山羊对移植水牛角的免疫反应的实验研究

以山羊为动物模型, 用水牛角作为骨移植材料, 植入到山羊股骨缺损处,检测了移植后的免疫排斥反应。特异性IgG的产生是对照组的3—7倍, 特异性T淋巴细胞转化率为13—21%, 明显高于手术对照组。结果表明, 水牛角移植后, 机体能产生一定强度的免疫反应。表2参5

脱抗原牛角胎骨移植家兔后的特异性免疫反应

目的 研究脱抗原水牛角胎移植后的免疫排斥反应和成骨效应。方法 以日本大耳白兔为动物模型，分别植入经30% H_2O_2、0.6 mol/L HCl脱抗原脱钙，30% H_2O_2脱抗原不脱钙2种温和方法处理的水牛角胎至兔左侧肢骨缺损处。体外检测外周血特异性T淋巴细胞转化率和ELISA检测血清特异性抗角胎IgG抗体。结果 脱抗原脱钙处理显著地降低了角胎的抗原性，与对照相比，未见受体对移植物产生显著的特异性细胞和体液免疫反应（P > 0.05），尤其是脱抗原不脱钙角胎效果更佳。两者成骨效果均良好。结论 脱抗原角胎是一种免疫原性低、成骨效果好、来源方便的骨移植材料。

猪-猕猴延迟性异种移植排斥反应的发生机制

　目的:探讨猪2猕猴延迟性异种移植排斥反应(DXR) 的发生机制。方法:建立湖北白猪2云南猕猴的腹腔异位心 脏移植模型,应用中华眼镜蛇毒因子(Y2CVF) 完全清除受者体内补体,并应用环孢素A(CsA) 、环磷酰胺(CTX) 和甲泼尼龙(M. P) 三联免疫抑制治疗。检测血清C3、C4、抗猪内皮细胞天然抗体,免疫组化方法染色检测移植物中C3、C5b29、IgG、IgM、细胞间 黏附分子21 ( ICAM21) 、肿瘤坏死因子2α(TNF2α) 、单核巨噬细胞(CD68) 、NK细胞(CD57) 、CD4 + T 细胞和CD8 + T 细胞的表达。 结果:移植心存活时间分别为8、10、13 和13 天,血清C3 和补体总活性均下降为0 ,抗猪内皮细胞天然抗体水平在移植后则有 一个更为明显的下降,在移植心失功前2～4 天开始天然抗体稍有回升,但较术前正常时仍明显偏低。移植心有程度不等的 C3、C4、C5b29、IgG及IgM 沉积,大量的单核细胞(50 %) ,少量的NK细胞(8 %～10 %) 、CD4 + T 细胞(15 %) 和CD8 + T 细胞 (25 %) 。移植物血管内皮细胞表面出现ICAM21 的表达上调,移植物间质中出现TNF2α的表达增加。结论:体液免疫和细胞免 疫参与猪2猕猴DXR 排斥反应的发生。

中国株丙型肝炎病毒实验感染3种猕猴的初步结果

选用无各型肝炎病毒感染、体质良好的6只食蟹猴、3只恒河猴和3只熊猴,按人感染HCV的主要途径——输血,经静脉输注含HCV的中国献血员血浆,观察临床一般指标,血清ALT,抗HCV各种抗体和HCV-RNA,肝组织普通病理,超微病理。从肝组织中找病毒颗粒及免疫组化查HCV NS3抗原,观察14周,结果9例猕猴出现不同程度的肝炎症状,12例血清ALT升高,2例出现黄疸;5例抗HCVC22 IgG抗体阳性,4例抗HCV E2-24 IgG抗体阳性,10例抗HCV C33c IgG抗体阳性,2例抗HCVNS4-40 IgG抗体阳性,11例抗HCV NS5-A IgG抗体阳性,无1例抗HCVNS5-B IgG抗体阳性;9例HCV-RNA阳性。6例肝活检或肝小部切除作肝组织普通光镜镜检,5例肝细胞气球样变,点状坏死及少许纤维组织增生。另一例相应损害较重,呈碎片坏死,界板破坏,纤维组织增生明显,汇管区炎性细胞浸润,超微病理除普通炎症所具有的特征外,以滑面内质网大量增生扩张为其主要特征,3例从内质网里看到约30nm的类病毒颗粒。免疫组化显示3只动物肝组织内HCVNS3抗原阳性,以膜型为主少量周边型及散在胞浆内分布,因此我们认为已...

