162 resultados para TESA-blot
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A simple, rapid and ultrasensitive colorimetric detection of protein using aptamer-Au nanoparticles (AuNPs) conjugates based on a dot-blot array has been developed, which was combined with the unique optical properties of AuNPs, enabling the visual detection of protein within minutes without any instrument.
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提出了一种新模型来研究由单一物质构成的液层在其纯蒸气中的蒸发.液层置于微重力环境中并且受到水平方向温度梯度的作用,液层的热毛细对流和蒸发耦合在一起,使得气液界面的传热传质规律更加复杂.用理论分析的方法求解了不考虑热毛细效应的纯蒸发模型,得出温度场分布和界面质量流量的解析表达式.对于热毛细对流和蒸发耦合情况,采用有限差分的投影算法同时求解Navier-Stokes方程和能量方程,得到了不同蒸发Blot数和Marangoni数下流场和温度场的稳态数值解.论述了蒸发Biot数和Marangoni数对界面传热传质的影响,提出并解释了蒸发和热毛细对流耦合的三种模式.
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为实现对特定生物分子的高灵敏度快速检测与分析。采用上转换发光材料作为标记物,研制成功一台基于上转换发光技术的新型光学免疫生物传感器。该传感器利用上转换发光材料在红外光激发下发射可见磷光的特性,通过对免疫层析试纸条上经生物反应而结合上去的上转换发光材料颗粒的含量进行检测,计算出被测样品中特定生物分子的浓度。实验结果表明,该传感器具有较好的生物特异性,对兔抗鼠疫免疫球蛋白(IgG)标准样品的检测灵敏度达到ng/ml量级,并在200~6000ng/ml浓度范围内具有良好的线性响应特性,相关系数R^2≥0.95;
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本文以普通田菁(S•cannabina)材科。用Western Blot双向凝胶电泳等技术对其根瘤特异性蛋白进行了研瓜并分离纯化了其中含量最而的豆血红蛋白。对其理化性质进行了分板。主要结果如下: 1、应用DE—52离子交换柱层析及制备型聚丙稀酰胺凝胶电泳分离纯化了豆血红蛋白。从DE—52洗脱液中得到五个组分。每个组分都为单体,其中组分1、2、3、分子量为14.5KD,组分4、5为16 KD。 2、分析了组分2的氨基酸组成,与共它豆科植物豆血红蛋白相似,有较多的酸性氨基酸。不同的是。普通田菁豆血红蛋白含有蛋氨酸光谱分析表明还原态田普豆血红蛋白在427nm有一强吸收。当氧化为氧化态时。基吸收蜂发生迁移。为417nm。 3。普通田普豆血红蛋白抗体可以与大豆。绿豆,豌豆,苕子。乌豇豆根据豆血红蛋白发生免疫交叉反应。说明豆血红蛋白在不同豆科植物间有很高的保守性。 4、用单向SDS—PAGE及其Western Blot分析。观察到了九种根瘤特异性蛋白。共分子量分别为14.5KD。16KD21KD, 27 KD,35KD, 45 KID,47 K ,52KD,92KD,它们在根瘤中的诱导产生均在固氮酶活性出现以前。 5、双向电泳比较发现了十八个根瘤特异性蛋白点,分子量从14.5KD—92 KD不等。其中14.5KD三个点。16K D二个点(分别组代表豆血红蛋白五个不同组分)。45KD一个点,92K D一个点的含量较高
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植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola 19-1)是从新疆鄯善地区玉米根际分离得到的一株联合固氮菌。在40℃高温下有较强的乙炔还原活性。 本工作利用Southern Blot分子杂交技术, 以Klebsiella pneumoniae的nifA为探针,证明了在K.planticola 19-1中存在nifA-like基因,由nifH-lacZ实验推论其nifA-like基因产物对高温相对稳定。经过大质粒电泳和Southern Blot分子杂交,发现nifA-like基因定位于染色体外的大质粒上。本工作进一步克隆了含有K.plonticola 19-1的nifA-like基因的DNA片段,做了它的限制性酶切图谱,并将nifA-like基因初步定位。
