连续PCR扩增过程中异常现象的发生机理研究

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术从其发明以来，因为其操作的简单方便和高效率而在生物学研究的各个领域得到了广泛的应用，包括序列扩增、序列的人工突变、疾病诊断、法医学鉴定、基因的表达分析等等。从PCR技术发明以来，如何提高反应的特异性和反应的效率一直是人们所共同关心的题目，为此也发展了相当数量的各种方法，如热启动PCR、降落PCR、巢式PCR以及在反应体系中添加一些有益的附属物等。而适合不同目的的PCR技术也得到了充分的发展，如多重PCR、反转录PCR、定量PCR、原位PCR、PCR突变、毛细管PCR技术等等。并且，包括随机引物扩增多态、扩增片段长度多态性、简单重复序列多态性、单核苷酸多态性等这些在PCR技术基础上发展而来的各种分子标记技术极大地方便了遗传分析和遗传图谱的构建等工作。在PCR技术发明了20年后的今天，提高PCR的反应性能、发展适合新领域的PCR技术和新的分子标记技术仍然是研究者关心的题目和努力的方向。 　　PCR实验中已经观察到多种异常现象，除了常见的扩增失败（没有产物）、扩增产物特异性不强（有非特异产物出现）、引物多聚体产物扩增、扩增效率低等现象以外，还包括PCR介导的重组、跳跃、复制滑动等等。阐明这些异常现象的发生机理和过程，避免或缓解这些异常现象在扩增过程中对目的产物扩增的影响，以及促进和利用一些特殊的异常PCR扩增都是PCR技术研究所关心的话题。各种研究工作中经常需要扩增一些长片段的序列，但是在进行长片段PCR时经常会发现扩增目标序列的长度是有限的、扩增效率比较低、扩增产物检测中有很强的背景弥散等现象;同时长片段PCR需要一些特殊的反应体系组成和反应条件。如何更加有效地实现更长序列的PCR扩增也是人们所关心的话题之一。 　　常见的PCR产物重复扩增（以上一轮扩增产物为模板进行新的PCR扩增）扩增轮数少，通常仅进行一次重复扩增;同时，在重复扩增中常使用的策略是使用巢式引物。而连续PCR扩增实验（用相同的引物以产物为模板进行多轮次的连续重复PCR扩增）从未见于文献报道。我们第一次系统地进行了连续PCR扩增实验;同时，在实验过程中我们观察到了一种新的PCR扩增异常现象——用不同来源的模板（病毒、细菌质粒或真核生物来源的DNA序列）进行连续PCR扩增不同长度的靶序列，经过有限次数的重复扩增后，最终都会导致扩增失败;这种扩增失败都表现为在常规琼脂糖电泳检测时特异产物条带的消失和不能泳动出点样孔之复杂异常产物的出现;这种扩增产生的异常产物能够被稳定地重复扩增。用λ和细菌质粒序列为模板连续扩增不同长度靶序列的结果表明：连续PCR扩增失败的时期具有扩增靶序列长度的依赖性，越长的靶序列在连续PCR中扩增失败的时期越早。 　　