云南眼镜蛇毒因子用于预致敏大鼠同种心脏移植的实验研究

目的观察纯化的云南眼镜蛇毒因子(Y-CVF)对预致敏大鼠同种心脏移植急性体液排斥反应的作用。方法BN大鼠到Lewis大鼠连续3次皮肤移植预致敏后行颈部异位心脏移植。将15对大鼠用随机数字法分成2组,实验组(n=8)于心脏移植前24h静脉给予Y-CVF80μg/kg;对照组(n=7)不用Y-CVF。观察移植心的生存时间,移植心停跳后病理学检查排斥类型,免疫组织化学染色观察移植心IgG和补体C3的沉积。结果Lewis大鼠预致敏后抗BN大鼠抗体滴度由0升高至1∶1028~1∶2056。对照组移植心存活时间为12·71h±13·94h,实验组移植心存活时间为99·50h±38·72h,与对照组比较差异有统计学意义(t=5·599,P<0·01)。病理检查结果证实,实验组均未发生急性体液排斥,仅见以大量单核淋巴细胞浸润为特征的急性细胞排斥反应。对照组则见以小血管内血栓形成为特征的急性体液排斥反应。免疫组织化学IgG染色实验组和对照组均为阳性,C3染色对照组为阳性,而实验组为阴性。结论使用Y-CVF可克服预致敏大鼠同种心脏移植急性体液排斥反应的发生。

猪到猕猴异种心脏移植超急性排斥反应的免疫学及病理学变化

　观察猪到猕猴异种心脏移植超急性排斥反应时的免疫学及病理学变化。方法　 采用猪到猕猴腹腔内异位心脏移植模型,检测发生超急性排斥反应者的血液中补体、天然抗体及T 淋巴细胞亚群的变化,并对移植心脏进行免疫组化(测定C3 、C4 、C5b29 、IgG及IgM 的沉积) 及病理学 分析。结果　发生超急性排斥反应时,血清补体C3 、C4 的含量、总补体活性及抗猪内皮细胞天然抗 体均有一定程度的下降;CD4 + / CD8 + T 淋巴细胞的比率也有所下降;移植心脏中均有补体C3 、C4 、 C5b29 的沉积, IgG及IgM 也均有沉积,但IgG和IgM 沉积强度的差异无统计学意义;病理学改变主 要为心肌间质弥漫性出血、水肿,毛细血管内普遍淤血。结论　补体通过经典途径激活参与猪到猕猴 异种心脏移植超急性排斥反应;超急性排斥反应时受者血中天然抗体水平明显下降;CD4 + T 淋巴细 胞可能参与异种移植超急性排斥反应过程并有所消耗;发生超急性排斥反应的移植物突出病理表现 为间质出血。

