重组腺病毒载体vAd2tat 的构建及其在细胞中的表达

　目的　构建含HIV21 tat 基因重组腺病毒,观察在不同细胞中外源蛋白Tat 的表达,作为DC 抗HIV 疫苗的基 础。方法　通过PCR 扩增,获得HXB2 tat 的cDNA 片段,定向克隆入腺病毒转移载体pTrack2CMV ,线性化后转化含有腺病毒骨 架pAd2easy21 的大肠杆菌BJ5183 ,获得同源重组的质粒prAd2tat , Pac Ⅰ酶切纯化后转染293 细胞,包装成具有感染力的复制缺 陷型重组腺病毒vAd2tat 。结果　经PCR、酶切及DNA 序列测定,插入片段大小、方向正确,获得具有感染力的含有HIV21 tat 基 因的重组腺病毒;通过Western blot 方法检测,重组腺病毒在293 细胞中表达出Mr 为15 000 的蛋白。结论　成功构建了含有 HIV21 tat 基因的腺病毒,并观察到该基因在细胞中的表达。

HIV-1 C亚型gp120重组腺病毒载体的构建及gp120负载人树突状细胞疫苗的初步研究

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是一种由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的，以全身免疫系统受到严重损害为特征的传染性疾病。从目前HIV-1的流行趋势来看，HIV-1 C亚型已经成为全球最主要的流行株之一，因此，针对HIV-1 C亚型的疫苗设计颇为重要。gp120作为HIV-1的包膜糖蛋白，能够诱导广泛的中和抗体反应，中和进入机体的病毒粒子，阻止病毒早期感染，所以本实验选取HIV-1 C亚型密码子优化的gp120作为免疫原进行研究。目前的疫苗研究中，腺病毒载体是较理想的病毒载体之一，具有安全性好、外源基因容纳量大、感染效率高、操作简便等优点。我们以复制缺陷型腺病毒为载体，构建了表达HIV-1 C亚型密码子优化的gp120的重组腺病毒vAd-gp120，经Western Blot方法检测到了gp120蛋白的表达。树突状细胞（DC）是已知最强的抗原呈递细胞(APC)，也是目前发现的唯一能够刺激初始型T细胞增殖的细胞。经抗原致敏的DC可通过MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ途径递呈抗原，并激活T细胞，从而激发体内的体液免疫和特异性细胞免疫反应。我们利用Amaxa系统将HIV-1 C亚型gp120基因转入人外周血单核细胞来源的DC，构建了以DC为载体的治疗性疫苗，并对其功能进行初步研究，发现负载gp120的DC能够显著刺激淋巴细胞的增殖、增强CD8T细胞表面活化分子CD25的表达以及促进CD8T细胞分泌++IFN-γ，为下一步DC治疗性疫苗的体内研究奠定了基础。