对不同连续PCR扩增的扩增过程观察表明扩增产物经历了一个从高效特异性扩增到低效率特异性扩增，再到扩增产生复杂异常产物的过程。对复杂异常产物的甲酰胺辅助变性处理和变性胶电泳（尿素变性聚丙烯酰胺胶电泳和NaOH碱变性琼脂糖电泳）检测表明扩增产生的复杂产物主要由连续分布的小于靶序列长度的具有相当程度多样性的非全长链组成。连续PCR产生的复杂产物在内部具有局部的双链区域和大量的单链区域及外部单链分支，能够被单链特异的S1核酸酶消化，但是不能被双链特异的限制性内切酶消化。用DNase I或限制性内切酶处理连续扩增早期产生特异扩增产物形成不同长度序列组成的混合物，或者直接用不同扩增反应产生的不同长度的核酸序列组成混合物，混合物在经历变性-复性后都表现出类似连续PCR失败所产生的异常产物电泳行为。这些证据都表明PCR扩增过程中形成的非全长链成分是导致这种异常现象的关键因素，多个不同长度的非全长链复性形成“杂种分子”（具有较大且不一致的分子量和复杂的分支结构），最终表现为常规琼脂糖电泳异常的复杂产物。同时，异常产物组成非全长链成分和全长链成分是其能够实现稳定重复扩增的基础。 　　实验结果表明：对于特定长度的靶序列而言，导致复杂异常出现的根本原因是连续PCR扩增体系中所经历的总PCR热循环数目（每一轮PCR扩增所使用的循环数目多，成功连续扩增的轮数就少）;而扩增体系中的引物浓度、DNA聚合酶用量的多少、扩增程序中时间参数等对此影响较小;巢式PCR和单引物-互补引物PCR的结果表明这些处理对于缓解或延迟异常产物的出现有一定的作用。人工处理（DNase I或限制性内切酶处理）完整模板双链形成的非全长链长产物，然后把非全长链长产物以不同比例同完整模板混合模拟连续扩增后期产物，这种人工混合模板表明连续PCR扩增中同源的非全长链成分对PCR扩增有严重的干扰作用，是导致复杂异常产物出现的直接原因。 　　已有的研究表明：PCR介导重组、长片段PCR难于操作有共同的产生基础——扩增过程中非全长链成分的产生和非全长链成分对后续扩增过程的干扰作用。这一点和导致连续PCR失败的原因是一致的。非全长链成分的出现是PCR扩增过程中不可避免的，其最初产生的可能来源有三个：模板的损伤（扩增前的模板损伤或扩增热循环过程中的损伤）、聚合酶的忠实性、以及聚合酶的进行性。根据聚合酶的特性而调整扩增程序中延伸时间的实验表明，聚合酶的进行性不是导致连续PCR扩增失败的最主要原因。这种非全长链成分产物从无到有且不依赖于体系中非全长链成分的过程我们称之为非全长链成分的初级合成;而已经存在的非全长链成分干扰后续合成形成非全长链成分的过程我们称之为非全长链成分的次级合成。非全长链成分的初级合成和次级合成共同导致了连续扩增的失败和异常产物的形成。 　　从已有的研究结果看，任何降低PCR扩增过程中非全长链成分产生的措施，特别是聚合酶忠实性的提高，都能缓解异常扩增产物的出现和利于长片段PCR操作。 　　