人精子抗原决定簇的末端单糖参与小鼠IgA单抗与抗原的结合

对消化道免疫获得的33个抗精子IgA单抗, 12个IgG和35个IgM单抗靶抗原的生化性质及末端单糖做了鉴定。免疫印迹的结果显示, IgA、IgG和IgM类单抗靶抗原的分子量范围分别为10-89、11-75和12-94KDa。有12个单抗的靶抗原为非蛋白类的糖复合物, 一个IgA单抗(A22)的靶抗原为不含糖的蛋白。凝集素封闭和糖苷酶消化试验的结果显示, 98.7%单抗的靶抗原分子末端含一种或几种糖。五种凝集素对IgA类单抗靶抗原的抗原的封闭效应均较强, 表明IgA类单抗靶抗原的抗原决定簇含有岩藻糖、乙酰氨基葡萄糖、乙酰氨基半乳糖、半乳糖和甘露糖等末端单糖者较多。IgG类单抗靶抗原的抗原决定簇则含有带岩藻糖、乙酰氨基半乳糖和#alpha#-甘露糖等末端单糖者较多。内切-#beta#-半乳糖苷酶消化试验的结果表明, 54.4%IgA类单抗的靶抗原为依赖半乳糖苷连接的糖肽化合物。这些结果表明, 经消化道免疫能产生IgA及其它类别抗体的绝大多数人精子抗原为含多种类型末端单糖的膜表面分子。

Effects of testosterone undecanoate as a male contraceptive candidate on rat immunological features

Testosterone undecanoate (TU) is under phase III clinical trial as a hormonal male contraceptive in China. Sex hormones can modulate the immune system. Female hormonal contraceptives may affect SIV/HIV-1 transmission. To evaluate the safety of TU and to understand whether long-term use of TU for a male contraceptive affects users' immunological features, adult male rats were treated for a 32-week TU-treated phase at the dose of 20 mg TU/kg body weight and a 24-week recovery phase. The reproductive and immunological parameters of 4-6 rats in each subgroup were examined at the stated time point. The mean sperm count and viability in the treated rats were significantly suppressed (p < 0.01). In the TU-treated group: the mean blood leukocyte and lymphocyte counts; the proliferation indexes of T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and spleen; and, of B cells from spleen, as well as the mean counts of blood T, NK, and B cells decreased in comparison with those of control group. These decreases were not significant (p > 0.01). Similarly, the mean serum IgM, IgG, and IgA levels and complement activity in TU-treated rats were lower than those in control group (p > 0.01), and the changes in the antibody levels of the examined genital secretions were not significant (p > 0.01). The changes in the thickness of urethra epithelium, and in secretory component (SC) expression in genitals were not observed in the treated group. These results demonstrated that long-term supraphysiological TU injection did not obviously affect the examined rat immunological parameters.

草鱼免疫应答的初步研究

研究了草鱼在不同水温条件下受抗原刺激后其中和抗体的变化。15℃培养条件下中和抗体上升缓慢,9周内滴度低于1:8;20℃时,3周后抗体可上升到1:256,最高达1:5270,而在25℃时,1周中和抗体即达到1:570,最高可达1:20000以上。并探索了从草鱼血清中提纯抗体的条件,研究其抗体的特性。草鱼血清中的抗体为大分子蛋白,容易解离为抗原性相同,分子量近似于人IgG的较小分子,含有较多的二硫键,具有类似IgM的某些特性。

Identification and characterization of a cathepsin L-like cysteine protease from Taenia solium metacestode

Taenia solium metacestode, a larval pork tapeworm, is a causative agent of neurocysticercosis, one of the most common parasitic diseases in the human central nervous system. In this study, we identified a cDNA encoding for a cathepsin L-like cysteine protease from the T solium metacestode (TsCL-1) and characterized the biochemical properties of the recombinant enzyme. The cloned cDNA of 1216 bp encoded 339 amino acids with an approximate molecular weight of 37.6 kDa which containing a typical signal peptide sequence (17 amino acids), a pro-domain (106 amino acids), and a mature domain (216 amino acids). Sequence alignments of TsCL-1 showed low sequence similarity of 27.3-44.6 to cathepsin L-like cysteine proteases from other helminth parasites, but the similarity was increased to 35.9-55.0 when compared to mature domains. The bacterially expressed recombinant protein (rTsCL-1) did not show enzyme activity; however, the rTsCL-1 expressed in Pichia pastoris showed typical biochemical characteristics of cysteine proteases. It degraded human immunoglobulin G (IgG) and bovine serum albumin (BSA), but not collagen. Western blot analysis of the rTsCL-1 showed antigenicity against the sera from patients with cysticercosis, sparganosis or fascioliasis, but weak or no antigenicity against the sera from patients with paragonimiasis or clonorchiasis. (c) 2006 Published by Elsevier B.V.

