白相似， CrFe蛋白和MnFe蛋白具有g≈4。3、3。7和2。0的特征EPR信号， 但各处信号强度比例不同。 在对污染Mo可能引起的信号进行校正后，CrFe蛋白的三个信号强度分别相当于DT还原OP MoFe蛋白的20%， 0%和10%， 而MnFe蛋白则分别相当于112%， 49%和65%。 上述结果表明， CrFe蛋白和MnFe蛋白与OP MoFe蛋白金属原子簇的主要差异很可能在于FeMco (M=Cr， Mn或Mo)的M种类， 而P-cluster结构和组成均未见大的差异。 利用气相扩散悬滴法对MnFe蛋白和CrFe蛋白结晶条件进行了筛选和初步优化， 确定了以Tris/Hepes， NaCl， MgCl2和PEG 8000为主要变量的沉淀剂体系， 寻找各组分对于晶体生长的最适浓度。 以此为基础探讨了应用气相扩散坐滴法和液-液扩散法对两种蛋白结晶条件的优化。 在一定条件下， 两种蛋白分别通过液-液扩散法获得了优质大单晶。 对从CrFe蛋白和MnFe蛋白制备物中培养出的蛋白质晶体的SDS-PAGE鉴定显示， 晶体由与OP MoFe蛋白相似的两种亚基组成。 通过 “神舟三号” 飞船搭载实验探讨了空间微重力对于厌氧蛋白质结晶的影响， 结果表明， 微重力有助于避免孪晶形成， 并具有长期培养后获得适于进行X-射线衍射分析的优质大单晶的潜在前景。 结合空间科学使固氮酶结构与功能研究得以发展， 这项工作是有意义并且可行的。

缺失nifZ的棕色固氮菌突变株DJ194的钼铁蛋白研究—纯化、结晶及金属簇的组成与分布

从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE－52、Sephacryl S－200及Q－Sepharose等柱厌氧层析，分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Av1）制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZ Av1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白：属于热激蛋白60家族（Hsp 60 family）成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶（6-Phosphate Glucose Isomerase，PGI）及棕色固氮菌细菌铁蛋白（Bacterioferritin，Bfr）。初步鉴定表明，它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体，62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZ Av1蛋白，但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZ Av1亚基具有相似的迁移率，互相重叠，从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZ Av1纯度;而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZ Av1，但往往会在ΔnifZ Av1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来,从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰（Zhao等，2004）。 通过Sephacryl S－200柱洗脱峰收集精度的调整及Q－Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱，得到了纯度大于90%的ΔnifZ Av1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍（Western blotting），以及SDS-变性凝胶电泳显出，ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白（OP Av1）相似，表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZ Av1的α2β2四聚体构成。ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号（g≈4.3, 3.65和2.01）和520-660 nm附近的圆二色摩尔消光系数（Δε）也都与OP Av1较相似，从而表明ΔnifZ Av1含有与OP Av1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而，ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物（C2H2、H+和N2）的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46-50%;而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OP Av1。此外，与OP Av1相同的ΔnifZ Av1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-tagged ΔnifZ Av1（Hu等，2004）的信号明显不同。这就表明，ΔnifZ Av1与OP Av1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态，也不在于P-cluster的结构和氧还状态，而仅在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少（约一半）。据此推测出与国外提出的His-tagged ΔnifZ Av1模型不同的ΔnifZ Av1(DJ194)的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster，而另一个αβ亚基对只含FeMoco，其P-cluster区域则是空的。由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中两个P-cluster中的一个不能组装，因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响。根据Lee等（1998）对nifZ产物（NifZ）和nifW产物（NifW）可以形成[NifWx-NifZy]多聚体，并可能是通过同一途径来影响固氮酶的合成的研究，提出NifZ的如下的可能作用机理。[NifWx-NifZy]多聚体影响与P-cluster合成相关的金属簇(如[4Fe-4S])的进入和P-cluster的最终合成，而其中的一个αβ对上的P-cluster的形成可能较多的受到NifZ的影响;nifZ的某些突变或缺失虽然不影响[NifWx-NifZy]多聚体的形成，但对于更依赖于NifZ的那个αβ对上的P-cluster的合成可能会产生不同的影响。 对这一高纯度的ΔnifZ Av1制备物结晶的研究表明，使用Tris缓冲系统的25%PEG 6K/MgCl2晶体培养液可以在较短的晶体培养时间内得到较大的晶体;在一定条件下，pH为7.5和8.3的培养液对出晶数和晶体大小的影响不明显;PEG 6K的浓度与MgCl2的浓度对出晶大小的影响有一定的相关性，即较低的PEG浓度在较低的MgCl2浓度下和较高的PEG浓度搭配较高的MgCl2浓度较易长出较大的晶体。虽然ΔnifZ Av1制备物的纯度达到90%以上，并且在染铁实验中表明其基本不含细菌铁蛋白，但我们在对得到的晶体进行电泳鉴定中仍然发现了一种与以前报导的砖红色晶体不同的深棕红色的细菌铁蛋白晶体，之所以颜色不同可能和所含的铁元素的氧化状态有关。不过在所鉴定的5支结晶管中只在一个管内发现了与固氮酶晶体同时存在的这种细菌铁蛋白晶体，说明通过蛋白纯度的提高减少细菌铁蛋白的含量以及晶体培养条件的优化，细菌铁蛋白晶体形成的几率就可大大降低。