云杉属的分子系统学与生物地理学研究

云杉属植物是非常重要的森林树种，广泛分布于北半球的寒温带、温带高山和亚高山地带。该属为松科中仅次于松属和冷杉属的第三大属，约有 28-56 种。自云杉属建立以来，其属于松科没有任何疑议。然而，由于云杉属物种间频繁杂交、形态趋同和取样困难，尽管已经有基于形态学、细胞学、化学成份、叶绿体 DNA RFLP 等方面的研究，该属的属下分类仍然存在诸多争议。本文利用父系遗传的叶绿体基因和母系遗传的线粒体基因序列重建了云杉属的系统发育关系，探讨了云杉属生物地理格局的形成过程。在此基础上，我们研究了低拷贝核 CAD 基因在云杉属的进化式样。另外，我们还对裸子植物线粒体基因 rps3 的内含子分布和进化进行了初步研究。 1． 云杉属的系统发育和生物地理学研究 我们选择了 Farjon (1990) 确定的 34 个种中的 33 种 (另一个种在 Flora of China 未得到承认)，共 103 个个体，对这些个体的叶绿体 DNA 片段 trnC-trnD 和 trnT-trnF 以及线粒体基因 nad5 的第一个内含子进行了序列测定。在两个叶绿体基因片段联合分析构建的系统发育树上，北美西部的 P. breweriana 和 P. sitchensis 位于最基部。其余的物种分为三支：第一支由北美的两个物种组成;第二支包括分布于喜马拉雅-横断山区及其周围地区的八个种、台湾的 P. morrisonicola、西亚的 P. orientalis、日本的两个种及北美的 P. chihuahuana;第三支中，北美的 P. pungens 位于基部，亚洲东北部的种 (除 P. maximowiczii 和 P. torano 外)、P. retroflexa 和欧洲的 P. abies 构成一个单系群，并与北美的 P. mariana 和 P. rubens 及来自巴尔干半岛的 P. omorika 形成姐妹支。所有样品的 nad5 第一个内含子序列可分为 A、B、C、D 和 E 5 种单倍型，北美的物种拥有前 4 种，而且 A、B 和 C 单倍型为北美所特有;欧亚的物种仅含 D 和 E 两种单倍型。 上述结果结合 MacClade 和 DIVA 分析及化石证据，我们推断云杉属起源于北美，至少两次经白令陆桥扩散至亚洲，然后从亚洲扩散至欧洲。亚洲东北部的绝大多数物种和欧洲云杉 P. abies 的种间遗传变异非常低，而且线粒体单倍型均为 D，可能来源于一次近期的辐射分化。云杉属的现代分布中心之一喜马拉雅-横断山区的物种可能不是一次起源，日本的物种同样如此，这可能与第三纪气候变冷和第四纪冰川导致的物种迁移有关。此外，我们发现目前用于云杉属分类的一些形态性状（如叶扁平、菱形等）在系统发育树上位于不同的位置，说明这些性状可能不是一次起源或是祖征在不同支系中的保留，用于云杉属的系统划分须慎重。 2． 云杉属 CAD 基因的进化研究 裸子植物的多倍体特别少，且以基因组庞大而著称。被子植物中的很多单拷贝基因在裸子植物中以低拷贝或多拷贝基因家族的方式存在。CAD 基因在木质素单体合成的最后一步起作用，在松属中只发现了一种 CAD 基因拷贝，在欧洲云杉中却发现了三种拷贝，而且 Southern 杂交和子代分离鉴定结果表明这三种拷贝至少位于两个位点上。然而，对云杉属三个物种 (包括欧洲云杉) 构建的遗传图谱却都只发现了一个 CAD 基因位点。由于云杉属 CAD 基因的数目和分布存在很大争议，我们根据构建的叶绿体基因树，选择了不同支上的 20 个物种、29 个样品研究该基因的进化式样。结果表明：云杉属不同物种中 CAD 基因的拷贝数为 1-4 种，多数为 2-3 种。系统发育分析发现有些物种的所有 CAD 基因拷贝聚成一支，另有一些物种的 CAD 基因拷贝位于不同位置。此外，我们对 GenBank 中云杉属三个物种 CAD 基因的 EST 序列分析后发现：EST 序列的差异主要发生在 3’-UTR 区，表现为序列长短的不同，这有可能是进行体外反转录时引物结合于不同的位置所致。因此，结合前人研究（包括遗传图谱分析），我们推测 CAD 基因在云杉属内发生了多次重复，重复拷贝很可能呈串联排列。 3. 裸子植物线粒体基因 rps3 的进化研究 线粒体基因内含子的获得/丢失已经被广泛应用于系统发育研究。rps3 为分布最广的线粒体核糖体蛋白基因，一般含一个内含子，前人研究显示其在裸子植物中多了一个第二类内含子 rps3i2，并将这个内含子作为区分裸子植物和其它植物类群的标志之一。然而，该研究只选择了苏铁和银杏作为裸子植物的代表，取样代表性不足。在本研究中，我们对裸子植物每个科至少选择一个物种作为代表，通过 DNA 序列和部分物种的 RT-PCR 分析，探讨 rps3 基因在裸子植物中的进化。结果表明 rps3 基因内含子的分布与裸子植物系统发育关系相吻合：Conifer II、松科的落叶松属和黄杉属及百岁兰科不仅不含 rps3i2，而且丢失了第一个内含子;金钱松属缺失第二个内含子。我们推断在 Conifer II 的祖先和百岁兰科中分别一次性丢失了两个内含子;在松科中则发生了两次单独的丢失事件，一次是在落叶松属和黄杉属的祖先中丢失了两个内含子，一次是在金钱松属中丢失了第二个内含子。另外，在 Ephedra 中没有扩增出 rps3 基因，Gnetum 中具有第二个内含子，倪藤科的 rps3i2 似乎支持松科与倪藤纲的关系更近。对 rps3i2 的进一步分析发现，其序列结构与松科的系统发育关系非常吻合。根据上述结果和 mRNA 编辑位点分析，我们认为 Conifer II等类群中的两个rps3内含子丢失可能是反转录酶介导的 cDNA 反转录造成的。Psuedolarix 的内含子丢失也可能为相同机制，但因缺乏材料而未能进一步研究。