Preparation of pH-sensitive polymer by thermal initiation polymerization and its application in fluorescence immunoassay

A fluorescence immunoassay for human IgG (Ag) was developed using a pH-sensitive polymer prepared by thermal initiation or redox initiation polymerization as a carrier. In the competitive immunoassay, appropriate quantity of Ag was immobilized on the polymer and the standard Ag (or sample) solution, and a constant amount of fluorescein isothiocyanate labeled goat anti-human IgG antibody (Ab-FITC) was added. Immobilized Ag and the standard (or sample) Ag competed for binding to the Ab-FITC in 37 C in homogeneous format. After changing the pH to separate the polymer-immune complex precipitate, it was re-dissolved and determined by fluorescence method. The results showed that the immobilization efficiency, immunological reaction activities of immobilized Au and phase transition pH range were improved as Ag was immobilized by thermal initiation instead of redox initiation polymerization. Under optimum conditions, the calibration graphs for the Ag in both methods, thermal initiation and redox initiation, were linear over the concentration range of 0.0-1000 ng mL(-1), with detection limits 8 (thermal initiation) and 12 ng mL(1) (redox initiation), respectively. Moreover, some pH-sensitive polymer prepared only in organic solvent or under high temperature could also be used as an immunoreaction carrier by thermal initiation polymerization. Thermal initiation polymerization was a better immobilization mode. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.

An ELISA-like time-resolved fluorescence immunoassay for microcystin detection

Background: A time-resolved fluorescence immunoassay (TRFIA), based on anti-microcystin-LR (MCLR) monoclonal antibodies (MAbs) and europium-labeled antimouse IgG conjugate, was first developed for microcystin detection. Methods: Anti-MCLR MAbs were prepared by a standard method, and the attained MAbs showed a good cross reactivity with MCLR, MCRR and MCYR. The TRFIA was performed in an indirect competitive mode. The detection method of TRFIA was compared with indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and high-performance liquid chromatography (HPLC). Results: The TRFIA exhibited a typical sigmoidal response for MCLR at concentrations of 0.005-50 ng/ml, with a wide quantitative range between 0.01 and 10 ng/ml, indicating the broadest detective range and the most sensitive of all the methods for microcystins (MCs) detection. Additionally, the TRFIA maintained good reliability through its quantitative range, as evidenced by low coefficients of variation (1.6-12.2%). The toxin data of algal samples assayed from TRFIA were in the same range as those with ELISA and HPLC, implying that the method was reliable and practical for the detection of MCs. Conclusions: The TRFIA may offer a valuable alternative or a substitute for conventional ELISA for microcystin detection. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.

