毛白杨（Populus tomentosa）木质素生物合成相关基因分离与木质素合成调节

木质素是植物体中具重要生物功能的次生代谢产物。然而纸浆生产主要是将原料中的木质素与用于造纸的纤维素分离，该工艺过程产生了造纸工业的主要污染废液，并且增加造纸成本。本研究目的在于利用反义RNA技术，在分子水平调节木质素的生物合成，降低中国特有造纸树种毛白杨的木质素含量，培育更适于我国造纸工业的原料树种。以下为本研究已取得的相关研究进展： 1.通过RT-PCR技术，从毛白杨中克隆了木质素生物合成的三个相关酶的cDNAs，它们分别为咖啡酸甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase，COMT)、咖啡酰CoA甲基转移酶(caffeoyl Co-enzyme A O-methyltransferase，CCoAOMT)及香豆酸：辅酶A连接酶(4-coumarate: CoA ligase，4CL)。序列分析显示了毛白杨这三个基因与杨属中其它种的相应基因cDNA核苷酸序列高度同源。Northern点杂交分析表明，COMT、CCoAOMT及4CL基因在毛白杨正在生长的次生木质部中高水平表达，其表达高峰与树木的木质化进程同步;而在叶与叶柄中，这三个基因均不表达。COMT、CCoAOMT及4CL是木质素生物合成的相关酶，该表达特征与其基因功能相一致。本研究克隆的COMT、CCoAOMT及4CL基因的cDNAs已在GenBank注册登记，接受号分别为AF237777、AF240466、AF314180 (publish on Jan l,2002)。 2.通过一系列的DNA重组，构建了携带反义COMT、CCoAOMT或4CLcDNA的反义表达载体以及同时整合反义COMT与CCoAOMT cDNA的双价反义表达载体，PCR扩增与酶切检测确证构建无误。 3.以田间取材的速生三倍体毛白杨B19、B331及B304的茎尖、叶片与嫩茎为外殖体，首次获得了三倍体毛白杨的组培再生试管苗，并建立了速生三倍体毛白杨的组培再生系统，为通过基因工程改良其造纸性能奠定了基础。 4.农杆菌介导转化烟草，PCR与PCR-Southern检测表明我们获得了整合反义COMT、CCoAOMT cDNA及反义COMT及CCoAOMT cDNA共整合的转基因烟草。以Digoxigenin标记的对应于反义链的单链RNA为探针与转基因烟草的总RNA进行NoIthern点杂交，结果表明整合到其中的反义cDNA均已表达。转基因烟草的木质素分析将有助于对COMT及CCoAOMT两个甲基化酶功能的认识。 5.通过农杆菌介导，将反义CCoAOMT cDNA转入欧洲山杨与银白杨的杂交杨（P tremulaXP.alba）。经PCR，PCR-Southern及Southern检测，确认获得了转基因植株。以Digoxigenin标记的对应于CCoAOMT cDNA反义链的单链RNA为探针与转基因杂交杨总RNA进行Northern点杂交，结果表明整合到其中的反义cDNA已在转录水平表达。测定生长5-6个月的转基因杨树下部茎杆的Klason木质素含量，结果显示其中一个株系的Klason木质素含量比野生型对照下降17.9%，表明抑制杨树内源CCoAOMT基因表达可有效降低转基因植株的木质素含量。