4 resultados para Gastroenterite

em Universita di Parma


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La gastroenterite eosinofila (GE) è un raro disordine infiammatorio dell’apparato gastroenterico, caratterizzato dalla presenza di un intenso infiltrato di granulociti eosinofili nella parete di uno o più segmenti gastrointestinali, in assenze di altre cause note di ipereosinofilia. Questa patologia infiammatoria, insieme all’esofagite eosinofila, alla gastrite ed alla colite eosinofila configura il gruppo dei disordini gastrointestinali eosinofili (EGIDs eosinophilic gastrointestinal disorders) che rappresentano l’ eosinofilia primaria del tratto gastroenterico. Descriviamo tre casi clinici relativi a tre bambini di sesso maschile, dell’età alla diagnosi, di 8 e 12 anni, diagnosticati e seguiti nel periodo 2008-2012. La particolarità dei casi descritti risiede nella rara presentazione clinica della gastroenterite eosinofila associata ad ipereosinofilia periferica, in particolare nei due pazienti con coinvolgimento delle sierose, che hanno mostrato, all’esordio, un quadro sintomatologico grave e difficile da inquadrare. La malattia, già di per sé poco frequente in età pediatrica, si è manifestata in un paziente con segni e sintomi di infiltrazione della mucosa intestinale che ha causato episodi di vomito ricorrente associato ad un quadro endoscopico di gastropatia iperemica con lacerazione mucosale a livello dell’esofago terminale, mentre negli altri due casi la presentazione clinica della malattia è avvenuta con un quadro ascitico e grave ipereosinofilia. La presenza di abbondante liquido libero in addome ha permesso, in un caso, l’esecuzione di una paracentesi diagnostica, evidenziando all’esame citologico un tappeto di eosinofili. Relativamente a questa forma (“sierosa-predominante”) di gastroenterite eosinofila ed alla diagnosi citologica avvenuta mediante paracentesi, in letteratura esistono pochi case report di pazienti adulti. La conferma diagnostica di gastroenterite eosinofila è stata affidata, in ogni caso, agli esami endoscopici e ai relativi prelievi bioptici della mucosa intestinale, eseguiti a vari livelli dei segmenti esplorati, che hanno permesso di riscontrare un infiltrato eosinofilo patologico, avendo escluso altre patologie, infettive, autoimmunitarie, neoplastiche che, soprattutto in età pediatrica devono essere sempre considerate nella diagnosi differenziale.

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I rotavirus sono la causa più importante di gastroenterite e di decessi ad essa correlati nei bambini al di sotto di 5 anni d’età, specialmente nei paesi in via di sviluppo. Nei paesi industrializzati, dove la mortalità è bassa e la morbilità è molto elevata, l’impatto dell’infezione da rotavirus sulla salute pubblica si ripercuote principalmente sui costi sanitari. Tra i numerosi aspetti che intervengono sulla diffusione e sui possibili veicoli di trasmissione dei rotavirus, uno di particolare rilevanza è la loro elevata variabilità genetica dovuta all’accumularsi di mutazioni puntiformi e alla natura segmentata del genoma che favorisce il riassortimento genico tra ceppi diversi in caso di co-infezione. Come conseguenza e anche sotto la pressione selettiva indotta dal vaccino, è possibile che varianti più resistenti riescano ad emergere e a diffondere rapidamente in una popolazione priva di anticorpi. E’ stato condotto uno studio molecolare dei rotavirus circolanti nell’area di Parma nella popolazione pediatrica ricoverata con gastroenterite in periodi temporalmente distanti (circa 20 anni) con lo scopo di elaborare un quadro epidemiologico molecolare utile ai fini diagnostici e vaccinali e di approfondire i meccanismi evolutivi e il potere patogeno di questo genere di virus. I risultati conseguiti hanno dimostrato che nell’area di Parma l’epidemiologia molecolare dei rotavirus di gruppo A è complessivamente sovrapponibile a quella osservata su scala globale negli ultimi decenni, con il genotipo G1P[8] prevalente e la specificità G9 emersa negli anni più recenti tra quelle maggiormente circolanti. Dai risultati ottenuti è stato anche evidenziato che l’elevata variabilità genetica di questi virus può rivelarsi attraverso l’emergenza di riassortanti intergenogruppo in grado di diffondere rapidamente nella popolazione e potenzialmente capaci di sfuggire alla protezione immunitaria indotta dal vaccino come pure attraverso la comparsa di mutazioni aminoacidiche in geni diversi, verosimilmente in grado di alterare la virulenza e il potere patogeno del virus. Inoltre, lo studio ha permesso di mettere in luce come la trasmissione zoonosica e il successivo riassortimento tra rotavirus umani e animali possano determinare l’introduzione di geni animali in ceppi umani attraverso un meccanismo di rilevante significato nell’evoluzione genetica di questi virus. Lo studio, infine, ha suggerito che l’epidemiologia molecolare dei rotavirus nell’uomo può risentire del recente aumento dei flussi migratori e del commercio internazionale, come farebbe supporre la dimostrazione della circolazione di ceppi di rotavirus di gruppo C nell’area di Parma, in cui, come nel resto d’Italia e in Europa, tali virus erano in precedenza assenti o perlomeno rari.