电化学SPR生物传感器的研究及应用

围绕论文题目“电化学SPR生物传感器的研究及应用”，我们将SPR传感金膜同时用作电化学研究的界面，在自行组建的电化学SPR (EC-SPR)池中进行了相关的EC-SPR研究。 本论文研究工作的主要内容包括以下几个方面： 1． 发展了一种电化学薄化控制SPR金膜厚度，优化SPR信号的方法。这种方法主要是利用在较高电位下金与氯离子发生络合反应使SPR金膜表面的金部分溶解进入溶液从而达到薄化金基底的目的。通过调节溶液中氯离子的浓度和电化学扫描的次数，可以现场调控SPR基底的金膜厚度。我们用这种处理过的金膜进行了生物分子的吸附试验，结果证明了这种处理过的金膜适用于一般的SPR分析。 2． 采用湿化学镀膜法结合光刻法制备SPR金膜微阵列，拟将用于SPR成像分析。这种方法属于湿化学法制备SPR金膜微阵列，主要是在胶体金纳米粒子的自组装膜上刻蚀出金纳米粒子的微阵列，然后用湿化学法生长出合适的金微阵列。这种方法对制备条件要求比较简单，在制备纳米金微阵列的过程中腐蚀时间比较好控制，同时催化生长出新的金面。重复试验证实了这种方法能够制备出稳定的，尺寸可控的金微阵列，有望用于SPR成像系统研究生物分子相互作用。 3． 在SPR金膜表面利用电沉积法制备了超薄的壳聚糖薄膜，并将之应用于生物分子相互作用的研究。通过一步电沉积的方法制备了超薄的壳聚糖修饰的SPR金基片，并研究了几种常见蛋白与壳聚糖薄膜的非特异性作用，进一步用鼠IgG和抗鼠IgG作为一个典型的例子研究了壳聚糖修饰膜的生物相容性。试验表明壳聚糖修饰膜有好的生物相容性。 4． 首次提出利用生物催化沉积金属纳米粒子放大SPR信号测定小分子的方法。生物小分子抗坏血酸能够还原银离子，使其在金纳米表面沉积形成金属银原子。银原子的沉积将会极大地增强SPR信号，从而实现SPR光谱对小分子抗坏血酸浓度的放大测定。每次测定后，通过电化学剥脱Ag原子，SPR芯片的表面能够完全再生。同时，剥脱的银原子的量也能够被电化学测定，这也实现了抗坏血酸的间接电化学测定。 5． 结合电化学和SPR技术表征了DNA/Zr4+多层膜在金膜表面的生长过程，并研究了这种多层膜与细胞色素c的相互作用。SPR技术被用于测定 (DNA/ Zr4+)1双层中DNA单层的有效膜厚，及其表面覆盖率。利用红外反射光谱和X-射线光电子能谱表征这种多层膜的组成。通过EC-SPR方法，这种多层膜和细胞色素c的相互作用被进一步分析。结果表明这种多层膜不仅增强了细胞色素c的固定量，而且保持了细胞色素c的生物活性。 6． 利用EC-SPR技术测定了聚苯胺支撑的双层磷脂膜中的酶促反应。通过泡囊融合法在聚苯胺表面形成HRP掺杂的磷脂双层膜。这种磷脂双层膜能够很好的保存膜内的辣根过氧化酶(HRP)的活性，同时，这种膜允许质子的跨膜传输，能够提供聚苯胺和HRP在双氧水存在下反应所需的质子，实现酶促开关控制聚苯胺氧化还原态的变化，通过SPR检测这种聚苯胺膜的氧化还原态的变化，从而达到利用SPR测定酶底物小分子的目的。 7． 开展了适配子(aptamer)的EC-SPR研究。利用亚甲基兰为外在电化学探针分子，我们设计了一种简单的、可再生的电化学方法测定小分子腺苷。结果表明这种方法对腺苷的检测具有较高的灵敏性和选择性。这种设计思路有望进一步用于构建一个可再生的SPR传感器平台，用于研究适配子与蛋白质相互作用。

