Utility of ITS1-5.8S-ITS2 sequences for species discrimination and phylogenetic inference of two closely related bucephalid digeneans (Digenea : Bucephalidae): Dollfustrema vaneyi and Dollfustrema hefeiensis

The complete internal transcribed spacer 1 (ITS1), 5.8S ribosomal DNA, and ITS2 region of the ribosomal DNA from 60 specimens belonging to two closely related bucephalid digeneans (Dollfustrema vaneyi and Dollfustrema hefeiensis) from different localities, hosts, and microhabitat sites were cloned to examine the level of sequence variation and the taxonomic levels to show utility in species identification and phylogeny estimation. Our data show that these molecular markers can help to discriminate the two species, which are morphologically very close and difficult to separate by classical methods. We found 21 haplotypes defined by 44 polymorphic positions in 38 individuals of D. vaneyi, and 16 haplotypes defined by 43 polymorphic positions in 22 individuals of D. hefeiensis. There is no shared haplotypes between the two species. Haplotype rather than nucleotide diversity is similar between the two species. Phylogenetic analyses reveal two robustly supported clades, one corresponding to D. vaneyi and the other corresponding to D. hefeiensis. However, the population structures between the two species seem to be incongruent and show no geographic and host-specific structure among them, further indicating that the two species may have had a more complex evolutionary history than expected.

Intraspecific phylogeography of Carchesium polypinum (Peritrichia, Ciliophora) from China, inferred from 18S-ITS1-5.8S ribosomal DNA

Based on the variation of site 34, 46, 241, 305 and 322 in the 18S-ITS1 rDNA sequence, 19 Carchesium polypinum populations collected from eight provinces of China were separated into northern and southern population along the delineation between the Yangtze River and the Pearl River. This geographic distribution pattern of Carchesium polypinum maybe results from two factors: the vicariance resulting from the formation of the delineation between the Pearl River and the Yangtze River accompanied with the uplift of Qinghai-Xizang Plateau, and the different dispersal paths of C. polypinum affected by the climate.

Sequence analysis of the ITS region and 5.8S rDNA of Porphyra haitanensis

The sequences of the ITS (internal transcribed spacer) and 5.8S rDNA of three cultivated strains of Porphyra haitanensis thalli (NB, PT and ST) were amplified, sequenced and analyzed. In addition, the phylogenic relationships of the sequences identified in this study with those of other Porphyra retrieved from GenBank were evaluated. The results are as follows: the sequences of the ITS and 5.8S rDNA were essentially identical among the three strains. The sequences of ITS l were 331 by to 334 bp, while those of the 5.8S rDNA were 158 by and the sequences of ITS2 ranged from 673 by to 681 bp. The sequences of the ITS had a high level of homology (up to 99.5%) with that of P. haitanensis (DQ662228) retrieved from GenBank, but were only approximately 50% homologous with those of other species of Porphyra. The results obtained when a phylogenetic tree was constructed coincided with the results of the homology analysis. These results suggest that the three cultivated strains of P. haitanensis evolved conservatively and that the ITS showed evolutionary consistency. However, the sequences of the ITS and 5.8S rDNA of different Porphyra species showed great variations. Therefore, the relationship of Porphyra interspecies phyletic evolution could be judged, which provides the proof for Porphyra identification study. However, proper classifications of the subspecies and the populations of Porphyra should be determined through the use of other molecular techniques to determine the genetic variability and rational phylogenetic relationships.

Chromosomal mapping of 5S ribosomal RNA genes in the eastern oyster, Crassostrea virginica gmelin by fluorescence in situ hybridization

Chromosomal location of the 5S ribosomal RNA gene was studied in the eastern oyster, Crassostrea virginica Gmelin. using fluorescence in situ hybridization (FISH). Metaphase chromosomes were obtained from early embryos, and the FISH probe was made by PCR (polymerase chain reaction) amplification of the 5S rRNA gene and labeled by incorporation of digoxigenin-1 1-dUTP during PCR. Hybridization was detected with fluorescein-labeled antidigoxigenin antibodies. Two pairs of FISH signals were observed on metaphase chromosomes. Karyotypic analysis showed that the 5S rRNA gene cluster is interstitially located on short arms of chromosomes 5 and 6. On chromosome 5, the 5S rRNA genes were located immediately next to the centromere, whereas on chromosome 6, they were located approximately half way between the telomere and the centromere. Chromosomes of C. virginica are difficult to identify because of their similarities in size and arm ratio, and the chromosomal location of 5S rRNA genes provides unambiguous identification of chromosomes 5 and 6. Previous studies have mapped the major rRNA gene cluster (18S-5.8S-28S) to chromosome 2. and this study shows that the 5S rRNA gene cluster is not linked to the major rRNA genes and duplicated during evolution.