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Le malattie gastrointestinali sostenute da protozoi patogeni a trasmissione fecale-orale hanno un rilevante impatto in termini di morbilità e mortalità in tutto il mondo, con prevalenza particolarmente elevata nei Paesi in via di sviluppo. Tuttavia, tali infezioni sono diventate un problema non trascurabile per i Paesi industrializzati quali il nostro, in relazione al progressivo e costante aumento di soggetti che per ragioni diverse (turismo, lavoro, opere missionarie, etc.) si recano in aree iperendemiche e ai flussi migratori provenienti dalle stesse, oltre che all’adozione. Il nostro laboratorio infatti riceve numerosi campioni di questi soggetti e di italiani apparentemente privi di fattori di rischio, per i quali non è possibile escludere casi autoctoni di infezione. Tra i protozoi più frequentemente implicati nelle parassitosi intestinali, oltre all’ameba Entamoeba histolytica agente di amebiasi intestinale e viscerale, vi sono due protozoi riconosciuti come agenti di gastroenterite, G. intestinalis e Cryptosporidium spp., e D. fragilis, protozoo a prevalenza crescente nei Paesi industrializzati con ruolo patogeno inizialmente controverso ma ormai chiarito. La diagnosi di parassitosi intestinale, che prevede indagini convenzionali basate sull’analisi di caratteristiche morfo-strutturali e comprendenti l’esame microscopico, la coltura per protozoi ed elminti e la ricerca di antigeni, presenta limiti dovuti alla necessità di personale addestrato e alle difficoltà intrinseche dell’esame parassitologico legate prevalentemente alla scarsa sensibilità e/o specificità dei singoli metodi. Recentemente sono stati sviluppati e proposti diversi saggi di PCR, convenzionale e/o real-time, per la diagnosi di parassitosi intestinale, volti al superamento di tali limiti. Nel nostro laboratorio, dove è da tempo in atto un progetto di ricerca applicato alla diagnostica innovativa delle parassitosi e, in particolare, di quelle intestinali, è già stato sviluppato ed estesamente valutato un saggio molecolare per la diagnosi di amebiasi, con conseguente vantaggiosa applicazione nella pratica diagnostica quotidiana. In questo campo di ricerca applicata si inserisce lo scopo di questo studio che si propone di valutare 3 saggi di real-time PCR per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, rispettivamente, finalizzato alla potenziale applicazione nella pratica diagnostica quotidiana e alla definizione della reale prevalenza dei 3 protozoi nella realtà considerata, che si ipotizza sottostimata in quanto influenzata dai limiti della diagnosi mediante metodi convenzionali. I saggi di real-time PCR, aventi come bersaglio i geni codificanti per l’RNA ribosomiale dei 3 protozoi, sono stati valutati utilizzando campioni di feci appartenenti a pazienti con sospetta parassitosi intestinale inviati presso il nostro laboratorio, a confronto con i risultati ottenuti mediante metodi convenzionali di diagnosi parassitologica, quali l’esame microscopico diretto e previo arricchimento, la ricerca degli antigeni specifici di G. intestinalis e Cryptosporidium spp. mediante saggio immunocromatografico e reazione di immunofluorescenza e la coltura per protozoi per quanto riguarda la ricerca di D. fragilis. I campioni utilizzati per la valutazione dei saggi molecolari erano complessivamente 2770 di 1410 pazienti nel periodo 2006-2010. In particolare, sono stati analizzati 771 campioni di 386 pazienti inviati dal 2006 al 2008, 1040 campioni di 533 pazienti inviati dal 2006 al 2010, 959 campioni di 491 pazienti inviati dal 2006 ad Aprile del 2009, per la valutazione dei saggi per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, rispettivamente. Da un punto di vista analitico i 3 saggi di real-time PCR valutati si sono rivelati altamente sensibili e specifici