大分子物质的质谱研究

1. 利用解吸化学电离质谱(DCI-MS)，研究了C_(60)与烷基甲醚和伯醇自身化学电离(self-CI)产物之间的气相离子-分子反应，观察到加成离子[C_(60)C_2H_5O]~+和质子化分子[C_(60)H]~+是C_(60)与烷基甲醚等离子体反应的主要产物；相反，没有检测到C_(60)与伯醇离子体系形成的相应加成产物。利用AM1半经验方法对[C_(60)C_2H_5O]~+的十四种可能结构进行了计算。结果表明最稳定的加成产物是[3+2]环加成产物，并提出了该加成产物的形成途径。2. 使用同样方法研究了C_(60)与丙烯酸甲酯离子体系发生的气相离子-分子反应，观察到加成离子[C_(60)C_3H_3O]~+和质子化分子[C_(60)H]~+为主要产物。利用AM1半经验方法对[C_(60)C_3H_3O]~+的八种可能结构进行了计算，结果表明三种环加成产物为最稳定结构。3. 合成了一系列L7和σ因子肽片段，并利用基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)、电喷雾质谱(ESI-MS)和圆二色(CD)对高效液相色谱(HPLC)提纯的合成肽进行了表征。4. 利用ESI-MS研究了L7和σ合成肽与蛋白质G和蛋白质A的复合物，发现了该复合物产生的最佳条件及其稳定性；并结合亲和色谱，证明了L7和σ合成肽与蛋白质G或蛋白质A形成的复合物是具有特异性的非共价复合物。5. 通过竞争酶联免疫吸附实验（ELISA）、亲和色谱和MALDI-MS的联用，发现L7和σ肽与IgG的Fc片断在蛋白质G和蛋白质A的结合位置不同。6. 利用鸡多克隆抗L7抗体通过免疫键合印迹法发现L7和σ肽之间没有交叉反应性。

电化学电容分析法研究

生物分子识别及其之间的相互作用是各种生命运动现象的基础，任何分子层次上的生命科学方面的研究归根到底都是生物分子之间或是生物分子和其他有机、无机分子作用的研究。生物体组织的功能化也正是来源于生物分子活性位点的相互识别。例如，蛋白分子的三维结构组装作用，DNA分子之间及DNA和RNA之间的识别作用构成了生命体的遗传信息，酶对底物的专一催化作用，抗原-抗体的特异结合也是建立在对底物分子的结构识别基础上。因而对生物分子识别及相互作用的研究，可以帮助理解生物分子结构和功能及各种生命运动现象的本质。对生物分子识别进行实时，原位的跟踪监测而无需附加其他的标记分子和修饰等手段，一直是分析化学家研究的重点。本研究论文正是基于此研究思想来构造新型电化学分子识别传感器，并对免疫分子识别，金属离子的检测，磷脂仿生膜的离子诱导效应，自组装膜表面酸碱性及溶胶-凝胶内生物分子性质等方面进行了研究。1.利用电化学电容检测技术和实验装置原理，在金属铝片上通过阳极氧化的方法制备了电容测定所需的绝缘层，并以此层作为电化学测定的对电极，对电容测定起到了关键性的稳定作用，同时避免了在工作电极上烦琐的组装，提高了测定的敏感度。利用金属氧化膜为绝缘层，对protein A和小鼠免疫蛋白G的作用，鼠IgG和羊抗鼠IgG在溶液中的相互作用进行了实时的电容信号测定。表明电化学电容方法和测量装置的可行性。2.将功能化的烷基链自组装于电极表面，对其表面的酸碱平衡进行研究，电容分析方法是方便且直接的测量手段。通过对巯基丙酸的自组装电极的表面酸碱滴定及表面P_(ka)值的测定。讨论了界面电容变化的机理和影响因素。研究结果和应用其他方法测定值相一致。3.将磷脂分子和长链烷基硫醇通过疏水作用组装于金电极表面，在钙离子诱导作用下对该体系进行了电化学电容的测量。通过对电容信号的分析，推测钙离子和磷脂分子作用机理。4.将Sol-Gel技术应用于电容测定的绝缘层和生物分子固定化。通过控制硅醇聚合的酸度和时间，形成极小孔洞的致密的网状结构。利用功能化的硅醇，通过自组装技术将上述聚合产物固定于金电极表面，同时将生物分子聚合固定于溶胶表面或包埋于其网格内。对其电容信号的测定结果表明，该体系是良好的电容分析方法的研究基底。以钾离子传感器为例，研究了本体系的实际应用。将谷胱甘肽固定于溶胶表面，对溶液中的钾离子的电容响应进行测量，表明在较高浓度区有很好的线性。