MADS-box基因在单子叶植物花发育中的功能研究

第一部分 水稻E类MADS-box 基因在花发育中的功能分析 MADS-box 基因是一个大的转录因子家族，在花发育过程中起重要作用。根据对双子叶模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛遗传突变体的研究，提出了花发育的ABCDE模型。该模型认为：A、B、C、D、E代表了5类功能不同的花器官特征基因，单独或联合控制花器官的发育。A类基因控制萼片的发育;A、B和E类基因控制花瓣的发育;B、C和E类基因控制雄蕊的发育;C和E类基因控制心皮的发育;D类基因控制胚珠的发育;A和C类基因相互抑制。在这5类基因中，E类基因的功能较为复杂，它不仅是花器官特征基因，而且具有花分生组织决定性（Floral meristem determinency）。在单子叶植物中，E类基因的功能发生了很大的分化。水稻是单子叶植物的模式植物，水稻中至少有5个E类基因，分别是OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34，在这5个E类基因中，除了对OsMADS1基因有较深入的研究外，对其它几个E类基因的功能了解甚少。我们在现有的研究基础上，根据对双子叶植物中E类基因的研究结果，以OsMADS8基因为出发点，利用组织原位杂交，RNAi技术对水稻中的E类基因进行了深入的研究。结果表明：OsMADS8/7基因早在花序枝梗分生组织原基就有转录，随着小穗的生长发育，逐渐集中在小穗分生组织原基，小花分生组织原基，浆片、雄蕊和心皮中表达;在胚珠形成时，内外珠被有很强的杂交信号，而且在幼胚和胚乳中也有表达。OsMADS5在幼花时期，四轮花器官均有表达，在小穗发育后期及受精后的表达方式与OsMADS8/7基因相同。OsMADS8基因被抑制后，转基因植株没有任何表型变化，说明很可能有其它E类基因弥补了OsMADS8基因的功能缺失;当同时抑制其它E类基因的表达时，转基因植株抽穗期明显延长，四轮花器官的发育均受到影响：稃片类似叶片状;浆片转变为稃片类的结构;雄蕊没有花粉;心皮具有了稃片的特点;没有胚珠结构的形成，同时失去了花分生组织决定性，在心皮的部位产生了新的花器官或花分生组织逆转为花序分生组织。说明水稻四轮花器官及胚珠的正常发育需要E类基因的参与，但其功能与双子叶植物如拟南芥，西红柿、矮牵牛等直系同源基因相比已经发生变化;水稻中的E类基因在维持花分生组织特征性方面起重要作用;另外对抽穗期有影响。 第二部分 玉米MADS-box基因ZAG2转录调控区的研究 基因的时空表达受基因中的顺式作用元件及其反式作用因子调控。顺式作用元件由位于基因编码区上游的启动子区域和位置不确定的增强子区域组成。顺式作用元件对基因表达的开启至关重要。MADS-box 基因编码一类控制花器官发育的转录因子，在花的发育过程中顺序表达。MADS-box 基因突变，花器官发生同源异型转换。研究MADS-box 基因的调控序列可以进一步揭示影响基因时空表达的内外因素。ZAG2是玉米MADS-box 基因中的D类基因，控制胚珠的发育，在胚珠和心皮的内表面特异表达。ZAG2基因有7个外显子和6个内含子。我们从玉米基因组分离到了ZAG2基因翻译起始点上游3040bp的序列，并利用5’-RACE方法鉴定出了转录起始点的位置。序列比较发现，在 5’-UTR内有一个1299bp的内含子，这个内含子可能对基因的表达有调控作用，因此构建了两个与GUS基因融合的表达载体：一个是pZAG2-1::GUS，包括翻译起始点以上所有的调控序列;另一个是pZAG2-2::GUS，去掉了5’-UTR中的内含子序列，转化水稻。结果这两个构建都没有使GUS基因在正确的位置表达。pZAG2-1::GUS构建在心皮基部类似花托的部位及稃片顶端着色，pZAG2-2::GUS构建在内外稃片沿稃脉的部位有很强的着色，说明翻译起始点上游的调控序列不足以使基因正常表达。两个构建着色方式不同，可能pZAG2-1::GUS构建在5’-UTR部分含有抑制ZAG2基因在稃片表达的顺式元件，或者启用了在5’-UTR中的转录起始点，因为在5’-UTR的内含子中也有一个很典型的TATA-box。我们推测，在ZAG2基因编码区的第一内含子可能存在另外一些使基因正常表达的增强元件，需要进一步的序列缺失实验加以验证。