分子标记技术在甘兰型杂交油菜育种上的研究与应用

本文应用RAPD分标记技术对我国重要的油料作物“杂油59”杂种种子的Fl代杂种的纯度进了技术鉴定，并完善了这一技术，摸索出这一适合于目前生产应用的实用方法，填补了这一技术在油菜作物应用上的空白。用RFLP技术对我国重要的雄性不育材料“陕2A”细胞质进行了分子水平的鉴定，为证明“陕2A”是一类新型的雄性不育材料提供了重要的实验证据。 对甘蓝型油菜采用DNA快速提取法、酚仿法和CTAB法应用于不同的分子标记分析，实验结果显示： CTAB法适用于样品量大，纯度要术高的RFLP技术，酚仿法适用于引物筛选、DNA模板用量大的PCR反应，而快速提取法特别适合于生产上对种子纯度检测，是生产上推广前景很好的实用技术。 对甘蓝型油菜RAPD技术应用当中PCR体系的建立进行了探讨。实验结果显示：热启动对PCR结果的影响至关重要。而Mg++浓度、dNTP浓度、模板浓度、Tag酶用量对反应结果有不同程度的影响。经过反复实验：当PCR各组分按Mg++，2mM;dNTP，200uM;模板浓度，50ng - lOOng时，PCR的结果最好。PCR反应条件经反复实验后确定为：第一个循环：（热启动）94℃，Imin20sec．OoC 2min循环一次;第二个循环：（解链）94℃ 50sec，（退火）40℃ Imin30sec;（延伸）72℃lmin;循环40次。第三个循环：72℃lOmin，循环1次。反应总体积为20ul时最为适用。 用40个lOmer的RAPD随机引物对“杂油59”的2个亲本“垦C8”和“陕3A” 进行RAPD分析，共出现290条带，分布于3530-220bp之间。引物opA-06、opK-03、opK-13、opj-12出现阳性扩增。经重复实验后确定： opK-03的PCR结果重复性最好，该引物序列为：CCAGCTTAGG。用它对两个亲本进行RAPD分析，PCR结果共出现9条带，其中510bp、260bp为二条特征带。在Fl代中这两条特征带重现性很好。用50个商品用种萌发的F1单株进行验证，检测结果为3个个体没有出现510bp的特征带，4个个体没有出现260bp的特征带，有5个个体出现了其它带，纯度为78%，与生产用种的纯度相符。 通过对“杂优59”不同生育时期及不同取样部位作酯酶同工酶电泳方法与RAPD方法相比较，结果显示：RAPD方法可以弥补同工酶方法的缺限。由于它是基于基因水平的分析技术，可以不受环境条件、发育时期、取材部位等客观条件的限制，并具有取样量小、易操作、费用低、灵敏度高、可以检测出亲缘关系相当近的种闾或种内的材料，具有独到的优点。是值得今后在生产上推广的新技术。 用6个雄性不育材料线粒体的特异探针：ALXR 18（线粒体ATPaseα亚基）;COB 640(脱辅基细胞色素-b);COX -I（细胞色素氧化酶亚基-I）;COX -Ⅱ（细胞色素氧化酶亚基-II;PDC - 12（胡萝卜线粒体随机片断）;C2（玉米线粒随机片断），对“陕2A”，Hybrides Polima，Ogura NSL 94/96, Ogura MLCH036, Ogura NSL, Polima, Fu27,Fu38, Anand等9个材料进行RFLP分析，结果显示：用限制性内切酶EcoR I消化后的DNA与探针COB 640杂交，“陕2A”材料在4.5 kb处缺失，与ALXR 18探针杂交，在4.4 kb、4.2 kb处也明显缺失，证明“陕2A”显然不同与其它不育材料。用ALXR l8为探针，与用内切酶Nc01的酶切片断作Sourthern杂交，在RFLP谱带上6.1 kb、2.4 kb、2.5 kb处明显缺带，进一步为“陕2A”是一种新型的甘蓝型油莱雄性不育系提供了证据。

毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌遗传多样性对柠条生态系统功能的影响

生物多样性科学（BiodiversityScience）的国际规划提出生物多样性对生态系统功能的影响是整个研究计划五大核心的核心.生物多样性包括遗传、物种和生态系统三个水平,其中遗传多样性是其它两个水平多样性的基础和最终来源.该文在实验室多年研究毛乌素沙地柠条遗传多样性的基础上,分别从表型（生理生化）、蛋白质、同工酶以及遗传型（rDNA）水平探讨中间锦鸡儿根瘤菌的遗传多样性,并模拟沙地生境,建立人工共生体系,以期发现最有效的共生伙伴关系,这不仅有得提高毛乌素地区农牧业产量,更重要的是在当今沙尘暴肆虐的情况下,发挥柠条防风固沙的能力具有现实意义. 1.毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌遗传多样性(1)全细胞可溶性蛋白质谱将供试中间锦鸡儿根瘤菌菌株分为两大类群，其中硬梁覆沙地菌株GH72不同于来自沙丘顶部和底部的菌株，而且中间锦鸡儿根瘤菌独立于参比菌株。酯酶同工酶谱分析表明，中间锦鸡儿根瘤菌与参比菌株仅存在一个等位酶位点差异，其余等位点与参菌株共享，因此，酯酶同工酶反映出中间锦鸡儿根瘤菌的异质性。(2)16SrDNA部分序列与16S-23S rDNA IGS结果表明，所有供试菌株扩增产物均较前人报道的分子量偏高。经16S rDNA PCR-RFLP分析，中间锦鸡儿根瘤菌共形成12种基因型，表现出丰富的遗传多样性，其中属于基因型2的菌株占42.4%。代表菌株GH33 16S rDNA全序列结果显示，与已知的快生型根瘤菌同源性在95%以上。(3）中间锦鸡儿根瘤菌生理生化反应特性B．T．B实验证明所有中间锦鸡儿根瘤菌均产酸，符合快生型根瘤菌的特征．唯一碳源测试显示，95%中间锦鸡儿根瘤菌不利用淀粉，33%菌株不利用乳糖，对其他测试碳源不具有选择性。检洲在不同盐离子浓度、不同酸性梯度以及不同温度条件下菌株生长状况，发现毛乌素沙地中间锦鸡儿根瘤菌具极强的耐盐性．53.8%的菌株可以在9%NaCl的YMA培养基生长．75%的菌株在pH4．O和pHl0,0 环境中仍能生长，66.7%菌株在60℃处理1 0min后仍具有生活力。体现出对于干旱沙地的适应。 2．不同实验共生系统中植物和根瘤菌对生态系统功能的影响14株根瘤菌分与三个柠条种（小叶锦鸡儿，中间锦鸡儿和柠条锦鸡儿）回接，用土壤上覆沙模拟毛乌索沙地景观生态条件，以多石砾贫瘠土壤为对照，比较不同基因型柠条与根瘤菌人工共生体的长和结瘤与生境的关系，初步证明根瘤菌很可能是该生态系统的关键种。寄主植物与共生根瘤菌的遗传多样性对生态系统功能的影响与生态环境有关。实验还表明，选择适当的共生组合对于防治沙漠化有很大潜力。3．银染变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测RAPD遗传模式以85株小钻杨F2代为材料，用本实验室改良的银染变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测RAPD遗传模式。结果表明，仅用9个引物共扩增到399个位点，其中98个位点表现为多态性，卡方测验显示，79个多态位点符合经典的孟德尔遗传(3：1)，占多态位点80.6%。这种改良的检测RAPD标记的方法必将推动RAPD标汜构建连锁图谱的进程。