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从4-5天龄青花菜(Brassica oleracea var.italica)下胚轴游离原生质体,经纯化后培养在简化的KMsP培养基上,原生质体分裂形成了细胞团;同时,对影响外源DNA导入子叶和下胚轴原生质体后瞬间表达强度的若干因素作了较详细的研究,这些因素包括转化介质中二价阳离子的种类和浓度、PEG溶液的浓度以及PEG溶液的pH值, 为进一步进行原生质体水平上的细胞遗传转化创造了条件。 以青花菜(Brassica oleracea var.italica)子叶和下胚轴为外植体材料,进行了根癌农杆菌介导的遗传转化研究。在建立了子叶和下胚轴外植体组织培养的高频率植株再生系统的基础上,用携带有双元载体质粒的根癌农杆菌(Asrobacterium,tumefaciens)A208sE感染青花菜子叶和下胚轴,对根癌农杆菌的感染过程以及影响抗性芽分化频率的诸多因素作了详细研究,再生了具有卡那霉素抗性的完整转化植株。Dot Blot分析表明NPTⅡ酶活性的存在;以pROA93经EcoRI /HindⅢ酶切产生的gus基因片段(约2.6Kb)为探针进行Southern Blot分子杂交,结果表明gus基因已整合到植物细胞基因组中,并且得到了表达。
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利用聚合酶链式反应(PCR)技术从Alcaligenes eutrophus H16染色体DNA中扩增并克隆了调控聚-3-羟基丁酸(poly-3-hydroxy-butyrate,PHB)生物合成的两个关键酶基因:依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)和PHB合成酶基因(phbC)。限制性内切酶图谱和核苷酸序列分析证实了克隆结果,并表明克隆的基因与国外所报道的有很高的同源性。经过基因拼接,构建了块茎特异性表达的高等植物表达载体pPSAGB(嵌合phbB)、pBIBGC(嵌合phbC)和pPSAGCB(嵌合phbB和phbC)。并以试管薯(microtuber)为外植体经Agrobacterium介导转化了虎头、京丰、Bintje、Favorita、高原4号和88-5共6个马铃薯品种,获得49个株系。经PCR检测导入phbB的株系共有44个,对其中30个株系进行DNA dot blot分析,结果表明phbC导入呈阳性的株系有20个。深入的鉴定工作还在进行中。
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本文以光敏色素A (phyA)的特异性基因片段RPA3为探针,利用RNA斑点杂交的方法对光敏核不育水稻农垦58S及对照农垦58叶片中phyA mRNA的丰度进行了分析。结果显示:在育性转换敏感期,光周期处理O天时,农垦58S (NK 58S) phyA mR-NA的丰度比农垦58 (NK 58) phyA mRNA的高。光周期处理5天(雌雄蕊原基形成期)及10天(花粉母细胞形成期)时,短日照条件下(SD),NK 58S phyA mRNA的丰度均比NK58高。进一步比较3天龄NK58S及NK58黄化苗中phyA基因表达的差异,发现NK58S phyA mRNA的丰度比NK58高,并且两品种均符合黄化苗中phyA对其mRNA丰度的负调控作用。这一结果进一步证实:甲基化水平低的NK58S phyA基因比NK58 phyA基因更活跃地表达,进而导致转录水平与翻译水平上的差异,最终参与调节NK 58S的育性转换。 另外,通过持续远红光和红光照射黄化水稻幼苗诱导叶绿素合成的实验,分析了NK58S与NK58之间光敏色素生物功能的差异。持续远红光高辐照度反应(FR-HIR)由phyA负责调节,持续红光高辐照度反应(R-HIR)由phyB负责调节。实验结果显示:持续FR使NK58S与NK58合成叶绿素的含量在12 h时达到最高,并且NK58中叶绿素合成的相对效应比NK585高。持续R使NK58S及NK58中叶绿素的含量在24小时连续处理下持续增加,而且在此时间进程中,NK58中叶绿素合成的相对效应也都比NK58S高。这些结果说明在NK58S和NK58中phyA和phyB均参与了叶绿素合成的调节,并且phyA,phyB在NK58S和NK58黄化苗转绿过程中的作用存在差异。