贾第虫rDNA的研究

典型的真核生物有四种rRNA（18S、5.8S、28S和5SrRNA）。一般18S、5.8S和28S的基因分别由转录间隔区（ITS）隔开而位于同一个转录单位上构成一个rRNA基因拷贝，多个rRNA基因拷贝串联形成rDNA。rDNA聚集在一起构成核仁组织区（NOR），成为核仁发生的位置。5SrRNA基因除在少数真核生物（如：酵母）中是和18S、28S rRNA基因位于同一个转录单位上外，一般是处在核仁以外的区域。贾第虫一度被认为是现存最原始的真核生物。支持这一观点的一个重要证据之一就是它还不具核仁结构。那么它的rDNA与典型真核生物的相比会有怎样的特点呢？本文在基因组的水平上对贾第虫的rDNA进行了全面调查分析，并对5S rRNA及其相关蛋白进行重点研究，得到如下结果和结论： 1）贾第虫的18S rRNA（1448bp）基因和28S rRNA（2300bp）基因比其他一些真核生物的（一般为1800bp和3400bp）要小的多，甚至比一些原核生物的相应的rRNA基因还要小。不仅如此，其5.8S rRNA基因和28SrRNA基因之间的转录间隔区（ITS2）比典型真核生物的对应区域也要短得多（只有54bp），且GC含量较高。结构预测表明该间隔区不能形成在许多真核生物中所能形成的保守的二级结构。更特别的是，贾第虫基因组中的rRNA基因序列大部分都是不完整的，并且不按照18S-5.8S-28S rRNA基因顺序排列，也没有多个完整拷贝顺序排列的区域。这提示贾第虫rRNA基因可能是以一种不同于典型真核生物的方式聚集的。因此本文认为以上这些特点可能与贾第虫不能形成典型核仁结构有关。 2）本文从贾第虫基因组中鉴定出了5S rRNA基因，并实验验证了其表达及其完整基因序列所编码的5S rRNA具有典型真核生物的T型二级结构，且具有绝大多数保守位点。RT-PCR表明该基因具有转录活性。该结果否定了前人的贾第虫没有5S rRNA的实验结果。并表明贾第虫尽管很原始，但其5S rRNA基因仍然是独立存在的和单独转录的。贾第虫基因组中总共有8个5S rRNA基因拷贝（且其中还有一个拷贝具有15个bp的异常插入）这大大低于一般真核生物的拷贝数。这些5S rRNA基因也不形成串联排列的区域。 我们还在贾第虫中鉴定出在真核生物中唯一与5S rRNA接触的核糖体蛋白L5蛋白并验证了其表达，该序列与其他真核生物的L5蛋白相似性很高，这提示贾第虫在5S rRNA基因转录出核后与L5蛋白结合形成5S RNP的过程可能与典型的真核生物是一致的。此外，我们从贾第虫中鉴定不出符合典型真核生物TFIIIA因子特征的蛋白，这提示贾第虫5S rRNA的转录起始以及转录后出核的机制可能与典型真核生物不同。过去对贾第虫的研究表明高等真核生物里RNA聚合酶III所独有的四个亚基在贾第虫中找不到同源物，而这样不完整的RNA聚合酶III已经可以在贾第虫中完成5S rRNA的转录了，这表明RNA聚合酶III所独有的这些亚基可能是为了完成其他功能而进化出来的。

Differences in the rDNA-bearing chromosome divide the Asian-Pacific and Atlantic species of Crassostrea (Bivalvia, Mollusca)

Karyotype and chromosomal location of the major ribosomal RNA genes (rDNA) were studied using fluorescence in situ hybridization (FISH) in five species of Crassostrea: three Asian-Pacific species (C. gigas, C. plicatula, and C. ariakensis) and two Atlantic species (C. virginica and C. rhizophorae). FISH probes were made by PCR amplification of the intergenic transcribed spacer between the 18S and 5.8S rRNA genes, and labeled with digoxigenin-11-dUTP. All five species had a haploid number of 10 chromosomes. The Atlantic species had 1-2 submetacentric chromosomes, while the three Pacific species had none. FISH with metaphase chromosomes detected a single telomeric locus for rDNA in all five species without any variation. In all three Pacific species, rDNA was located on the long arm of Chromosome 10 (10q)-the smallest chromosome. In the two Atlantic species, rDNA was located on the short arm of Chromosome 2 (2p)-the second longest chromosome. A review of other studies reveals the same distribution of NOR sites (putative rDNA loci) in three other species: on 10q in C. sikamea and C. angulata from the Pacific Ocean and on 2p in C. gasar from the western Atlantic. All data support the conclusion that differences in size and shape of the rDNA-bearing chromosome represent a major divide between Asian-Pacific and Atlantic species of Crassostrea. This finding suggests that chromosomal divergence can occur under seemingly conserved karyotypes and may play a role in reproductive isolation and speciation.

