Inibição do receptor de glutamato do tipo NMDA em um modelo de hipóxia-isquemia prenatal: avaliação morfofuncional do cerebelo

Lesões sistêmicas peri e pré-natais alteram o desenvolvimento do SNC, levando a problemas cognitivos e motores em crianças que podem perdurar por toda a vida. Um tipo particular de lesão é a hipóxia-isquemia (HI), caracterizada pela interrupção momentânea ou permanente do fluxo sanguíneo. Um dos mecanismos propostos para as lesões decorrentes da HI é a excitotoxicidade glutamatérgica. O uso de inibidores da neurotransmissão glutamatérgica tem sido estudados em diversos modelos de HI. Neste trabalho, avaliamos os efeitos morfofuncionais da administração de um antagonista não-competitivo do receptor de glutamato NMDA sobre o desenvolvimento do cerebelo. Ratas no 18 dia de gestação foram anestesiadas, os cornos uterinos expostos e as 4 artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo H). Animais controle tiveram os úteros expostos, sem a obstrução (Grupo S). Após a cirurgia a gestação prosseguiu. Somente animais nascidos a termo foram utilizados. Um dia após o nascimento, metade de cada ninhada foi designada para receber MK801, 0,3mg/kg/dia, (grupos SM e HM) e a outra metade recebeu solução salina (grupos SS e HS), por 5 dias. Após anestesia e perfusão-fixação com paraformaldeído 4% aos 9, 23, 30 e 60 dias pós-natais, cortes parassagitais do cerebelo foram obtidos em criótomo e submetidos à imunohistoquímica para calbindina, GFAP, GLAST, PDGFRα e MBP. A partir de 45 dias de vida, os animais foram testados em vários de testes comportamentais: labirinto em cruz elevado (LCE), campo vazado (CV), ROTAROD, teste de caminhada sobre barras (ladder test) e teste do comprimento da passada (stride length). Aos 9 dias, a espessura da árvore dendrítica era menor nos animais SM, HS/HM, demonstrando efeitos deletérios tanto do MK801 quanto da HI. Menor número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HS/HM, sem efeitos da administração de MK801. Aos 23 dias, maior número de células PDGFRα+ foi observado nos animais HM comparado aos outros 3 grupos, indicando efeito neuroprotetor do MK801. Nessa idade, menor número de fibras mielinizadas (MBP+) foi observada nos animais HS, e a administração de MK801 parece reverter estes efeitos. Aos 9 dias a distribuição de GLAST estava alterada nos animais HS, com os efeitos da HI parcialmente revertidos pelo MK801. Não foram observados efeitos da HI ou do MK801 sobre comportamentos relacionados a ansiedade pelo LCE, assim como na latência de queda no ROTAROD. HI piora a performance motora no ladder test. No teste do CV, não observamos efeitos da HI sobre a busca por novidade assim como sobre a atividade locomotora espontânea. No entanto, MK801 diminui comportamentos de autolimpeza e a atividade locomotora espontânea. Menor variação das passadas foi observada em decorrência da administração de MK801 no stride length, com nenhum efeito da HI. Nossos resultados demonstram que a inibição do receptor NMDA tem um efeito neuroprotetor sobre os progenitores de oligodendrócitos e mielinização, provavelmente pela manutenção da capacidade proliferativa por um período maior. A atividade do receptor NMDA exerce importante papel na diferenciação das células de Purkinje, assim como na distribuição do transportador GLAST, corroborando a importância deste receptor na gênese das lesões causadas pela HI.

Efeitos da hipóxia-isquemia perinatal sobre o comportamento motor, distribuição da Tirosina Hidroxilase na substância negra e da NADPH diaforase no hipocampo durante o desenvolvimento em ratos

A hipóxia isquemia (HI) pré-natal é uma das principais causas de mortalidade e doenças neurológicas crônicas em neonatos, que podem apresentar déficits remanentes como: retardamento, paralisia cerebral, dificuldade de aprendizado ou epilepsia. Estes prejuízos, provavelmente, estão relacionados com o atraso no desenvolvimento neural, astrogliose e com a perda de neurônios e oligodendrócitos. Déficits funcionais e cognitivos estão associados à degeneração de vias dopaminérgicas e de estruturas hipocampais. A enzima tirosina hidroxilase (TH) é a enzima limitante na síntese de dopamina e seus níveis são alterados em eventos de HI. O óxido nítrico (NO) é um gás difusível que atua modulando diferentes sistemas, participando de eventos como plasticidade sináptica e neuromodulação no sistema nervoso central e é produzido em grandes quantidades em eventos de injúria e inflamação, como é o caso da HI. O presente estudo teve por objetivos avaliar, utilizando o modelo criado por Robinson e colaboradores em 2005, os efeitos da HI sobre o comportamento motor e avaliar o desenvolvimento de estruturas encefálicas relacionadas a este comportamento como a substância negra (SN) e o complexo hipocampal. A HI foi induzida a partir do clampeamento das artérias uterinas da rata grávida, por 45 minutos no décimo oitavo dia de gestação (grupo HI). Em um grupo de fêmeas a cirurgia foi realizada, mas não houve clampeamento das artérias (grupo SHAM). A avaliação do comportamento motor foi realizada com os testes ROTAROD e de campo aberto em animais de 45 dias. Os encéfalos foram processados histologicamente nas idades de P9, P16, P23 e P90, sendo então realizada imunohistoquímica para TH e histoquímica para NADPH diaforase (NADPH-d), para avaliação do NO. Nossos resultados demonstraram redução da imunorreatividade para a TH em corpos celulares na SN aos 16 dias no grupo HI e aumento na imunorreatividade das fibras na parte reticulada aos 23 dias, com a presença de corpos celulares imunorreativos nesta região no grupo HI. Demonstramos também aumento do número de células marcadas para NADPH-d no giro dentado nos animais HI, nas idades analisadas, assim como aumento na intensidade de reação no corno de Ammon (CA1 e CA3) aos 9 dias no grupo HI, e posterior redução nesta marcação aos 23 e 90dias neste mesmo grupo. Nos testes comportamentais, observamos diminuição da atividade motora no grupo HI com uma melhora do desempenho ao longo dos testes no ROTAROD, sem entretanto atingir o mesmo nível do grupo SHAM. Os animais HI não apresentaram maior nível de ansiedade em relação ao grupo SHAM, descartando a hipótese das alterações observadas nos testes de motricidade estarem relacionadas a fatores ansiogênicos. O modelo de clampeamento das artérias uterinas da fêmea se mostrou uma ferramenta importante no estudo das alterações decorrentes do evento de HI pré-natal, por produzir diversos resultados que são similares aos ocorridos em neonatos que passam por este evento.