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直到九十年代,以利用拟南芥菜和金鱼草突变体克隆到花器官发育基因为重要标志的植物发育研究取得了重大突破。但由于开花决定过程分子控制机理研究进展却较为缓慢。以mRNA人手利用差异筛选技术获得春化相关基因克隆(verc203,verc17),Northem blot初步证明这些克隆对春化处理的特异性。根据反义RNA理论和技术对克隆化verc203基因功能进行研究。另外,从纯化蛋白人手,在金针菇中克隆到新的溶血性毒蛋白编码基因,并在细菌中得到表达,这一实验为利用此途径来克隆发育调控蛋白的编码基因进行了有益的技术路线探索。本研究的具体结果如下: 1. 春化相关基因(verc203)对冬小麦花发育调控 根据反义RNA的理论和技术进一步证明verc203在冬小麦开花启动和花发育过程中的可能控制作用。将verc203 DNA序列插入带有CaMV35S启动子和GUS基因的pBI221表达载体, 使之能在植物中高效表达反义RNA,并以转正义基因植株作为对照。通过花粉管途径转基因方法,得到326粒反义质粒冬小麦转化种子和1 98粒正义质粒冬小麦转化种子.所有转化处理种子和正常小麦种子萌发后,经春化处理,与未春化冬小麦植株一起培养直到对照植株达到成熟期。实验观察发现,转反义基因植株的抽穗受到明显的阻抑,开花过程大大推迟。其中表达较强的6株转基因植株甚至晚花五十多天。还发现一些表达较弱的植株尽管晚花20到30天,但花器官发育却受到影响,如,雄蕊缺失,穗发育异常等。Southemblot和PCR实验结果表明外源基因整合到转基因植株基因组。 Northrenblot以及报告基因(GUS)活性等实验证明反义基因在转反义基因植株RNA水平上得到高效表达。同时,GUS基因在蛋白质水平上得到表达。基于上述实验,有理由认为ver203基因可能是控制冬小麦春化诱导的成花启动和花发育过程中的主要基因之一。 2. 金针菇毒蛋白flammutoxin编码基因的克隆及其在细菌中的表达 利用色谱分离技术及SDS.PAGE电泳技术从金针菇(Flammuleina velutips)分离得到一种分子量为31 kDa、对人血红细胞具有溶血活性的蛋白质(flammutoxin),通过蛋白质序列微量分析技术测得其N-端3 1个氨基酸顺序。利用氨基酸序列推测其编码基因序列信息,通过RT - PCR克隆到一个由973个核苷酸组成的编码基因,5’端93个核苷酸编码肽链序列与测得flammutoxin N-端氨基酸序列完全相同。基因序列同源性分析表明在GenBank (USA),EMBL Database (Europe)和DDBJ (Japan)基因序列数据库中未找到与之同源的基因序列。这个基因与载体p-半乳糖苷酶部分基因编码的融合蛋白在E coli细胞中有效地得到表达。表达产物的SDS-PAGE,Western blot和溶血活性实验表明它是flammutoxin蛋白原编码基因。并对融合蛋白的溶血活性降低原因作了讨论。
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谷子是我国北方具有区域重要性的禾谷类粮食作物。谷子的体细胞无性系变异和外源基因转化相对其它作物研究较少。本研究利用谷子生产的育种中应用的多个优良品种为材料,分析了谷子体细无性系变异发生的影响因素、变异性和频率、DNA分子水平变异和育种应用等问题;采用基因枪法和花粉管通道法,进行了谷子抗除草剂基因转化研究。 主要结果包括: 1. 通过几种外植体的愈伤组织诱导分析,找到了小花分化期前后的谷子幼穗是愈伤组织诱导的最好外植体.提出谷子愈伤组织可按生长状态和结构划分为质密型、松软型和松散型三种基本类型的观点。前两种为胚性愈伤组织并可相互转换,松软型愈伤组织生长状态稳定,可塑性好,是继代培养和因基化的首选类型。供试品种中豫谷1号、高39、郑407和矮宁黄为易培养品种,矮88、豫谷2号、系238、冀14号、C445和青丰谷为相对难培养品种。这些结果为谷子组织培养和生物技术操作提供了基础资料。 2. 首次对多个谷子品种较大群体的无性系变异进行了分析。