亚历山大藻分子鉴定和荧光原位杂交检测方法研究

近年来，世界沿海国家有害赤潮发生的频率、规模及危害都有上升趋势，有害赤潮已经成为重要的近海环境问题之一。要有效防范有害赤潮带来的危害效应，建立和发展可靠、有效的赤潮监测手段非常重要。目前，对于赤潮藻种的监测主要依靠显微观察的方法，在实际应用中经常遇到困难。首先，亲缘关系相近的物种在形态上差异很小，如甲藻门亚历山大藻属的一些种类，仅细胞壁上个别甲片的结构有细微差别，并且这些形态学指标还容易受环境条件及生长阶段的影响。另外，这种以形态学为基础的分析方法，分析速度慢、耗时长，对操作人员的要求较高，难以满足浮游植物种群动力学监测“量大、连续”的要求。因此，本研究将分子生物学的技术和方法应用于赤潮监测，力求提高赤潮藻种鉴定的准确性和检测工作的效率。 亚历山大藻是一类重要的有害赤潮藻，该藻属中一些产毒特性差别很大的藻种，单从表形特征难以明确区分，从而限制了基于形态观察的监测技术的应用。本研究中，我们尝试应用分子生物学技术与方法，开展了该藻属藻种分子鉴定和荧光原位杂交检测方法的研究。在亚历山大藻的分子鉴定方面，我们采用了核糖体RNA基因（rDNA）序列分析的方法，首次测定了9株分离自中国沿海的（以及实验室保有的其它两株）亚历山大藻的rDNA序列全长，其中包括核糖体小亚基（SSU）rDNA、大亚基（LSU）rDNA、5.8S rDNA及内转录间隔区（ITS）区序列。序列分析结果显示，这些藻株包含了5种核糖体类型，分别是塔玛复合种亚洲温带（Temperate Asian）核糖体类型（TSC-TA），塔玛复合种西欧（West European）核糖体类型（TSC-WE），相关亚历山大藻（A. affine）核糖体类型（AF），微小亚历山大藻（A. minutum）葡萄牙（Portugal）核糖体类型（M-PO）和微小亚历山大藻新西兰（New Zealand）核糖体类型（M-NZ）。将测获的rDNA序列划分为若干保守性不同的区段，分别进行系统发育分析（结合GenBank数据库中保存的其它亚历山大藻相关序列）。结果显示，LSU rDNA D1-D2区是对该藻属藻种进行分子鉴定和系统发育研究的较好区段。同时，为解决建立亚历山大藻克隆培养的困难，我们应用单细胞rDNA序列分析方法，对亚历山大藻单个细胞直接进行了种类鉴定。结果表明，该方法适用于不同生活史阶段的亚历山大藻。 在亚历山大藻的检测技术方面，我们进一步扩展和完善了针对完整细胞的荧光原位杂交检测方法。首先，通过对不同核糖体类型藻株rDNA序列信息的对比分析，针对各自特异的序列位点，设计了特异性rRNA标记探针。经荧光原位杂交实验检验，实现了对5种核糖体类型亚历山大藻的特异性标记。其中，针对WE、M-PO及M-NZ核糖体型的特异性探针为首次获得，另外两个探针是针对TA和AF核糖体类型rRNA新的位点所设计。同时，对影响探针标记效果的诸多因素进行了分析和探讨。此外，在2007年春季长江口海域赤潮调查中，首次应用特异性核酸探针和荧光原位杂交检测方法，调查了该海域亚历山大藻的丰度。结果表明，在4月4日-4月10日的样品中，亚历山大藻达到了较高的密度，最高密度达到103cells/L。同时发现，实验中样品的保存方法有待改进。随后的研究表明，盐醇固定方法及多聚甲醛/甲醇固定方法，可以较好的保持rRNA不被降解并适宜杂交（至少3个月时间）。 总之，本研究首次测定并分析了11株亚历山大藻（9株分离自中国沿海）的rDNA全序列信息。在此基础上，获得了5种核糖体类型亚历山大藻的特异性rRNA标记探针，其中3种为首次获得。另外，实验证明，单细胞rDNA分析技术和荧光原位杂交检测方法，在自然水体中亚历山大藻的直接鉴定及丰度调查中，均具有良好的应用前景。这一工作为我国近海亚历山大藻的鉴定和检测提供了理论依据和方法学基础，希望对该藻赤潮的监测工作有推动作用。 关键词：亚历山大藻 遗传探针 rRNA rDNA 荧光原位杂交 系统发育