dimostrando un limite di rivelazione corrispondente ad un ridotto numero di stadi diagnostici (cisti di G. intestinalis e Cryptosporidium spp., trofozoiti di D. fragilis) nel campione di feci e assenza di reattività crociata con il DNA di altri parassiti. I saggi di real-time PCR per la diagnosi di infezione da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis valutati in questo studio si sono dimostrati altamente sensibili e specifici, non solo da un punto di vista analitico ma anche da un punto di vista diagnostico, in quanto oltre a confermare i casi diagnosticati mediante metodi convenzionali hanno rilevato casi aggiuntivi; in particolare hanno rispettivamente permesso di diagnosticare 13 casi aggiuntivi di giardiasi su un totale di 106, 1 caso aggiuntivo di criptosporidiosi su un totale di 13, 60 casi aggiuntivi di dientamoebiasi su un totale di 105. I dati ottenuti dalla valutazione hanno inoltre permesso di delineare la reale prevalenza di G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis, identificandoli come i 3 protozoi patogeni più frequenti tra i pazienti con sospetta parassitosi intestinale nella nostra realtà. Il saggio di real-time PCR per la diagnosi di infezione da D. fragilis, in particolare, si è dimostrato di grande utilità ed adeguato per l’applicazione alla pratica diagnostica quotidiana, in quanto quasi il 60% dei casi è stato rilevato mediante il solo saggio molecolare. Di particolare interesse è il risultato ottenuto relativamente al sequenziamento dei campioni positivi per D. fragilis, tra i quali 5 campioni presentavano una sequenza potenzialmente attribuibile al genotipo 2 ad oggi riconosciuto in soli 2 isolati al mondo. La rarità del genotipo 2 e i risultati ottenuti nel presente studio aprono la base a futuri studi mirati alla determinazione di eventuali differenze nelle modalità di trasmissione e nelle manifestazioni cliniche, tra i due genotipi noti. I saggi di real-time PCR per la ricerca del DNA di G. intestinalis e Cryptosporidium spp., invece, non si sono rivelati nella nostra esperienza sufficientemente vantaggiosi rispetto ai metodi convenzionali; pertanto la loro applicazione in diagnostica potrebbe essere utile in futuro solo se inclusi in una reazione di tipo multiplex, con conseguenti vantaggi in termini di costo e di minore complessità dell’allestimento. È stata inoltre compiuta la genotipizzazione dei ceppi di G. intestinalis identificati in questo studio, volta all’identificazione dei genotipi A e B, gli unici riscontrabili nell’uomo, eseguita attraverso l’analisi del polimorfismo nella lunghezza dei frammenti di restrizione del gene codificante per la proteina β-giardina del protozoo. La genotipizzazione di G. intestinalis ha mostrato un risultato compatibile con i dati europei ma in contrasto con i dati italiani, rivelando una maggiore prevalenza del genotipo B (66,2%) rispetto al genotipo A (33,8%), sebbene non sia stato possibile genotipizzare una parte dei campioni, probabilmente a causa del fatto che il bersaglio di amplificazione è presente in singola copia nel genoma del protozoo e/o di potenziali “mismatches” nelle sequenze complementari ai primer. In futuro eseguendo la genotipizzazione basandosi sull’analisi dei polimorfismi di diversi geni contemporaneamente potranno essere completati gli studi di genotipizzazione del protozoo chiarendo le differenze al momento osservate tra i nostri dati in accordo con quelli europei e i dati di altri studi italiani. I risultati di questo studio hanno messo a disposizione saggi pronti all’applicazione in diagnostica e dati importanti relativi all’epidemiologia delle infezioni da G. intestinalis, Cryptosporidium spp. e D. fragilis ed infine hanno contribuito ad estendere conoscenze sulla distribuzione nella nostra realtà dei genotipi di G. intestinalis e di D. fragilis che infettano l’uomo.