结果表明,以R_2株系为单位的谷子体细胞无性系表现型变异频率平均为13.0%,不同基因型的变幅为4.3~32.9%;变异涉及株高、抽穗期、穗粒重、出谷率、叶鞘色、育性、抗病性、米色、穗型等多个性状,多数变异为株高和抽穗期等数量性状,少数为矮秆等质量性状:变异的性状多数能在R_3稳定并遗传给后代。从谷子体细胞无性系变异中选出了一批农艺性状得到改良的新品系,其中系103已进入省区域试验,并提供给多家育种单位作为亲本应用。 3. 将RAPD分析技术引入谷子体细胞无性系变异研究。豫谷2号无性系的RAPD多态性变化既有亲本带的缺失,也有新带的产生。用RAPD多态性变化的SMC值度量无性系同亲本相比DNA水平变异的大小,表现型发生变异的无性系,其SMC值分别为0.905~1.0;表现型未发生变异的无性系,RAPD多态性也可能发生变化,其SMC值分布为0.953~1.0。 4. 通过Gus基因瞬时表达单位数的比较,优化了JQ-700基因枪转化谷子松型愈伤组织的操作参数:质粒DNA用量3μg/mg钨粉,CaCl_2农度1.5M,亚精胺浓度40mM,样品室高度7cm,粗弹头为微弹载体,每皿愈伤组织用量1~2g,每次轰击钨粉用量50μg,轰击前4小时和轰击后16~20小时,用含蔗糖150g/l的高渗培养基处理。利用该技术体系,以bar基因为目的基因转化豫谷2号愈伤组织。经选择培养和植株再生,首次获得了抗0.1% bialaphos的正常可育植株,经PCR和Southern blot分析,bar基因已整合到转化体的基因组中,为创造抗除草剂的谷子新种质提供了材料和技术基础。 5. 研究了花粉管通道法转化和花粉介导的基因枪转化谷子的可行性。花粉管通道法转化后代中,获得了抗0.1% bialaphos的抗性植株,经X-gluc组织化学检测,抗性植株叶片的Gus反应为阳性。初步说明该植株可能为转化体,在谷子上为花粉管通道法转化的可行性提供了佐证。花粉介导的基因枪转化未获得转化体。 本文对体细胞无性系变异形成的原因和应用、无性系变异的分子生物学分析、以及谷子的外源基因转化方法等问题进行了讨论。
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聚-β-羟基链烷酸(PHA)是许多微生物作为碳源、能源的一类贮藏性聚酯,具有广泛的应用价值。该聚酯可被微生物完全降解且有与塑料相似的性质,因而研究并提高PHA在植物中的合成为解决环境污染提供了新的解决途径。 聚-β-羟基于酸酯(PHB)是研究的最早、研究的最清楚的一种PHA。用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)中合成PHB的一个关键酶——3-酮硫裂解酶基因phbA。DNA序列分析表明所克隆的基因与国外报道序列同源性很高,只有一个碱基对的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率,构建了带有导肽基因的组成型表达载体,由根癌农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38)得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明导肽可以将外源蛋白定位于质体,phbA基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实了转基因烟草中phbA编码的3-酮硫裂解酶可以催化乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。 将携有导肽序列的phbC(编码PHB合酶)和phbB(编码乙酰乙酰-CoA还原酶)连入pBIB-HYG得到组成型表达载体pZCB,用冻融法转入根癌农杆菌,介导转化烟草。烟草为已获得的具有卡那霉素抗性整合并表达phbA的转基因烟草。通过二次转化将携有潮霉素抗性的phbB基因和phbC基因导入已整合phbA的烟草,各基因均由质体导肽控制,最后得到整合PHB合成的三个酶基因的转基因烟草。转基因烟草经PCR、PCR-Southern检测,初步确定整合phbB和phbC烟草植株。以气相色谱初步分析,转基因烟草中PHB的含量可达鲜重的0.233%。 结果表明phbB和phbC基因可以在真核表达系统中编码相应的蛋白。通过色素分析、荧光动力学等手段分析了PHB在叶绿体中的累积对其功能的影响。 