牡丹复合体的分子进化和系统学研究---细胞核核糖体基因变异的分析

牡丹复合体(Paeonia suffruticosa Andr. Complex)属芍药属牡丹组，为中国特有的落叶亚灌木，野生类型均为濒危种，仅局限分布于以秦岭为中心的较小区域。由于分布区有限，个体数量少，栽培历史长，育种广泛，种间极易杂交，网状进化的广泛发生，使得该复合体分类混乱。本文选取牡丹复合体6个野生种以及2个近缘类群，采用分别基于核酸印迹杂交和聚合酶链式反应的限制性酶切片段长度多态性分析，对细胞核核糖体基因片段ITS/18s的变异进行了分析，并且结合采用微卫星DNA指纹分析技术。选取18种内切酶对特异片段进行酶切消化。共得149个酶切位点，其中67个为变异位点，占45.0%。其中编码区(2．Okb，含18s，5.8s，26s)有突变位点29个，占该区段长度的1.4%;非编码区(490bp，含ITS-1，ITS-2)有突变位点38个，占该区段长度的7.8%。由此，可明显比较二者进化的保守程度和进化速率。两段间隔区的变异程度也存在差异。ITS-1为6.0%．ITS-2为9.9%。这说明构建系统树时二者的选用应得到综合考虑或加权。在复合体内不存在长度变异，即无缺失或插入发生，暗示了该复合体各种之间亲缘关系的紧密。根据Neighbor-joining法并计算遗传距离构建系统关系图，结果如下：(1)卵叶牡丹（神农架红花类群）与紫斑牡丹分化较早，考虑其与复合体内其它各种之间的遗传距离，支持将其定为新种的观点;(2)神农架白花类群与与卵叶牡丹亲缘关系非常相近，这一结果支持了来自其它分子和表型分析的结果;(3)延安牡丹与紫斑牡丹亲缘关系极近，但与矮牡丹关系较远，是否为上述两个种的杂交种，目前为止尚无充分的证据，作为存疑种处理;(4)川牡丹和矮牡丹进化关系密切，这一结果与ITS序列分析结果完全一致，加之其地理分布式样的不连续性说明了它们的古老和残存性质，这可进而推广至本复合体乃至整个牡丹组。我们认为现存的分布格局可能是地理与气候演化的产物，估计牡丹组的野牡丹复合体从本复合体分化出去的时间约为310 - 750万年前。由于基因间协调进化的不均一作用和该类群杂种的早期起源限制了核糖体基因在追溯其网状进化历程上的作用，这符合基因转换的梯度理论。最后讨论了nrDNA得到的基因树与其它的基因树和种系树之间的关系。