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Nell'uomo l'infezione da rotavirus (RV) è considerata la principale causa di gastroenterite nei primi anni di vita, si stima che l’infezioni causi circa 450.000 morti l’anno soprattutto nei paesi in via di sviluppo. I RV, appartenenti alla famiglia Reoviridae, sono virus privi di pericapside con un diametro di circa 70 nm, dotati di un capside trilaminare, al cui interno sono racchiusi 11 segmenti di RNA bicatenario. Due segmenti virali codificano per le proteine esterne del capside, denominate VP7 e VP4, che sono alla base della nomenclatura binomiale adottata per la loro classificazione genetica. A oggi sono stati identificati 37 G-tipi (VP7) e 27 P-tipi (VP4), ma solo 6 G/P combinazioni genetiche contribuiscono in modo considerevole alla patologia di RV nella popolazione mondiale (G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8] e G12P[8]). L’elevata variabilità di RV è causata da fenomeni di riassortimento genico, accumulo di mutazioni puntiformi e riarrangiamento genetico. Attualmente, due vaccini orali contro RV RotarixTM (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Belgium) e RotaTeqTM (Merk & Co., Inc., Whitehouse Station, USA) sono in commercio in numerosi Paesi del mondo. Limitate sono le conoscenze sulle correlazioni molecolari tra la circolazione dei ceppi di RV in questi ultimi anni e quelli vaccinali. Pertanto la caratterizzazione molecolare dei ceppi circolanti di RV è essenziale per svelare il loro make-up genetico, monitorare la comparsa di nuovi ceppi e aumentare le conoscenze sui meccanismi evolutivi. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di approfondire lo studio delle dinamiche evolutive di RV attraverso la caratterizzazione molecolare dei ceppi circolanti nell’area di Parma e comprendere le dinamiche epidemiologiche di questi virus. Sono stati caratterizzati geneticamente le sequenze VP4 e VP7 di 445 RV rivelati nell’ambito delle indagini condotte su 3045 bambini con gastroenterite afferenti dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma nel periodo gennaio 2008-dicembre 2012 (prevalenza d’infezione da RV: 14,61%). La prevalenza annuale di infezione da RV è variata dal 15,84% nel 2010 al 11,63% nel 2012. Solitamente ogni anno numerosi ceppi circolano in una determinata area e di anno in anno alcuni ceppi prevalgono su altri. Tra questi G1P[8] resta quello maggiormente diffuso sia nei paesi industrializzati che in quelli in via di sviluppo. Anche a Parma nel periodo di sorveglianza il genotipo maggiormente frequente è stato G1P[8] con una prevalenza del 65,61% (292/445) confermando quanto già osservato in studi di sorveglianza precedenti condotti nella stessa area e in genere negli ultimi decenni a livello mondiale. Oltre G1P[8] i genotipi di RV maggiormente circolanti sono stati G4P[8] nel 8,74% (39 casi), G3P[8] nel 4,26% (19 casi), G2P[4] nel 4,04% (18 casi) e G9P[8] nel 2,47% (11 casi). Inoltre sporadicamente hanno circolato ceppi con combinazioni rare: G1P[4] nel 0,44% (2 casi) e ceppi G3P[4], G3P[6], G6P[9] nello 0,22% ciascuno (1 caso) e combinazioni di derivazione bovina: G10P[14] e G8P[14] nello 0,22% ciascuno (1 caso). La predominanza del genotipi G1P[8] è stata particolarmente significativa negli anni 2010 (71,1%) e 2011 (96,4%). L’analisi filogenetica condotta su una selezione di ceppi G1P[8] non ha dimostrato particolari differenze nella segregazione delle sequenze nucleotidiche. Tuttavia l’analisi delle sequenze aminoacidiche dedotte ha dimostrato diverse sostituzioni nei ceppi circolanti in quel periodo non presenti nei ceppi circolanti in anni precedenti. Pertanto è possibile ipotizzare che tali sostituzione possano aver contribuito alla maggiore prevalenza di questo genotipo in quegli anni. La sorveglianza dei genotipi di RV ha dimostrato anche che il genotipo G4P[8], sebbene subisca marcate fluttuazioni di prevalenza nel corso degli anni, è tra i più frequenti dopo G1P[8] e G3P[8]. L’analisi filogenetica condotta sui geni VP7 e VP4 di ceppi G4P[8] di RV rivelati in 2 periodi distinti di sorveglianza (2004-2005 e 2008-2012), ha dimostrato che nonostante i numerosi lignaggi fin ora descritti in letteratura i ceppi