中国都江堰地区两种林龄森林中外生菌根真菌的多样性

外生菌根是重要的菌根类群，在自然界中分布广泛。外生菌根真菌参与了生物地球化学循环，是森林生态系统中的重要组分。由于外生菌根真菌的宿主植物通常是一些生态系统的优势种和建群种，并且这些真菌还参与了许多森林生态系统的有机和无机元素循环、物种的竞争和共存、生物多样性的维持、生态系统的演替等过程，因而对外生菌根真菌的研究有助于对这些生态系统维持和演替机制的深入理解。作者在中国四川都江堰地区选择了两个不同林龄的森林，应用分子生物学方法，研究了它们的外生菌根真菌群落组成。比较分析了两种年龄亚热带森林下真菌群落的物种组成、密度和多样性的差异，并分析了外生菌根真菌群落与宿主植物群落之间的相互关系，主要研究结果如下： (1) 用分子方法(巢式PCR, RFLP和DNA测序)鉴定了87个土样中的ECM真菌。共检测到70种真菌，属于13目21科30属，其中,子囊菌门5目6科6属8种,担子菌门8目15科24属62种。在担子菌门中，革菌目、红菇目和伞菌目三个目的真菌为常见种。 (2) 成熟林的ECM真菌物种数、密度和物种多样性都显著高于幼林。 (3) 少数几种ECM真菌在群落中占绝对优势，而大多数种类的相对多度和相对频度都较低。重要值（IV）至少在一个样地中大于4.0％的真菌共有12种。成熟林中，IV大于4.0％的ECM真菌有8种，分别是：Russula sp.01，Tomentella sp.01，Tomentella sp.04，Tomentella sp.05，Boletales-01，Lactarius sp.01，Tricholomataceae-01，Leptodontidium sp.01；幼林中IV大于4.0％的真菌有6种，分别是：Lactarius quietus，Russula sp.01，Tomentella sp.01，Tomentella sp.02，Tomentella sp.03， Trechisporales-01。 (4) 成熟林与幼林中的优势属有所不同，成熟林以绵菌属和红菇属最丰富，幼林以乳菇属最丰富，其次是绵菌属和红菇属； (5) ECM真菌群落与乔木群落关系密切，ECM真菌群落物种多样性随着菌根乔木群落物种多样性的增加而增加；ECM群落密度随着非菌根乔木群落密度的增加而降低；ECM群落物种数随着非菌根乔木群落物种数的增加而降低。 (6) ECM真菌群落间的相似性与菌根乔木群落间相似性之间呈显著正相关，即，菌根乔木群落之间越相似，则菌根群落之间也越相似；ECM群落间的相似性与非菌根乔木群落间的相似性之间无相关性。

大白花杜鹃菌根真菌多样性的研究

杜鹃花属(Rhododendron L.)植物分布广泛，研究发现所有的杜鹃花科植物都能形成一种特殊的菌根——杜鹃花类菌根(Ericoid Mycorrhiza)。杜鹃花类菌根对杜鹃花科植物在营养胁迫的环境下生长起到重要的作用。近几年，对杜鹃花类菌根的生物学和生态功能的研究越来越重视。我国是杜鹃花属植物资源最为丰富的国家，因此研究杜鹃花属植物菌根真菌多样性，充分利用杜鹃花特有的菌根资源，促进杜鹃花迁地保护成功具有重大的意义。 本研究以分布较广并且是中国特有的杜鹃花属植物——大白花杜鹃(Rhododendron decorum Franch.)的野生植株为研究对象，应用直接扩增根中真菌ITS区的分子鉴定方法和T-RFLP(末端限制性片段长度多态性)的分析方法，来研究其菌根真菌的多样性；并结合生态化学计量学特征分析、宿主遗传相似性及其群落组成分析等内容，探讨大白花杜鹃的菌根真菌－宿主植物－根际土壤三者之间的关系。主要结果如下： (1)通过用直接扩增真菌ITS区序列，揭示了大白花杜鹃根部真菌的多样性，本研究发现，野生大白杜鹃根部的真菌种类比较丰富，至少有26个ITS-taxa，包括子囊菌和担子菌共5个真菌目：Helotiales、Lecanorales(≡Agyriales)、Onygenales、Sebacinales和Thelephorales，其中包括典型的ERM真菌——树粉孢属Oidiodendron sp.(Myxotrichaceae)真菌。另外还发现了黑色有隔内生菌(Dark septate endophyte，DSE)以及一些未命名的子囊菌。担子菌在本研究中占有较大比例，尤其是蜡壳耳菌目真菌；此外还有较典型的外生菌根真菌——革菌目真菌。 (2)大白花杜鹃野生植株与栽培植株在菌根真菌种类组成上，有一定的相似性；在忽略种源差异等条件下相较而言，前者的物种丰富度远高于后者。 (3)大白花杜鹃菌根真菌多样性和丰富度同它的根际土壤与叶片的C、N、P含量以及C/N、N/P、土壤pH值、宿主的海拔高度等都没有显著的相关关系。 (4)在大白花杜鹃的菌根真菌群落组成方面，整体上保持了相当程度的相似性，同时还保持了一定水平的差异；大白杜鹃菌根真菌的种类是丰富的，优势度指数表明其多样性水平很高。 (5)大白花杜鹃的遗传距离与其菌根真菌群落组成结构有极显著的相关关系，宿主的种内遗传差异可能对菌根真菌群落物种组成产生选择偏好。 (6)大白花杜鹃的群落组成与其菌根真菌群落组成有极为显著的关联性，伴生种的菌根类型可能会影响宿主植物菌根真菌的物种组成结构。