毛冠菊属的系统学研究

　　毛冠菊属是菊科21个“有问题”属中的一个，主要分布于青藏高原地区。按照林镕、陈艺林的概念，它包含了Nannoglottis、．Stereosanthus、Vierhapperia、Senecio和Doronicum5个属的成员。它曾先后被放入旋覆花族、千里光族和紫菀族，在上述三族中的亚族位置也不确定。它的许多重要性状，如舌片颜色、染色体数目等等，人们所知甚少。由于缺乏野外工作以及看不到大多数名字的模式，林镕、陈艺林对该属的修订有待深入的研究。本文研究了该属的外部形态学、微形态学、解剖学、孢粉学、细胞学、生态学以及ITS序列，确定了毛冠菊属的分类位置，并建立了一个新的属下分类系统。 1．外部形态 在检查大量标本（包括大多数模式）和野外居群考察的基础上，分析了主要外部形态学性状的变异式样及其对划定物种范围的价值。共确认以下9个种：青海毛冠菊、厚毛毛冠菊、狭舌毛冠菊、虎克毛冠菊、宽苞毛冠菊、大果毛冠菊、毛冠菊、玉龙毛冠菊和云南毛冠菊。川西毛冠菊被处理成狭舌毛冠菊的异名。 2．微形态学 在光镜下检查了毛冠菊属9种和紫菀族2个代表属的花柱的形状、花药顶端不育附属物、花药基部、花药基部、花盘、花丝领、药室内壁细胞等微形态性状。除了花柱基外，其他的微形态学在属内一致。管状花的花柱形态支持将毛冠菊属放在紫菀族，但其药室内壁细胞两极加厚式样表明它和广义的旋覆花有某些联系。 3．叶表皮研究 在光镜和电镜下检查了毛冠菊属8个种的叶表皮特征。．所有种的气孔器都为不规则型。青海毛冠菊表皮细胞的为多边形，而其他种都为不规则型。青海毛冠菊表皮角质层的加厚方式也与其他种明显不同。 4．扫描电镜下的舌片和花柱分枝特征 在扫描电镜下观察毛冠菊属8种和紫菀族7个代表种的舌片近轴面表皮细胞。发现毛冠菊属的舌片近轴面表皮细胞都为板状，并且沿细胞中央特征性加厚，这与紫菀族类型的表皮细胞一致，但毛冠菊属表皮细胞的角质层主要是纵向条纹或皱纹，而紫菀族总是横向的条纹或皱纹，明显不同。 在扫描电镜下又检查了毛冠菊属8种和紫菀族8个代表种的管状花花柱分枝近轴面的结构，结果在毛冠菊属管状花花柱分枝的近轴面都发现了柱头毛状的突起，而在紫菀族8种中没有发现。从突起的形状和位置判断，它可能是残存的、未充分发育的柱头毛。这表明雌性不育管状花可能刚刚从两性管状花演化而来。 也在扫描电镜下观察了毛冠菊属6种和紫菀族8个代表种的舌状花和丝状花的花柱分枝的远轴面，结果在毛冠菊属4种中发现了类似扫集毛状的突起。从这种突起的位置和形状判断，它可能是残余的扫集毛。这种突起在除雏菊以外的其他紫菀族代表种中缺失。 5．细胞学 检查了毛冠菊属8种的细胞学性状。结果发现毛冠菊属所有种的染色体基数都为x -9。染色体长度大约4um-lOum。核型公式：毛冠菊、厚毛毛冠菊、狭舌毛冠菊、宽苞毛冠菊和云南毛冠菊都为2n=14m+2sm+2st;玉龙毛冠菊、大果毛冠菊和青海毛冠菊都为2n=12m+4sm+2st。A1、A2值在属内没有明显差异。所有种的核型都是2A型。这表明在物种形成的过程中没有多倍化参与，毛冠菊属宜放在紫菀族而不是千里光族。细胞学证据支持毛冠菊属为一单系类群。 6．分子生物学 测定了毛冠菊属7种的ITS序列，并从基因库里下载了46个ITS序列，涵盖紫菀族14个亚属和旋覆花族、春黄菊族、金盏菊族。以旋覆花族、春黄菊族、金盏菊族为外类群。简约性分析显示，毛冠菊属在紫菀族中，并有较高的bootstrap值，在紫菀族中处于基部位置。Olearia和Chiliotrichum两个Hinterhuberinae亚族的代表属与毛冠菊属密切相关。在属下系统发育分析中，Olearia和Chiliotrichum被选做外类群。652个性状中，共有7】个信息位点（31个在ITSI，33个在ITS2，7个在5.8S）。简约性分析时只获得一棵最简约树。树上有两个明显的进化支，一支仅有青海毛冠菊一种，另一支包含其他种类。这种分支方式也得到形态学和生态学证据的支持。 7．毛冠菊属的系统学 从上述结果可以看出，毛冠菊属宜放入紫菀族中，在紫菀族中处于基部位置，与Hinterhuberinae亚族关系密切。综合上述研究结果，提出一个新的属下 分类系统： 毛冠菊属的新系统 组I单头组Sect. Monocephala T.G.Gao et YL.Chen Sect nov. 青海毛冠菊Nannoglottis ravida (C.Winkl.)Y.L.Chen 组II毛冠菊组Sect. Nannoglottis 系1．长舌系Ser. Delavayanae Ling et YL.Chen 厚毛毛冠菊Nannoglottis delavayi(Franch.)Ling et Y.L.Chen 狭舌毛冠菊Nannoglottis gynura(C.Winkl.) Ling et YL.Chen 虎克毛冠菊Nannoglottis hookeri (C.B.Clarke ex Hook.f.)Kitam. 宽苞毛冠菊Nannoglottis latisquama Ling et Y.L.Chen 大果毛冠菊Nannoglottis macrocarpa Ling et YL.Chen 系2．短舌系Ser. Nannoglottis 毛冠菊Nannoglottis carpesioides Maxim. 玉龙毛冠菊Nannoglottis hieraciphylla (Hand.-Mzt.)Ling et YL.Chen 云南毛冠菊Nannoglottis yuennanensis (Hand.-Mzt.) Hand.-Mzt.