G4P[8] circolanti nell’area di Parma hanno mantenuto per quasi un decennio l’assetto G4-Ic e P[8]-III e che le relative sequenze segregavano negli alberi filogenetici con un profilo temporale di evoluzione. Messe a confronto con il ceppo prototipo G4, le sequenze aminoacidiche di VP7 dei ceppi G4P[8] di Parma hanno mostrato la presenza di una inserzione e diverse sostituzioni aminoacidiche confermando i ritrovamenti avvenuti in altri Paesi. Anche il confronto delle sequenze aminoacidiche nella regione ipervariabile VP8* di VP4 a confronto con il ceppo di riferimento della specificità P[8]-III ha mostrato diverse sostituzioni. La progressiva variazione di VP7 e VP4 è in accordo con il potere evolutivo di RV basato sull’accumulo di mutazioni puntiformi. Differenze intra-genotipiche sostanziali sono state riscontrate anche nei siti putativi di neutralizzazione tra i ceppi di Parma e i ceppi vaccinali. Pertanto, soltanto la continua sorveglianza dei genotipi di RV permetterà di monitorare la comparsa di nuovi ceppi e/o lignaggi genetici e verificare la significatività delle mutazioni osservate. Inoltre, alla luce delle limitate informazioni sulla variabilità genetiche di VP4, in questo studio è stato verificato se la continua predominanza dei RV con specificità P[8] e se le fluttuazioni delle prevalenze dei ceppi con questa specificità in combinazione con diverse specificità G (G1, G3, G4, G9) potessero dipendere da possibili variazioni genetiche sul gene VP4. A tale scopo è stata condotta un’analisi filodinamica sulla sequenza VP4 di ceppi circolanti dal 1987 al 2012 che ha dimostrato che tutti erano di lignaggio P[8]-III, nell’ambito del quale erano suddivisi in molteplici sublignaggi. In particolare si distinguevano sublignaggi associati a sequenze con discreta variabilità genetica appartenenti a ceppi circolanti negli anni contraddistinti da una maggior prevalenza e sublignaggi comprendenti sequenze con una più alta omologia nucleotidica, appartenenti a ceppi circolanti negli anni contraddistinti da una minor prevalenza, confermando che la circolazione di questi ceppi correla con cambiamenti della sequenza VP4 di lignaggio P[8]-III. Infine, il ritrovamento di un tasso di mutazione di 3,04 x 103 (mutazioni/sito/anno) sottolinea l’elevata variabilità genetica di questo virus al pari di altri virus a RNA. Altro dato degno di nota è stata la caratterizzazione molecolare di un ceppo di RV,l’unico agente infettivo ritrovato nelle feci e nel liquor di una bambina con gastroenterite associata a meningismo e mai decritta prima in Italia. Il ceppo è risultato appartenere al genotipo G1P[8] e ha mostrato sostituzioni aminoacidiche all’interno del sito di legame della proteina NSP4, all’interno della regione ipervariabile della proteina VP4, nota contenere gli epitopi antigenici, a livello del dominio di dimerizzazione e del dominio di legame del fattore eucariotico di inizio della traduzione della proteina NSP3, nota essere responsabile della diffusione extraintestinale. È verosimile ipotizzare che tali mutazioni possano aver influenzato la conformazione e/o l’attività di tali proteine modificando la patogenicità del ceppo e permettendone la diffusione dall’intestino al SNC. In conclusione, la realizzazione di questo studio ha permesso di ottenere un quadro epidemiologico-molecolare significativo e aggiornato dei ceppi di RV circolanti nell’area di Parma in un periodo relativamente lungo. Sebbene in Italia i dati di copertura del vaccino non siano ancora disponibili, la continua sorveglianza delle infezioni da RV ha permesso di dimostrare nell’area di Parma una rilevante riduzione (circa del 30%) della prevalenza di infezione da RV dopo l’introduzione in commercio dei vaccini nel 2006, passando da 34,5% nel 2005 all’11,6% nel 2012. Soltanto la continua sorveglianza dei genotipi di RV permetterà di verificare l’efficacia dei vaccini e monitorare l’eventuale emergenza di certi genotipi e/o la comparsa di nuovi ceppi e/o lignaggi genetici. Inoltre questo studio ha messo in luce che le conoscenze dell’aspetto genetico dei RV sono indispensabili per comprendere i meccanismi evolutivi responsabili dei vantaggi selettivi che taluni genotipi possono acquisire.