Papel dos receptores β-adrenérgicos no reparo cutâneo de lesões crônicas em camundongos: modelo não invasivo de lesão por isquemia e reperfusão

Os receptores β1- e β2-adrenérgicos estão presentes em inúmeras células que participam do processo de reparo como fibroblastos, queratinócitos, células inflamatórias e células endoteliais. Diversos trabalhos demonstram que estes receptores modulam o processo de reparo tecidual. Entretanto, nenhum trabalho demonstrou se o bloqueio destes receptores compromete o reparo de úlceras de pressão. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos no reparo de úlceras de pressão em camundongos, para isto utilizamos um modelo não invasivo de lesão por isquemia e reperfusão. No presente estudo, utilizamos animais que foram tratados por gavagem com propranolol (um antagonista não seletivo dos receptores β1- e β2-adrenérgicos). A administração do antagonista teve início um dia antes do início dos ciclos de isquemia e reperfusão e se manteve diariamente até a eutanásia. Para desenvolver a úlcera de pressão, um par de magnetos foi aplicado no dorso dos animais previamente depilado. O período de permanência do magneto é caracterizado como período de isquemia, enquanto sua retirada é caracterizada como período de reperfusão. Os ciclos de isquemia e reperfusão foram repetidos duas vezes, e ao final do último ciclo, duas úlceras circulares foram criadas no dorso dos animais. Os animais foram mortos 3, 7, 14 e 21 dias após a lesão. Após o último ciclo de isquemia, o fluxo sanguíneo da área comprimida foi nulo, 7 horas após a compressão o fluxo sanguíneo estava elevado, com níveis superiores ao da pele normal. Após 24 e 48 horas, o fluxo sanguíneo estava reduzido e abaixo dos níveis da pele normal. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou os níveis de peróxidos lipídicos 3 dias após a lesão, comprometeu a migração dos queratinócitos, levando a um aumento da proliferação epitelial, resultando em uma re-epitelização atrasada. O retardo na formação da neo-epiderme induzido pelo bloqueio destes receptores prejudicou a remoção do tecido necrótico. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou o número de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos), os níveis proteicos de elastase neutrofílica 3 dias após a lesão e reduziu os níveis proteicos de MCP-1 3 dias após a lesão e os níveis proteicos de MMP-12 7 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou a proliferação celular e apoptose no tecido conjuntivo 7 dias após a lesão e aumentou a densidade de vasos sanguíneos 14 e 21 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos retardou a diferenciação miofibroblástica e reduziu os níveis proteicos de TGF-β 1/2/3 3 dias após a lesão e a contração da lesão. Vinte e um dias após a lesão, o bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou a espessura da neo-epiderme e a expressão de tenascina-C em fibroblastos e reduziu a deposição de colágeno. Em conclusão, o bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos atrasa o reparo tecidual em úlceras de pressão.

Efeito do pré-condicionamento isquêmico remoto em modelo de lesão hepática por isquemia-reperfusão em ratos