松属植物rRNA基因的变异模式及其进化生物学意义

被子植物的rRNA基因已经得到深入研究。二倍体被子植物一般拥有1-4对18S-5.8S-26S rDNA位点和1-2对5S rDNA位点。作为特殊的多基因家族成员，rDNA会受均一化力 (homogenizing forces) 的作用，通过基因转换、不等交换等机制，形成基因的致同进化 (concerted evolution)。长期以来，我们一直认为动植物rDNA致同进化水平很高，各种拷贝的序列几乎完全一致，因此可以直接应用PCR测序的方法进行分子系统学研究。但是在裸子植物中由于研究资料的匮乏，使我们对裸子植物rDNA的变异模式了解甚少。松属植物作为裸子植物的最大类群，它的rDNA变异和进化有何特点、与被子植物是否相同，是这个重要类群的进化研究中目前尚未解决的问题。本文的研究内容从三个方面进行： (1)rDNA的染色体定位 目前，松属的18S-5.8S-26S rDNA的染色体定位研究只包括5种植物，其中的3种同时涉及到5S rDNA定位。这些研究结果表明，不同种存在相异的rDNA位点数目，甚至不同的个体的rDNA位点均有变化。其共同点是，18S-5.8S-26S rDNA位点数平均较被子植物多，5S rDNA除Pinus radiata外，在其它种里则与被子植物相似。这种现象是松属或裸子植物的共同特征，亦或是特例呢？有限的研究限制了对裸子植物rDNA的了解。本研究的目的之一就是研究松属植物rDNA的染色体空间分布特征，希望借此了解松属植物间的关系，比较裸子植物和被子植物rDNA在染色体组水平的差异。 (2)5S rDNA的分子进化 5S rDNA的序列水平的进化研究在松属中尚属空白。5S rDNA在染色体数目上没有显示裸子植物与被子植物的差异，是否意味着松属乃至裸子植物的5S rDNA也同被子植物一样——致同进化完全，序列高度一致呢？利用克隆测序方法对松属植物5S rDNA的研究无疑是有开创性的工作，可以探讨裸子植物的5S rDNA的进化机制和种间关系。 (3)杂种基因组研究 杂交物种的起源演化是当前生物学研究的热点，通过杂种基因组的研究，可以了解杂种的的基因组构成，组织方式和进化历史，探讨杂交事件对成种过程的影响及意义。这项研究涉及到高山松、云南松和油松。之所以采用这三种植物，因为等位酶、cpDNA和mtDNA证据证明高山松为油松和云南松的自然杂交种。但这些证据不足以反映杂种核基因组的重组特征和构成及其进化规律。我们利用rDNA-FISH、5S rDNA和基因组原位杂交分析三种松树间的基因组关系，为揭示高山松的进化机制和历史提供新的依据。 本项研究得到以下结果： 一. rDNA荧光原位杂交 (FISH) 通过对华山松和白皮松两种单维管束亚属植物及油松、云南松、高山松、马尾松和南亚松等五种双维管束亚属植物的18S rDNA与5S rDNA的荧光原位杂交，结果表明： ⑴ 裸子植物的18S rDNA位点数目明显多于二倍体被子植物。其中主要位点数目，油松有7对，高山松5对，云南松8对，马尾松10对，南亚松6对，白皮松3对，华山松10对，平均在7对;另外，部分松树还存在弱位点。无论强弱位点都有部分存在于染色体的着丝粒区，除了赤松 (Pinus densiflora)，在其它松科植物中并没有发现这种现象。究竟是基因转移的结果或该位点是18S rDNA的原始起源位置还有待确证。 ⑵ 5S rDNA位点相对变异较小，与被子植物相当。除了华山松5S rDNA有4对位点，马尾松只有1对位点外，其它松树的5S rDNA位点数目均为2对，并且在双维管束亚属植物中有一对属于弱位点。 ⑶ 两种rDNA存在不同连锁模式。