拟南芥功能获得突变体sef的研究

植物顶端分生组织中干细胞数量的维持对于侧生器官的发生至关重要。在干细胞的基因调控网络中WUSCHEL (WUS) 是一个关键成员，围绕该基因形成两个反馈调节环，控制分生组织中干细胞群的平衡。 　　论文分析了用激活标签法 (activation tagging) 获得的突变体sef (stem-ecotopic-flowers)，其最大的表型特点是花序轴上产生异位花和幼苗下胚轴增长。本论文就此两个表型产生的机理进行了探索，以期了解WUS基因的新功能。 　　对sef的表型观察发现异位分生组织不仅在花序轴上出现，而且也出现在叶柄、叶片、托叶叶腋内、花梗、花梗腋内以及花器官上。组织切片结果表明花序轴上的异位分生组织起源于已经分化的皮层细胞。对突变体的分子鉴定证明T-DNA是以单拷贝插入到WUS起始密码子上游810 bp处。对插入位点上下游各10 kb的4个基因在花序轴中的表达水平进行了分析，结果表明只有WUS基因的表达量升高，说明增强子只对WUS基因发挥了激活作用，暗示了WUS基因过表达与异位花之间存在某种联系。转35S::WUS的拟南芥幼苗下胚轴与根部出现异位的生长点;WUS被诱导表达的突变体pga6-1花序轴上出现异位花芽，证实sef的表型是由WUS超表达所导致。利用组织原位杂交和RT-PCR分析了WUS、CLAVATA3 (CLV3)、LEAFY (LFY) 与AGAMOUS (AG) 在异位分生组织中的表达模式与表达水平，结果表明WUS、CLV3、LFY、AG在花序轴表皮以下皮层中异位表达。这些结果表明WUS能激活CLV3异位表达，从而在已经分化的皮层中重新产生具有分生组织特征的细胞，同时WUS异位激活AG的表达并使LFY也在这些异位的分生组织中表达，这些分生组织发育方向被LFY与AG所决定，最终发育为异位花器官。 　　sef突变体另外一个突出的表型是幼苗的下胚轴增长。对幼苗期下胚轴以及胚胎4个时期的胚干细胞数进行统计，结果表明下胚轴与胚干细胞数目都呈现出sef比野生型多而wus-1比野生型少的趋势，因此sef幼苗下胚轴增长是由于细胞数目改变引起的。进一步分析发现这种区别是由于胚胎早期（授粉后1~3天）胚干细胞分裂速率的差异所造成的。利用基因芯片杂交分析突变体的基因表达谱，结果发现许多与细胞分裂相关的基因在sef中表达水平升高。RT-PCR证实这些基因在胚胎时期的表达水平升高，说明胚胎早期胚干细胞分裂速率的不同导致了幼苗下胚轴的异常。 　　综上所述，我们的研究结果揭示了sef异常表型的产生的可能机制。在已经分化的皮层中激活标签介导的WUS超表达激活干细胞标志基因之一CLV3和花器官基因AG，并使LFY异位表达，重新产生具有分生组织特征的细胞，这些分生组织的发育方向被LFY和AG所决定，最终发育为异位花。在sef的早期胚胎中，WUS表达增强使细胞分裂相关基因表达水平升高、细胞分裂增快，说明WUS与细胞周期相关基因的调控存在某些联系。 　　本论文的创新之处在于首次提出WUS表达增强能在分化的组织中产生具有分生组织特征的细胞以及WUS调控细胞分裂的结论。 　　