A lesão por isquemia-reperfusão (I/R) é o mecanismo fisiopatológico central no desenvolvimento da insuficiência hepática pós-operatória. Diversas estratégias para minimizar suas consequências estão sendo desenvolvidas, mas ainda sem resultados satisfatórios. Recentemente o pré-condicionamento isquêmico remoto (PCIR), método em que ciclos breves de I/R aplicados em um órgão ou membro é capaz de atenuar os resultados da I/R em um órgão distante, vem sendo utilizado, em modelos experimentais, com resultados promissores. No entanto seu mecanismo de ação ainda não foi esclarecido. Um dos mecanismos propostos é a modulação na expressão das citocinas sintetizadas durante a resposta inflamatória que acompanha o processo de I/R. Foram utilizados 36 ratos (Rattus norvegicus), machos, com peso entre 250 e 280 g, divididos em três grupos: Grupo Sham, cirurgia simulada; Grupo IR, isquemia de 70% do fígado por 45 minutos e reperfusão; e Grupo PCIR, pré-condicionamento isquêmico remoto do fígado através de seis ciclos de isquemia-reperfusão da pata do animal, com quatro minutos de isquemia e quatro minutos de reperfusão em cada ciclo, seguido de isquemia hepática semelhante ao do Grupo IR. Terminado os procedimentos cirúrgicos, metade dos animais foi morta decorridos 60 minutos de reperfusão, e a outra metade após 180 minutos. Foi coletado tecido hepático do lobo submetido à isquemia, para estudo histopatológico, utilizando o índice de injúria hepática modificado; e sangue, para dosagem plasmática de TNF-α, IL-6, IL-10 e ALT. A análise histopatológica mostrou que a necrose celular foi significativamente reduzida no Grupo PCIR quando comparado com Grupo IR (p <0,0001). As transaminases mostraram o mesmo padrão com redução significativa dos seus valores no Grupo PCIR quando comparados com o Grupo I-R (p <0,0001). A dosagem das interleucinas mostrou redução significativa na expressão da IL-6 no Grupo PCIR quando comparado com o Grupo IR (p<0,001). Houve aumento da expressão de IL-10 nos grupo PCIR, porém não atingiu significância estatística. Não foi identificada diferença na dosagem de TNF-α nos grupos estudados. O PCI-R foi eficaz na redução na necrose celular resultante da lesão por I-R nos grupos estudados. A redução na síntese de IL-6 segue o padrão observado em outros estudos.

Efeitos da hipóxia-isquemia pré-natal durante o desenvolvimento: receptores e transportadores glutamatérgicos e comunicação celular in vitro

O cérebro infantil humano submetido à hipóxia-isquemia (HI) apresenta perda de oligodendrócitos, hipomielinização, astrogliose, alterações no desenvolvimento cortical e no comportamento motor, incluindo a paralisia cerebral. O cerebelo desempenha um importante papel no controle motor e diversos danos vêm sendo observados em humanos e animais que sofreram HI. A excitotoxicidade glutamatérgica é frequentemente associada à HI e junções celulares podem ser responsáveis pela transferência de moléculas capazes de modular os danos decorrentes. Dados prévios de nosso grupo utilizando um modelo de HI pré-natal em ratos demonstraram danos permanentes na estrutura cerebelar, indicando que os efeitos deletérios da HI pré-natal podem ser mantidos até a vida adulta. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os níveis de conexinas, receptores e transportadores de glutamato ao longo do desenvolvimento do cerebelo HI, e avaliar a configuração das junções celulares em culturas de astrócitos derivadas do cerebelo de ratos submetidos a esse modelo. Ratas no 18 dia de gestação, após anestesia, tiveram as quatro artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo HI). Animais controle tiveram os úteros expostos sem sofrer a obstrução (Grupo SH). A gestação prosseguiu e apenas filhotes nascidos a termo foram utilizados. Os animais foram decapitados aos 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16),23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) dias pós-natal. Os cerebelos foram submetidos à técnica de Western blotting utilizando os anticorpos anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP e anti-Cx43. Para a cultura de astrócitos foram utilizados cerebelos de animais P2. Após terem atingido confluência, as células foram fixadas e imunomarcadas com os anticorpos anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestina e anti-A2B5. Nossos resultados demonstram diferenças nos níveis de GluR3 durante o desenvolvimento do cerebelo SH e HI, havendo uma redução significativa da expressão desta subunidade no grupo HI em P9. Por outro lado, não foram verificadas alterações nos níveis de NR2B e de GFAP entre os grupos nas diferentes idades. Observou-se redução significativa de Cx43 em animais HI em P2 bem como nos astrócitos HI em cultura, os quais também apresentaram alterações morfológicas e diferenças na expressão do marcador A2B5. A alteração referente a GluR3 no grupo HI pode ser causada pela redução da arborização das células de Purkinje e pela redução no número de precursores de oligodendrócitos no cerebelo de animais HI em P9, já observadas em nosso laboratório. A diminuição de Cx43 indica que a passagem de substâncias por canais astrocitários pode estar reduzida e contribuir para a expansão dos danos persistentes descritos em HI. Alterações morfológicas e na expressão de marcadores da diferenciação de astrócitos podem refletir os potenciais efeitos de HI sobre a maturação destas células a longo-prazo. Nossos resultados apontam que a HI sistêmica pré-natal pode ser responsável por alterações que caracterizam a excitotoxicidade glutamatérgica. Ressaltamos também a importância da comunicação entre astrócitos como estratégia neuroprotetora nesta lesão.