双维管束亚属植物中，5S与18S rDNA连锁在同一染色体的同一臂或两条臂上。在同一染色体臂时，18S rDNA在臂的远端。单维管束亚属植物的5S与18S rDNA或连锁于同一染色体的同一臂上，或分别处于不同染色体。前一情况，5S rDNA位于臂的远端。据此可以说明两个亚属的rDNA结构在染色体组水平的很大分化。 ⑷ 松属植物的关系及高山松核型特征。由于5S与18S rDNA连锁关系的不同，可以将单维管束亚属和双维管束亚属分开。各亚属的不同物种可以依据杂交位点的多少、位置、信号强弱构成的核型图加以区分，并且构成一定的系统关系。杂交起源的高山松在染色体组上，表现出对油松和云南松两亲本不同染色体特征的分别继承与重组，并产生独有的特征。其II同源染色体之一18S rDNA位点的缺失，可能是染色体重组的痕迹。 二. 5S rDNA的序列变异与分子进化 利用分子克隆和DNA测序分析了油松、云南松、马尾松、白皮松和不同遗传背景的高山松居群的5S rRNA基因序列变异及基因进化规律，得到以下主要结果： ⑴ 5S rDNA的结构特征。双维管束亚属植物长度在658-728 bp，白皮松则为499-521 bp。长度差异体现在基因间隔区，而基因区极端保守，基本为120 bp。基因转录区内部存在着转录控制区，决定了5S rRNA的转录起始与转录效率。5S rRNA基因能够折叠成正常的二级结构，其中，相对于干区来说，环区要保守，但环E却表现出异乎寻常的变异，转换/颠换比值高达7.1，这种突变可能是假基因的产物。基因间隔区存在一定的保守单元，其中一些与转录的起始和终止调控相关，有些是裸子植物未知功能的特异保守区。 ⑵ 松属植物5S rDNA存在着基因组内与种间的异质性。基因组内的各个克隆中有超过80%的特异的，彼此不相同。整个5S rDNA分化距离为0.042 - 0.051，其中，间隔区的分化比基因区高，其速度约是基因区的3-7倍。比较种间5S rDNA序列发现：在122个克隆中，基因区只有50个特异的序列。基因组间的序列变异度与基因组内 (个体内) 没有明显差别。白皮松的间隔区与双维管束亚属松树的5S rDNA间隔区差异极大，几乎不能排序，而四种双维管束亚属植物的5S rDNA间隔区种间种内差异不大。 ⑶ 松属植物5S rDNA进化。PAUP分析建立的5S rRNA基因树显示，5S rRNA基因在基因组内是多系的 (polyphyletic)，表明成种事件以前，祖先种就已经存在序列的分化。观测到的5S rRNA基因序列变异状况，并非完全是致同进化或独立进化的单一因素造成的，而是二者的相互作用的结果。致同进化确实存在，只是速度较慢而已。 ⑷ 高山松5S rDNA 组成。高山松拥有最高的基因组内的序列多样性，高山松的5S rDNA拷贝既有亲本类型，又有重组类型，并且不同地理及遗传来源的高山松显示一定的分化趋势，有更多的拷贝来自母系亲本。 三. 基因组原位杂交 以油松和云南松总DNA作为探针，相互进行基因组原位杂交，结果显示云南松和油松的染色体组可以完全被对方探针标记，在现有基因组原位杂交的分辨率下不能将两个基因组区分开。说明云南松和油松基因组之间存在高比例的同源序列，两种松树的基因组组成十分相似。利用油松和云南松总DNA作为探针，对高山松的染色体组进行双探针基因组原位杂交。结果表明，高山松全部基因组都能与两亲本探针完全杂交，说明三者间有着异乎寻常的亲缘关系。但在PH失调影响下，高山松只有部分基因组被杂交，并且两种探针的杂交信号有轻微差异。这可能是高度重复序列优先杂交的结果。这些情况表明，高山松虽然在基因组构成上与两个亲本基本一致，但基因在染色体组的空间排布上是存在差异的，这一点可以从rDNA-FISH中证明。