乌珠穆沁羊mtDNA的RFLP研究

用Apa I等7种识别6碱基的限制性内切酶研究了14只乌珠穆沁羊mtDNA的RFLP。结果表明,在所研究的个体中检测到37个酶切位点,17种限制性态型,其中BamH I和Bgl I表现出多态,Xho I无切点。17种限制性态型可归结为3种基因单倍型,mtDNA多态度π值为0.027%,表明乌珠穆沁羊mtDNA多态性比较贫乏。

绵羊、山羊和岩羊mtDNA的RFLP及其遗传分化研究

用15种识别6碱基的限制性内切酶ApaⅠ、BamHⅠ、BglⅠ、BglⅡ、ClaⅠ、DraⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、HaeⅡ、HindⅢ、KpnⅠ、PvuⅡ、PstⅠ、SacⅠ和SalⅠ对绵羊、山羊和岩羊mtDNA的限制性片断长度多态性进行了比较研究,以探讨其遗传分化关系。

Extraction, PCR amplification, and sequencing of mitochondrial DNA from scent mark and feces in the giant panda

To expand the feasibility of applying simple, efficient, non-invasive DNA preparation methods using samples that can be obtained from giant pandas living in the wild, we investigated the use of scent markings and fecal samples. Giant panda-specific oligonucleotide primers were used to amplify a portion of the mitochondrial DNA control region as well as a portion of the mitochondrial DNA cytochrome b gene and tRNA(Thr) gene region. A 196 base pair (bp) fragment in the control region and a 449 bp fragment in the cytochrome b gene and tRNA(Thr) gene were successfully amplified. Sequencing of polymerase chain reaction (PCR) products demonstrated that the two fragments are giant panda sequences. Furthermore, under simulated field conditions we found that DNA can be extracted from fecal samples aged as long as 3 months. Our results suggest that the scent mark and fecal samples are simple, efficient, and easily prepared DNA sources. (C) 1998 Wiley-Liss, Inc.

麂属动物陈旧皮张标本的DNA提取及PCR扩增

用改进的方法从保存于本单位标本中提取DNA, 所得DNA片段的分子量从100bp到1kb以上。利用线粒体DNA细胞色素b通用引物和PCR技术。从小麂、印度麂、贡山麂、费氏麂、黑麂DNA中扩增出307bp的 细胞色素b特异片段(加上两端引物后长度为364bp)。用28种限制性内切酶对 新鲜血样和从陈旧皮张标本中所得扩增片段进行酶切分析, 发现只有4个酶(DraⅠ、xbaⅠ、HaeⅢ、HpaⅡ)在这个片段上有切点, 其中HaeⅢ和HapⅡ的识别位点在各种麂中有所不同。 图3参10

乙醇浸泡蜜蜂标本DNA的提取纯化

利用RAPD、PCR、RFLP、分子杂交等分子生物学 技术研究生物的遗传变异、遗传多态、分子进化等，必 须以DNA作为模板，目前所见有关DNA提取纯化的 报道均用活体或冰冻蜜蜂，这给样品采集、保存带来不 便。本实验以采自云南不同地区以及马来西亚的蜜蜂 乙醇(75％)浸泡标本为材料，参照王文(1994年)的蛋 白酶K提取法并加以改进，对DNA进行提取纯化。

检测HIV-1载量的荧光实时定量PCR技术的建立及其应用

其它部委、高等院校基金;中国科学院基金

滤食性鲢、鳙肠含物PCR-DGGE指纹分析

以采自武汉东湖的滤食性鲢、鳙为对象,通过PCR-DGGE并结合序列分析对其肠道微生物及肠含物中残留的食物组分进行了探索研究。在所有个体中都能检测到不同的PCR-DGGE指纹谱带,其中包括肠道细菌在内的原核谱带较多,真核谱带相对较少;分析结果表明针对鲢、鳙肠含物这一特殊生境样品进行PCR-DGGE指纹分析是可行的。PCR-DGGE指纹结构及针对部分特定PCR-DGGE谱带的序列分析显示,从武汉东湖采集的鲢、鳙在食性上存在很大的重叠,并没有像基于常规食性分析文献报道的那样明显不同。基于肠含物DNA来进行鱼类食