Distribuição da caspase-3 clivada no cerebelo de ratos durante o desenvolvimento em um modelo de hipóxia-isquemia sistêmica pré-natal

A Hipóxia-isquemia (HI) perinatal é um problema de saúde pública, e ocorrem aproximadamente 1,5 casos de encefalopatias por HI por 1000 nascidos vivos. Dos que sobrevivem 25-60% sofrem de deficiências permanentes do desenvolvimento neurológico, incluindo paralisia cerebral, convulsões, retardo mental, e dificuldade de aprender. Neurônios e oligodendrócitos, especialmente os progenitores, são os mais afetados pela HI. Existem vários modelos de HI, no entanto, poucos levam em consideração as intercorrências maternas, a importância da atividade placentária, e as trocas entre mãe-filho, que são clinicamente observadas em humanos. Robinson estabeleceu um modelo de HI sistêmica pré-natal transitório, onde o fluxo das artérias uterinas da rata grávida era obstruído por 45 minutos no décimo oitavo dia (E18) de gestação. Neste modelo foram observadas alterações que são similares às observadas em cérebros humanos que passaram por hipóxia perinatal, dentre as quais foram relatados aumento no nível de apoptose. Caspase-3 é descrita como uma enzima que atua na apoptose, e é amplamente utilizada como marcador para células apoptóticas. Vários autores vêm mostrando, entretanto, que a enzima caspase-3 pode estar ativada para fins não apoptóticos. No modelo de HI sistêmica pré-natal, foram observados astrogliose na substância branca, morte de oligodendrócitos, lesão em axônios tanto na substância branca como no córtex cerebral, e danos motores. Pouco se sabe da influencia do insulto HI no desenvolvimento do cerebelo, considerando que o cerebelo junto com o córtex motor, contribui para o controle motor. O objetivo desse trabalho foi avaliar a distribuição da caspase-3 clivada durante o desenvolvimento do cerebelo em um modelo de HI pré-natal. Os resultados deste trabalho demonstram que as células caspase-3 clivadas apresentaram duas morfologias distintas em ambos os grupos. Uma onde a caspase-3 foi observada apenas no núcleo, oscilando entre células com imunorreatividade fraca a intensa, e de células com a presença da caspase-3 no corpo celular, nos prolongamentos condensados e presença de fragmentos ao redor do soma, morfologia típica de célula em apoptose. A HI pré-natal, assim como nos hemisférios cerebrais, levou ao aumento de células caspase-3 clivadas com morfologia de progenitores de oligodendrócitos no cerebelo do grupo HI em P2, mas não em P9 e P23. Também foi demonstrado que a HI pré-natal não levou a uma ativação da apoptose em oligodendrócitos, neurônios e microglia (identificados por seus respectivos marcadores, CNPase, NeuN e ED1) apresentando marcação no núcleos de células GFAP+, na substância branca, camada granular e nas células da glia de Bergmann, em P9 e P23 no cerebelo. Podemos concluir que a HI pré-natal aumentou o número de células imunorreativas para a caspase-3 em um período crítico do desenvolvimento da oligodendroglia no cerebelo, e que a diminuição de progenitores de oligodendrócitos no cerebelo decorrente do insulto pré-natal visto em trabalhos anteriores, pode estar relacionada a morte celular por apoptose, embora não se possa descartar a hipótese da participação dessas células que apresentam caspase-3 clivada em outros eventos não apoptóticos desencadeados pela hipóxia-isquemia.

Avaliação morfofuncional do complexo hipocampal em ratos submetidos a um modelo de hipóxia-isquemia pré-natal

A diminuição do aporte de oxigênio e nutrientes na vida perinatal resulta em danos, como astrogliose, morte de neurônios e de células proliferativas. Déficits cognitivos podem estar relacionados a danos no hipocampo. Neste trabalho avaliamos a citoarquitetura do giro dentado (DG) durante o desenvolvimento e a memória de ratos submetidos à HI. Para tal, utilizamos a técnica de imunohistoquímica para marcador de proliferação celular (KI67), neurônio jovem (DCX), de astrócitos (GFAP) e de óxido nítrico sintase neuronal (NOSn). Para avaliar a memória de curta e de longa duração foi utilizado o teste de reconhecimento de objetos (RO). Ratas Wistar grávidas em E18 foram anestesiadas (tribromoetanol) e as quatro artérias uterinas foram ocluídas com grampos de aneurisma (Grupo HI). Após 45 minutos, os grampos foram removidos e foi feita a sutura por planos anatômicos. Os animais do grupo controle (SHAM) sofreram o mesmo procedimento, excetuando a oclusão das artérias. Os animais nasceram a termo. Animais com idades de 7 a 90 dias pós-natal (P7 a P90), foram anestesiados e perfundido-fixados com paraformaldeído a 4%, e os encéfalos submetidos ao processamento histológico. Cortes coronais do hipocampo (20m) foram submetidos à imunohistoquímica para KI67, DCX, GFAP e NOSn. Animais P90 foram submetidos ao RO. Os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética (CEA/019/2010). Observamos menor imunomarcação para KI67 no giro dentado de animais HI em P7. Para a marcação de DCX nesta idade não foi observada diferença entre os grupos. Animais HI em P15, P20 e P45 tiveram menor imunomarcação para DCX e Ki67 na camada granular. Animais P90 de ambos os grupos não apresentaram marcação para KI67 e DCX. Vimos aumento da imunomarcação para GFAP nos animais HI em todas as idades. A imunomarcação para NOSn nos animais HI foi menor em todas as idades. O maior número de células NOSn positivas foi visto em animais P7 em ambos os grupos na camada polimórfica. Em P15, animais HI apresentam células NOSn+ em todo o DG. Em P30 animais HI apresentam células NOSn+ nas camadas polimórfica e sub-granular. Animais adultos (P90) de ambos os grupos apresentam células NOSn positivas apenas nas camadas granular e sub-granular. Embora animais HI P90 não apresentaram déficits de memória, estes apresentaram menor tempo de exploração do objeto. Comportamento correspondente a déficits de atenção em humanos. Nossos resultados sugerem que HI perinatal diminui a população de células proliferativas, de neurônios jovens, de neurônios NOSn+, além de causar astrogliose e possivelmente déficits de atenção. O modelo demonstrou ser útil para a compreensão dos mecanismos celulares das lesões hipóxico-isquêmicas e pode ser usado para testar estratégias terapêuticas.