为了提高底物乙酰-CoA的供应能力及减少惰性聚酯对植物体的伤害,分离了种子特异性启动子和质体导肽序列,利用忆经克隆的合成PHB的三个关键酶基因,通过一系列DNA重组,分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合phbC、phbB的二价表达载体pSCB及嵌合phbC、phbA、phbB的三价表达载体pSCAB,并由导肽将基因表达产物定位于质体。经根癌农杆菌介导转化油菜(Brassica napus L.) H165,获得转基因油菜植株,并进行了PCR、Southern blot及RT-PCR-DNA杂交等分检测。结果表明,三基因已经分别整合到相应的转基因油菜中,并已在转录水平表达。同时转化了油菜不育系、恢复系和保持系,获得批量转化株,并移入温室栽培。
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一. 小麦相关基因ver203F cDNA全序列克隆与功能分析 根据本实验室通过差异筛选技术克隆到的与春化相关的基因cDNA verc203的序列,设计PCR 5’端PCR引物,利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)克隆策略,得到春化相关基因ver203基因的同源基因ver203F cDNA的3’端序列,长度为1,197bp。Northern分析表明ver203F全长约为1.5 kb,且其表达具有春化处理的特异性。根据3’RACE克隆的ver203F 3 ’端核苷酸序列设计了3’端PCR引物,利用5’RACE克隆到该基因的5’端片段,经DNASIS核酸分析软件分析将5’45RACE和3’RACE DNA序列拼接合并,得到ver203F全长cDNA,从TdT加尾5’末端到poly A全长为1,561 bp,5’端起始密码子ATG上游非编码区-1~-192共了192bp,终止密码子TGA到poly A的非编码区有253bp,cDNA编码区全长1,119 bp,推测编码373氨基酸残基。国际基因序列数据库检索表明该基因序列(GenBank/EMBL/DDBJ:AB012013)与大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性。因上推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径,ver203F作用的发挥可能需要其它蛋白的参与,或ver203F本身就是一个受体蛋白。 为了研究ver203F基因的功能,将通过3’RACE克隆到的ver203F 3’端序到分别构建正义和反义植物表达载体,通过花粉管通道法、农杆菌介导的叶圆片法以及农杆菌介导的真空转化法分别转化小麦、烟草和拟南芥菜。获得转基因植株后,PCR、DNA Dob Blot、Southern Blot分析以及GUS活性检测证明外源基因已整合到转基因植株中,并得到表达。在获得的小麦、烟草和拟南芥菜转基因植株中,它们开花时间都相应地推迟,表明正常植物体内该基因在控制营养生长向生殖生长的转变中起作用。ver203F可以影响小麦和拟南茶菜花序的发育,首先无论正义还是反义都使得花序的发育受到抑制,在小麦中表现为顶部小穗退化,在拟南芥菜中表现为顶花。其次在转化正义基因的转基因拟南芥菜中,观察到产生的顶花为对称的两朵或以对称的两朵顶花基部为生长点长出丛生花,这种对称花的麦型小麦小穗中小花的表型相类似,说明ver203F基因可能在小麦小花的发育过程中也起着重要作用。 二. 春化相关基因ver17在开花过程中功能的分析 以春化处理冬小麦(京冬1号)幼苗cDNA为材料,通过减法杂交与差异筛选得到春化相关cDNA克隆verc17。为了研究该基因的功能,以包含CaMV 35S启动子的pBI221为载体,将ver17cDNA片段分别从两个方向插入pBI221的BamH I-Sma I, Xba I-BamH I间,构建正义和反义表达质粒:p17S和p17X,通过花粉管通道法转化小麦。对T0和T1两代转基因小麦的观察发现,在转化反义基因p17X的转基因小麦首先表现为抽穗推迟,其次穗的顶部和基部小穗严重退化,另外还发现转化反义基因的小麦败育现象严重(主要是花粉败育),因此推测ver17基困能可具有以下几方面的特点:a.春化诱导型表达;b.促进植物开花;c.促进穗顶端和基部花的发育,减少其退化;d.影响雄蕊的发育。