油菜素内酯对脯氨酸积累的影响

环境胁迫诱导的脯氨酸积累是植物一种非常显著的代谢适应机制。和其他胁迫应答反应一样，脯氨酸积累也受到各种植物激素和信号分子的调控，如脱落酸、钙离子等。本论文的研究目的在于了解植物激素油菜素内酯（BR）在拟南芥脯氨酸积累中的作用。 首先，我们发现拟南芥经不同浓度的24-表油菜素内酯（EBL）预处理后，200mM NaCl诱导的脯氨酸积累受到不同程度的抑制。同时脯氨酸合成途径的关键基因P5CS1以及OAT的诱导表达减弱，降解途径的关键酶基因PDH1的转录水平有所上调，说明脯氨酸积累程度的降低是相关基因表达的调控的结果。BR缺陷型突变体det2-1和不敏感突变体bin2-1在盐胁迫下的脯氨酸积累均高于野生型，而且det2-1的P5CS1受到的诱导增加，PDH1的表达有所下调。说明BR在脯氨酸积累中起负调控的作用。 经不同浓度的24-EBL处理后，50µM ABA诱导的脯氨酸积累受到明显抑制。det2-1和bin2-1在ABA处理下脯氨酸积累均高于野生型，但是ABA不敏感突变体abi1-1在盐胁迫下的脯氨酸积累并没有受到BR的抑制。说明BR可以特异地抑制由ABA介导的脯氨酸积累，而对不依赖ABA途径介导的脯氨酸积累没有明显影响。但是，BR处理后并没有改变ABA诱导的P5CS1的转录水平。 上述BR对脯氨酸的抑制作用是在短日照（8小时光照）条件下得到的，而在长日照（16小时光照）条件下生长和处理材料时，24-EBL对盐胁迫或ABA诱导的脯氨酸积累都略有促进作用。det2-1和bin2-1中的脯氨酸积累仍比野生型高。由以上的结果推测光照增加可以抑制BR对脯氨酸积累的抑制作用。 我们还对det2-1和bin2-1在生长发育各个时期的盐敏感性进行了初步鉴定。det2-1在种子萌发阶段对盐胁迫和ABA超敏感；在幼苗生长阶段det2-1和bin2-1在长势、存活率、根长以及鲜重方面对盐胁迫都比野生型更敏感，外加24-EBL可以部分恢复det2-1的盐敏感性；成株阶段bin2-1则表现出比野生型明显的抗盐性。这些结果表明BR可能对拟南芥盐响应有重要调节作用。

水稻分蘖逆制的可塑性生长发育试验和模型辅助分析: 应用植物生长模型缩减基因型与表现型的间隙

表现型是基因型和环境相互作用的结果，不同环境条件下给定基因型能表达为不同的表型，这是我们所熟知的植物表型可塑性。可塑性一方面帮助植物更好地适应不利环境，但我们也不得不承认可塑性，使得人们难以从表型直接理解基因功能。如今，基因组学快速发展允许解密基因更迅速便捷，甚至发现大量基因。因此，进一步理解可塑性过程的基因背景、理解基因和环境对表型的作用非常必要。由于从基因到表型非线性过程，从而引起基因型和表型差异，期望有效方法或工具能跨越这个横沟。植物生长模型已被开发用来模拟植物响应环境动态关系，并且将参数和环境整合到模型方法中。因此，普遍认为植物生长模型将在探讨复杂可塑性基因功能扮演重要作用。水稻是普遍应用在基因组学和功能基因组学典型的模式植物。水稻分蘖是重要的基因依赖环境敏感的过程，这是农学上非常关注的现象。本文将应用模型方法理解水稻分蘖逆制的可塑性。本研究设计了一个相对优化环境条件下，野生型水稻分蘖逆制试验，该试验有两个处理（1）手工剪切分蘖;（2）一个TDNA突变体，并分别设置对照。本试验在法国国际农业研究发展中心（CIRAD）温室开展，每个试验利用水培方法，培育植株50天左右（营养生长阶段）。在营养生长阶段，定期破坏性测量单个器官的鲜重、干重和单个器官的大小。本文尝试应用两个植物生长模型模拟和解释水稻响应分蘖逆制表型发育。GreenLab是一个植物结构数学模型，已被开发用来模拟植物结构动态和结构功能反馈。植物3D结构决定光捕获和生物产量，然后，生物量分配到新的器官，因此，器官形态结构将发生变化，新阶段的生物量生产将会更新。通过基于最小二乘法的CornerFit软件实现了模型参数优化。另一个模型EcoMeristem，基于作物模型和形态发生概念，用来模拟水稻分生组织活动、器官发生和形态过程等可塑性过程，内部竞争指数Ic主要与环境相关，参数主要描述基因功能。通过植物生长过程模拟与测量的优化，手工提取了模型参数。这两个植物生长模型演示了缩减基因型与表型之间的差距，并实现了水稻响应分蘖完全逆制的可塑性过程。GreenLab模型有一个极好的器官发生基础，但本研究限于单茎拓扑结构。另外，该模型有更长的时间步长，这对描述植物可塑性没有提供足够的分辨能力，这在EcoMeristem模型中得到了解决。很明显，EcoMeristem模型有更弱的结构基础，这可能蕴含了一些可塑性信息的缺失。总体而言，EcoMeristem模型有更专业的可塑性过程、基因环境理解和表达能力。