Avaliação estereológica glomerular em rins de ratos após isquemia-reperfusão por clampeamento arteriovenoso e arterial

A técnica de isquemia-reperfusão tem sido utilizada em cirurgias conservadoras do rim como a nefrectomia parcial e em transplantes renais. Para se realizar a isquemia pode-se fazer o bloqueio do fluxo sanguíneo da artéria renal ou o bloqueio simultâneo da artéria e da veia renal. O evento isquêmico acarreta em dano celular ao rim principalmente pelo estresse oxidativo local e a liberação de radicais livres assim como o aumento da resposta inflamatória. Diversos autores verificaram lesão renal após a isquemia-reperfusão, porém, apenas testes funcionais foram realizados até o momento. Os autores que tentaram avaliar a lesão morfológica do rim apenas fizeram a quantificação de escores subjetivos. O nosso objetivo é avaliar por quantificação estereológica o dano causado pela isquemia-reperfusão comparando o clampeamento somente arterial com o clampeamento arteriovenoso. Utilizamos 24 ratos wistar, machos, de quatro meses de idade. Os animais foram divididos em três grupos: o grupo Sham (n=8), o grupo de clampeamento somente da artéria renal (n=8) e o grupo de clampeamento simultâneo da artéria e da veia renal (n=8). Os animais foram submetidos a laparotomia mediana. Os animais do grupo Sham permaneceram os 60 minutos anestesiados mas sem obstrução do fluxo sanguíneo de seus vasos renais. Os animais do grupo de clampeamento arterial foram submetidos à clampeamento de sua arterial renal esquerda por 60 minutos e os animais do grupo de clampeamento arterial e venoso tiveram seus vasos renais esquerdos clampeados simultaneamente e em bloco pelo mesmo tempo. Após os 60 minutos os animais foram suturados e mantidos por 30 dias em caixas próprias sendo mortos por sobredose anestésica após decorrido esse tempo. Os rins foram coletados e mantidos em solução de formalina tamponada e posteriormente processados para análise histológica e estereológica. Foram analisados a densidade volumétrica (Vv) dos glomérulos, o número de glomérulos/mm3(Nv) e o volume glomerular médio (VGM). A Vv e Nv se encontrou reduzida nos rins esquerdos submetidos à isquemia mas foi somente significativa nos animais do grupo de clampeamento arterial e venoso. Mesmo usando o rato como modelo animal experimental, a partir de nossos resultados recomendamos o uso do clampeamento somente arterial nos casos em que mínina lesão ao rim é imperiosa.

Efeitos da aplicação tópica da S-Nitrosoglutationa no reparo tecidual de lesões cutâneas isquêmicas

A aplicação tópica do hidrogel Pluronic F-127 (poli(óxido de etileno)99-poli(óxido de propileno)65-poli(óxido de etileno)99, PEO99-PPO65-PEO99) contendo um doador de óxido nítrico, a S-nitrosoglutationa (GSNO) é conhecida por exercer efeitos benéficos no reparo tecidual cutâneo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da aplicação tópica do hidrogel Pulronic F-127 contendo um doador de óxido nítrico no reparo tecidual de lesões isquêmicas. Ratos Wistar machos foram submetidos a duas lesões incisionais paralelas no dorso, a pele foi separada do tecido subjacente, as incisões foram suturadas e uma lesão excisional foi feita entre elas para criar uma condição isquêmica ao redor da lesão. Os animais foram separados em grupo controle, que recebeu a aplicação apenas do hidrogel sem doador de óxido nítrico e grupo tratado, que recebeu a aplicação do hidrogel contendo o doador de óxido nítrico. Os animais foram tratados por 7 dias consecutivos com uma aplicação diária dos hidrogéis. O grupo tratado apresentou taxas mais altas de contração e re-epitelização, menor quantidade de células inflamatórias, um aumento na densidade e organização de fibras colágenas e uma diminuição na neovascularização 14 dias após a lesão, comparado ao grupo controle. Esses resultados indicam que a aplicação tópica do gel doador de óxido nítrico é eficaz no tratamento de lesões isquêmicas em ratos, levando a uma melhora significativa na cicatrização. Consequentemente, a aplicação tópica de um hidrogel contendo doador de óxido nítrico poderá ter, futuramente, potencial para o tratamento terapêutico de úlceras venosas e decorrentes de diabetes.