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以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)栽培品种新陆早4号、系550、冀资492、衡无89-30、邯93-2、冀资123等为材料,进行了组织培养及植株再生研究,建立了一套陆地棉体细胞植株再生速成体系。通过调整激素种类与比例以及改善培养条件,降低了畸形胚发生频率(从80%降为41%),并可将畸形苗转化为正常苗(转化率约为78%);通过水培和嫁接,结合试管扦插、扩繁技术,解决了棉花生根及移栽难题,为农杆菌介导法转化棉花奠定了基础。 用绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基因,构建了pBGb1m(含Bt和gfp二价基因)、pBGbf(含Bt-gfp融合基因)和pBGbfg(含Bt-gfp融合基因和gna基因)等三种植物表达载体。通过农杆菌介导法转化烟草,转基因再生植株经过荧光、虫试、PCR、Southern blot和Western blot等检测,表明三种植物表达载体能够在转基因植物中有效表达,同时,绿色荧光蛋白(GFP)的检测表现出了简便、经济、快速、可靠等优点,为大量棉花转基因苗的检测提供了一种有效方法。 采用花粉管通道法将携带细胞间隙定位信号肽的Bt基因的pBin438-S1m质粒导入棉花品种冀资492,经过田间卡那霉素筛选、虫试、PCR、PCR-Southern blot和Southern blot检测,证明Bt基因已整合至棉花基因组中,而且可能是以单拷贝形式插入。 同时,通过农杆菌介导法将三种植物表达载体(pBGb1m、pBGbf和pBGbfg)转化陆地棉栽培品种新陆早4号、冀资492、衡无89-30和邯93-2等材料,获得了大量转化再生棉株。经过PCR和PCR-Southern blot检测,转基因阳性植株为转为再生植株总数的89.45%。目前,虫试、Southern blot及Western blot正在进行之中。
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日益加剧的重金属污染已经危害到了全球的生态环境以及人类健康。在分子水平上阐明植物中的重金属抗性机制并应用于环境修复和绿色农业是植物科学和环境科学以及农业科学的交叉点和新的生长点。为了了解植物重金属抗性的分子机制,我们的研究主要是从重金属抗性植物材料大蒜(Allium sativumL.)和绊根草(Cynodon dactylon)中分离重金属抗性相关基因,并研究它们在重金属抗性机制中的功能。 在高等植物中有迹象表明,一种富含半胱氨酸的低分子量蛋白.类金属硫蛋白 (Metallothioneins Like,MTs Like)和一类具有Y-(Glu-Cys) n-Gly特殊结构的多肽一植物络合素(Phytochelatins,PCs)在重金属抗性机制中占有重要地位。然而人们对于同一种植物中这两种重金属结合肽作用的相互关系还缺乏了解,同时对于MT Like基因以及PCs合酶基因在同一种植物中的表达模式如金属离子专一性、时空表达特点等,还投有文献报道,因此本文将首先以这两个基因为切入点进行研究。 本研究采用RACE的方法,从大蒜中分离得到了类金属硫蛋白(MT-Like)的cDNA序列(GenBank Accession No.AY050510),PCR和SoutheLrn Blot分析表明,大蒜基因组中不仅存在类金属硫蛋白基因,而且可能以基因家族的形式存在。对获得的MT Like cDNA进行的序列分析及同源性分析表明,大蒜MT Like cDNA含有一个完整的开放阅读框架,编码73个氨基酸,其中12个为半胱氨酸,占氨基酸总数的1 6.4%,并与其他植物如水稻、小麦、紫羊茅草中的类金属硫蛋白基因同源性较高,其中最高达89%。对该基因编码的氨基酸序列和结构分析表明在N-端、c-端结构域中分别含有3个典型的金属硫蛋白的结构模式Cys-Xaa-Cys,属于典型的Type-1类金属硫蛋白。这些Cys-Xaa-Cys特征结构表明大蒜MT Like基因编码的蛋白可以结合二价金属离子。重金属胁迫下大蒜根中MT Like基因在转录水平的表达检测表明,MT Like基因的表达受重金属离子Cu2+、Cd2+的诱导,暗示MT Like基因在大蒜对重金属的抗性中有重要作用。此外,用能谱电镜技术研究大蒜中重金属的积累与分布,以及用组织原位杂交技术分析MT Like基因的表达定位与重金属的积累、转运的关系已在进行之中。 植物络合素也是富含巯基的多肽化合物,在重金属抗性中起重要作用。