水稻花药绒毡层特异基因及减数分裂相关基因的分离与功能分析

　利用RNA减法杂交、差异筛选和5’-RACE等方法从水稻分离到了一花药绒毡层特异表达的基因RA39。Southern 杂交表明，RA39在水稻基因组中是以单拷贝的形式存在的。RT-PCR 结果初步表明，RA39是一水稻花药特异表达的基因。RNA原位杂交进一步表明，RA39主要在水稻花药的绒毡层中表达，而且在小孢子母细胞减数分裂期和四分体时期表达量最高。RA39 cDNA全长1013bp，编码298个氨基酸残基。 RA39 cDNA与数据库中的已知序列没有明显的相似性，由其推测的多肽与核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating protein, RIP）的序列相似在19-34%之间。多重序列排列分析结果表明构成RIPs活性位点的5个关键氨基酸残基在RA39中是保守的，在蓖麻毒蛋白中分别为Tyr80、 Tyr123、 Glu177、 Arg180 and Trp211 。利用原核表达系统，通过蛋白质分离和纯化获得了在SDS电泳图谱上为单一条带的纯的RA39蛋白，用兔rRNA作底物进行的酶活性分析证明该蛋白有N-糖基化作用，是一种类型I的核糖体失活蛋白。反义转基因植株的花粉用TTC进行活性染色结果显示其活性明显减弱，成熟的T0代反义转基因植株的结实率明显降低，只有对照的20-60%。这说明，RA39蛋白可能和小孢子母细胞的发育相关。 　　酵母DMC1是减数分裂过程中同源染色体配对和重组修复所必需的减数分裂特异基因。根据酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1的保守区设计简并性引物，通过RT-PCR和RACE等方法，从水稻中分离出了酵母DMC1的同源基因OsDMC1。RT-PCR分析表明，OsDMC1在花中表达量最高，在根中表达量较低，在叶片和幼芽几乎不表达。水稻基因组中有两个拷贝的OsDMC1。OsDmc1蛋白与酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1氨基酸一致性分别为53%和81%。 　　酵母Spo11在减数分裂过程中具有催化DNA双链断裂从而起始同源重组的功能。以酵母Spo11氨基酸序列为探针和现有的数据库通过数据分析，结合RACE技术，克隆了水稻SPO11同源基因OsSPO11-1， OsSPO11-1是一个单拷贝基因，有3个外显子和2个内含子，在转录过程中通过内含子的可变剪切产生4个不同的转录本（OsSPO11-1A、OsSPO11-1B、OsSPO11-1C和OsSPO11-1），其中，OsSPO11-1A是一个未剪切的转录本，OsSPO11-1B包含内含子2，OsSPO11-1C包含内含子1，OsSPO11-1D是一个完全剪切的转录本。这些转录本编码的蛋白有一致的246氨基酸残基的C-端，包含了Spo11/TopVIA家族蛋白共有的5个功能基元，是该家族的新成员。OsSPO11-1A和 OsSPO11-1C在花中优势积累，OsSPO11-1B是花特异的，而OsSPO11-1D在营养器官中优势积累。在花中该基因主要在减数分裂的花粉母细胞和胚曩中表达，在减数分裂期的绒毡层细胞和不同花器官的微管束细胞中也表达。这些结果说明内含子涉及到了OsSPO11-1表达的器官特异性调节，该基因除了参与减数分裂的调节外，在体细胞的发育中可能起重要作用。

松口蘑与假松口蘑 ITS 序列测定和分析比较

对松口蘑和假松口蘑进行ITS 序列测序，通过DNAStar 软件比较分析，发现松口蘑与 假松口蘑的5.8S rDNA 序列完全一致，ITS1 和ITS2 呈现不同程度的多态性。松口蘑ITS 序列 长度为601bp，假松口蘑ITS 序列长度为563bp。设计了扩增松口蘑和假松口蘑ITS1 的特异性 引物，能够快速地区别松口蘑与假松口蘑。

蛋白质可能作为遗传信息的载体吗?

分子生物学的“中心法则表明”: 遗传信息的方向是从DNA-RNA-蛋自质. 然而, 截止目前为止, 中心法则仍未从控制论和信息论获得足够的理论支持. 此外, 生物学中的一些特殊情况, 例如, 虽然用碱可使羊骚痒病基因不可逆地失活, 但用对核酸具专一修饰作用的5种方法却都未能使其失活; 另外, 当间期细胞被某些因素激活并造成分裂时, 在 DNA 合成之前蛋白质的合成就已经开始等, 也都很难用中心法则来解释清楚. 基于正常的翻泽过程, 也能容易地“设计”一个逆翻译机制的大概轮廓, 并且这种机制既可以证明为什么中心法则没有理论基础,同时又可以说明遗传密码的简并性。

海洋喇叭虫rRNA基因18S -ITS1序列及其系统发育分析(英文)

海洋喇叭虫Maristentordinoferus 1996年在关岛(Guam)的珊瑚暗礁上被发现 ,至今尚未阐明其确切的系统发育地位。克隆到的海洋喇叭虫的 18S ITS1 5 8SrDNA序列包括 2 2 2bp的 18S序列 ,77bp的ITS1序列和 2 2bp的 5 8S序列。比较分析了纤毛虫主要类群的ITS1序列后得出 :短的ITS1序列可能是异毛类纤毛虫的特征。根据 18S序列 ,利用邻接法构建 ,最大简约法和最大似然法构建系统发育树。其拓扑结构显示海洋喇叭虫属于异毛纲纤毛虫 ,但并不隶属喇