Ingestão de suco de uva tinto orgânico melhora a densidade capilar funcional e a hiperemia reativa pós-oclusiva em triatletas

A atividade física intensa está associada com as adaptações biológicas que envolvem a melhora da homeostase da glicose, da capacidade antioxidante e da microcirculação cutânea. A ingestão insuficiente de antioxidantes na dieta pode levar ao estresse oxidativo e disfunção endotelial que afetam a microcirculação. Suco de uva tinto orgânico, uma importante fonte de polifenóis, com reconhecida função antioxidante e, portanto, o seu consumo pode melhorar o estado antioxidante, e assim, o metabolismo da glicose e a função endotelial. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do consumo diário de suco de uva tinto orgânico, sobre a concentração plasmática de ácido úrico, atividade da superóxido dismutase eritrocitária (E-SOD), concentração sérica da insulina, glicemia e HOMA IR-2, além de suas relações com os parâmetros da microcirculação em triatletas. Participaram do estudo 10 triatletas do gênero masculino (28 15 anos). As amostras de sangue foram coletadas antes (basal) e após 20 dias de ingestão de suco de uva tinto orgânico (300mL/dia). Em relação ao valor basal, a insulina sérica (p = 0,02) e o ácido úrico (p = 0,04) aumentaram, enquanto a glicose plasmática (p <0,001) e a E-SOD diminuíram (p = 0,04) após os 20 dias de intervenção. Os parâmetros da microcirculação também foram influenciados pela ingestão de suco de uva tinto orgânico, foi observado redução no tempo necessário para o retorno dos eritrócitos à velocidade de basal após isquemia (TRBCmax) (p = 0,04), aumento da densidade capilar funcional (DCF, p = 0,003) e da velocidade dos eritrócitos após a isquemia (VELmax p <0,001). A redução da glicemia foi determinante direta do aumento da DCF (p = 0,04), enquanto níveis séricos de insulina (p = 0,04) e a redução na atividade da SOD-E (p = 0,04) foram negativamente associados com a redução do TRBCmax. Os resultados do presente estudo sugerem que a ingestão de suco de uva melhora a capacidade antioxidante, a homesostase glicêmica e a microcirculação de triatletas.

Participação do propranolol no reparo tecidual de lesões isquêmicas cutâneas em ratos

Receptores adrenérgicos são amplamente expressos em diferentes tecidos, incluindo na pele. Recentemente foi descoberto que bloqueadores dos receptores β-adrenérgicos são capazes de modular o processo de reparo tecidual. O propranolol é um β-bloqueador não seletivo largamente utilizado na prática clínica para o tratamento de doenças cardiovasculares, parecendo apresentar propriedades antioxidantes. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta de diferentes doses de propranolol durante a lesão isquêmica cutânea em roedores. Ratos Wistar foram tratados com propranolol nas concentrações de 3 e 6 mg/kg. O grupo controle recebeu apenas o veículo e o grupo controle positivo recebeu vitamina E (50 mg/kg/dia). A administração do propranolol iniciou-se no dia da lesão, sendo realizada diariamente até o sacrifício. Incisões bilaterais foram feitas no dorso de cada animal. O flap foi suturado e foram realizadas lesões excisionais totais entre as lesões incisionais. A contração das lesões foi avaliada e os cortes histológicos foram corados com hematoxilina e eosina e vermelho de picrosirius. Foram utilizadas também as seguintes técnicas: Dopplerfluxometria, análises bioquímicas, análise estereológica e expressão de PECAM-1. O grupo tratado com 3 mg de propranolol apresentou uma maior redução na área total da lesão quando comparado ao grupo controle. Da mesma forma, este grupo apresentou um aumento na densidade de vasos sanguíneos, uma maior expressão de PECAM-1 e aumento na perfusão sanguínea na pele isquêmica e no sítio da lesão quando comparado ao grupo controle. Não observamos efeito antioxidante do propranolol neste modelo. Em resumo, nós sugerimos que o propranolol quando administrado na dose de 3 mg/kg/dia foi capaz de modular a angiogênese e melhorar o fechamento da lesão em modelo de roedores

Avaliação do efeito da sobrecarga lipídica na reatividade microvascular em mulheres obesas