由植物络合素结构中存在的Y一酰胺键或β-Ala可知PCs不是基因表达的直接产物,而是以GSH为前体的酶促反应产物。目前已知y一谷氨酰半胱氨酸二肽转肽酶(简称为PCs合酶,phytochelatin synthase,PCS)是PCs合成途径的关键酶,编码这一关键酶的基因目前已在小麦、拟南芥菜和裂殖酵母中克隆。由于这一基因在不同物种中的保守性较低,其克隆较困难。本研究通过设计植物络合素台酶基因简并引物,从大蒜中扩增得到了345bp的cDNA序列。序列分析和推测的氨基酸序列同源性比较表明,此序列的翻译产物与已知的植物络合素合酶同源性最高,此cDNA序列应为大蒜植物络合素合酶基因的部分cDNA序列(GenBank Accession No.AF384110)。目前大蒜植物络台素合酶基因的全长序列的扩增,以及这两种与重金属抗性有关的基因(MT Like,PCS)的表达模式仍在研究中。 本文还尝试了利用酵母重金属敏感突变株M379/8功能互补的方法从重金属抗性植物绊根革中分离新的重金属抗性相关基因。构建了用于转化的酵母质粒表达文库,探索了酵母转化体系建立的条件。曾尝试多种转化方法,并对其中的条件进行了优化改进。下一步的工作将集中在合适的酵母突变体的筛选或穿梭表达载体的选择标记基因替换上
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本论文主要包括以下两部分内容: 一、真菌诱导子对青蒿发根生长和青蒿素生物合成的影响 用3种真菌诱导子[大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae Kleb.)、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer (Ehrenb. ex Fr.) Vuill)和束状刺盘孢(Colleto trichumdematium (Pers.) Grove)]分别处理青蒿(Ar temisia annuaL.)的发根,这3种真菌诱导子均能促进发根中青蒿素的合成,其中以大丽花轮枝孢的诱导效果最好;对细胞生长均没有明显影响。经大丽花轮枝孢处理的发根中青蒿素含量达1. 12 mg/gDW,比对照(0. 77 mg/g DW)提高45%。诱导子的作用效果与诱导子浓度、诱导子作用时间及发根的生长状态有关。对大丽花轮枝孢来说,诱导子作用的最适浓度为每毫升培养基含糖0.4 mg;发根在指数生长末期对诱导作用最敏感:在加入诱导子4d后收获发根,发根中的青蒿素含量最高。 二、早花基因FPF1、co对青蒿开花时间的影响及开花与青蒿素生物合成的相关性 1.将来源于拟南芥的早花基因Flowering Promoting Factorl (FPFl)插入到植物表达载体pBI121中,构建CaMV 35S启动子控制下含FPFl基因的植物表达载体pBI121FPF/,用含有pBI121FPF/质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404感染青蒿(Artemisia annua L.)叶片并诱导丛生芽,经卡那霉素筛选,获得转基因抗性植株。PCR、 PCR-Southem blot及Southern blot检测表明,外源基因FPFI已整合到青蒿基因组中:RT-PCR及RT-PCR Southern blot分析表明,外源基因在转录水平上已有表达。在短日照条件下,FPF1转基因植株的开花时间较对照提前20天左右,但提早开花的转基因植株与未开花的对照其青蒿素含量无明显差异,即提早开花并不能使开花植株的青蒿素含量有所提高,开花与青蒿素合成之间可能没有直接的关系。 2.将拟南芥的早花基因CONSTANS (CO)置于CaMV 35S启动子之下,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导转入青蒿(Artemisia annuaL.),使之在青蒿中表达,并得到了抗性植株。PCR、PCR-Southem blot及Southemblot检测表明,外源基因co已整合到青蒿基因组中;RT-PCR及RT-PCR Southemblot分析表明,外源基因在转录水平上已有表达。在短日照条件下,co转基因植株的开花时间较对照提前2周左右,但提早开花的转基因植株的青蒿素含量与未丌花的对照无明显差异,即植株开花前青蒿素含量的提高并不是由于开花本身引起的,再次证明,开花与青蒿素合成之间可能没有直接的关系。