As mudanças nos hábitos alimentares têm causado efeitos impressionantes na saúde pública, diretamente relacionados ao aumento da ingestão de refeições ricas em gorduras, principalmente gorduras saturadas. A principal consequência desse consumo é o estado prolongado e excessivo da lipemia pós-prandial (LPP), considerada um dos fatores relacionados às anormalidades metabólicas e aos danos vasculares. O objetivo do estudo foiavaliar o efeito da sobrecarga lipídica na reatividade microvascular em mulheres obesas. Das 41 participantes deste estudo, 21 apresentavam o diagnóstico de obesidade, com IMC de 32,41,6 kg/m2 (média SD) e idade 31,65 anos e 20 mulheres saudáveis, com IMC de 21,91,7 kg/m2 e idade 27,25,5 anos. Após a avaliação clínica e laboratorial, as participantes tiveram a microcirculação examinada por dois métodos: a dinâmica do leito periungueal, para avaliação da densidade capilar funcional (DCF), velocidade de deslocamento das hemácias no basal (VDH) e após uma isquemia de 1 min (VDHmax) e tempo de reperfusão (TVDHmax). A segunda técnica foi a do dorso do dedo para avaliação da DCF no repouso, durante a hiperemia reativa e após oclusão venosa. Foi feita a coleta de sangue para avaliação do colesterol total (CT), triglicerídeos (TG), HDL-c e ácidos graxos livres (AGL), glicose, insulina e viscosidade plasmática em 30 e 50 rotações por minuto (rpm). Também foram medidas a pressão arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD) e frequência cardíaca (FC). Após essas análises no repouso, todas as participantes receberam uma refeição rica em lipídios, e após 30, 60, 120 e 180 minutos da ingestão da refeição, os exames de videocapilaroscopia e a coleta de sangue foram novamente realizados.As participantes com obesidade apresentaram, após a sobrecarga lipídica, valores significativamente menores do que no jejum para: DCF basal do dorso do dedo (p=0,02); DCF durante hiperemia reativa (p=0,02), DCF pós-oclusão venosa (p=0,02), HDL-c (p<0,0001), LDL-C (p<0,0001) e AGL (p<0,0001) e valores elevados para: VDH (p<0,0001), VDHmax(p=0,003), TVDHmax (p=0,004), glicose (p<0,0001), insulina (p<0,001), CT (p=0,03), TG (p<0,0001) e FC (p=0,03). Alterações na viscosidade não foram observadas no grupo OB após a refeição quando comparado aos seus valores basais em 30 e 50 rpm (p=0,87 e p=0,42, respectivamente). A PAS foi elevada nas participantes OB após a sobrecarga quando comparada às saudáveis em todo tempo de estudo. Concluímos que alimentos ricos em lipídios podem aumentar ainda mais a disfunção microcirculatória e as alterações metabólicas já presentes em mulheres obesas.

Avaliação dos testículos de ratos submetidos à torção testicular antes, durante e após a puberdade e o efeito do tratamento com resveratrol

A torção testicular (TT) é uma afecção de relativa frequência, alvo de muitos estudos clínicos e experimentais ao longo dos anos. Pode acometer qualquer idade, no entanto é mais incidente em pacientes com menos de 21 anos de idade. Sua distribuição ocorre em dois picos: um no período neonatal e outro ao redor dos 13 anos de idade. A taxa dessa morbidade em jovens com menos de 25 anos é na ordem de 1/4000. A TT resulta em rotação do cordão espermático, que gera um comprometimento do suprimento sanguíneo testicular, considerada uma urgência urológica. Depois da TT, a artéria testicular e o plexo pampiniforme sofrem oclusão, interrompem o suprimento arterial e a drenagem venosa do testículo, diminuindo o aporte de nutrientes e oxigênio aos tecidos e células, levando à isquemia testicular. Esta condição afeta a produção de espermatozóides do testículo torcido podendo comprometer a fertilidade do indivíduo. Este presente estudo avaliou a função reprodutiva, alguns parâmetros espermáticos e morfologia dos testículos de ratos adultos submetidos à torção testicular antes, durante e após a puberdade, e também o efeito do tratamento com resveratrol. Os testículos direitos dos ratos foram torcidos a 720 por quatro horas em todos os grupos, exceto no grupo controle. A TT foi realizada durante os períodos pré-púbere (4 semanas de idade), púbere (6 semanas de idade) e adulto jovem (9 semanas de idade). Para cada grupo, houve um outro grupo que os animais foram submetidos ao mesmo procedimento e foram tratados com resveratrol, 30 mg/kg resveratrol foi injetado por via intraperitonel, 30 minutos antes da destorção, seguido por gavage por 7 dias. Cada rato na idade adulta acasalou com três fêmeas adultas com 12 semanas de idade para avaliar parâmetros de fertilidade. Todos os animais foram mortos com 14 semanas de idade e os testículos foram removidos para análise de concentração, motilidade e viabilidade dos espermatozóides de amostras colhidas da cauda dos epidídimos. Os parâmetros morfológicos foram avaliados por métodos estereológicos macro e microscópicos. A função reprodutiva dos animais nas diferentes idades não foi afetada pela TT, no entanto, após o tratamento os ratos operados com 4 e 6 semanas de idades tiveram maior potência e os ratos operados com 9 semanas de idade apresentaram maior taxa de fecundidade na idade adulta.. Os parâmetros morfológicos foram afetados em todos os testículos torcidos em todas as idades. Alguns desses parâmetros melhoram após o tratamento com resveratrol, e o efeito adjuvante foi maior nos ratos submetidos à TT com 4 semanas de idade. Entretanto, o resveratrol recuperou o epitélio seminífero no grupo que sofreu TT com 9 semanas de idade, os quais não apresentaram nenhum epitélio após a TT. Os parâmetros espermáticos dos testículos torcidos decresceram em todas as idades, e o resveratrol não foi efetivo, embora tenha recuperado a produção de espermatozóides no grupo que foi submetido à TT com 9 semanas de idade, em que todos os animais foram aspermatogênicos após a TTNão houve nenhum dano nos testículos contralaterais. O resveratrol promoveu efeito protetor para TT, principalmente quando os animais foram submetidos à TT em idade prépúbere.

Efeitos do estradiol sobre a função endotelial, sensibilidade insulínica e viscosidade sanguínea em mulheres na pós-menopausa com excesso de peso

A ação que o estrogênio desempenha sobre o endotélio depende da integridade deste e consequentemente das características clínicas de cada indivíduo. O uso da terapia hormonal da menopausa (THM) em mulheres com baixo risco cardiovascular geralmente resulta em efeitos benéficos, desde que iniciado em um período próximo da menopausa. Em contrapartida, o seu uso em mulheres com alto risco cardiovascular, como diabéticas ou portadoras de lesões ateroscleróticas já estabelecidas, e ainda naquelas com início da THM em um período superior a dez anos da menopausa geralmente resulta em efeitos maléficos. Nosso objetivo é avaliar os efeitos do estrogênio sobre a função endotelial em mulheres com sobrepeso ou obesidade, ou seja, indivíduos com risco cardiovascular intermediário. Para isso, 44 mulheres na pós-menopausa com idade entre 47 a 55 anos e índice de massa corporal (IMC) de 27,5 a 34,9kg/m, foram randomizadas nos grupos placebo (P) e estrogênio transdérmico (ET). A intervenção consistiu no uso transdérmico de estradiol, 1mg por dia, por um período de três meses. As participantes realizaram avaliação da reatividade endotelial em repouso e após isquemia [pletismografia por oclusão venosa (POV), com medidas do fluxo sanguíneo do antebraço (FSA) e videocapilaroscopia dinâmica do leito periungueal (VCLP), com medidas da velocidade de deslocamento das hemácias (VDH)], dosagens de moléculas de adesão [E-selectina, molécula de adesão intercelular (ICAM-1) e molécula de adesão vascular (VCAM-1)], aferição da sensibilidade insulínica [através do homeostatic model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) e área sob a curva (AUC) da insulina durante o teste oral de tolerância à glicose (TOTG)] e mensurações das viscosidades sanguínea e plasmática. As participantes apresentaram idade de 51,77 2,3 anos, IMC de 31,52 2,54 kg/m e tempo de menopausa de 3 [2-5] anos. O grupo P não apresentou nenhuma mudança significativa em qualquer variável. Após a intervenção, o grupo ET comparado ao basal apresentou menor tempo para atingir a VDH máxima durante a hiperemia reativa pós-oclusiva (HRPO) após 1 min de isquemia (4,0 [3,25-5,0] vs. 5,0 [4,0-6,0] s, P<0.05) e maior VDH tanto em repouso (0,316 [0,309-0,326] vs. 0,303 [0,285-0,310] mm/s; P<0,001) quanto na HRPO (0,374 [0,353-0,376] vs. 0,341 [0,334-0,373] mm/s; P<0,001), assim como observamos maior FSA em repouso (2,46 [1,81-3,28] vs. 1,89 [1,46-2,44] ml/min.100ml tecido-1; P<0,01) e durante a HRPO após 3 min de isquemia (6,39 [5,37-9,39] vs. 5,23 [4,62-7,47] ml/min.100ml tecido-1; P<0,001). O grupo ET também apresentou diminuição nos níveis solúveis de E-Selectina (68,95 [50,18-102,8] vs. 58,4 [44,53-94,03] ng/ml; P<0,05), de ICAM-1 (188 [145-212] vs. 175 [130-200] ng/ml; P<0,01), do HOMAIR (3,35 1,67 vs. 2,85 1,60; P<0,05) e da AUC da insulina durante o TOTG (152 [117-186] vs. 115 [85-178]; P<0,01), além de diminuição das viscosidades sanguínea com hematócrito nativo (3,72 0,21 vs. 3,57 0,12 mPa.s; P<0,01) e plasmática (1,49 0,10 vs. 1,45 0,08 mPa.s; P<0,05), comparado ao seu basal. Em conclusão o uso de estradiol transdérmico em mulheres com excesso de peso e menopausa recente, promove melhora da função endotelial, além de oferecer proteção a outros fatores de risco cardiovascular.

Hemodinâmica cardíaca e o metabolismo energético mitocondrial de camundongos adultos hiperalimentados na lactação

O desequilíbrio nutricional no início da vida leva ao desenvolvimento da obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares na idade adulta. Este estudo teve como objetivo analisar os efeitos a longo prazo da hiperalimentação na lactação por meio do modelo de redução da ninhada na hemodinâmica e bioenergética cardíaca. Vinte e quatro camundongos machos Swiss adultos foram divididos em dois grupos (controle e hiperalimentado) submetidos a duas condições (linha de base e isquemia/reperfusão) formando quatro grupos no total: grupo controle linha de base (GCLB), grupo controle isquemia/reperfusão (GCIR), grupo hiperalimentado linha de base (GHLB) e o grupo hiperalimentado isquemia/reperfusão (GHIR), todos com seis camundongos/grupo. As alterações cardíacas foram analisadas por meio da hemodinâmica cardíaca, da respiração mitocondrial e da biologia molecular. Os parâmetros hemodinâmicos analisados foram a velocidade de contração (Max dP/dt), a velocidade de relaxamento (Min dP/dt), o tempo de relaxamento cardíaco isovolumétrico (Tau) e os batimentos por minuto (BPM). A respiração mitocondrial foi avaliada por meio da razão do controle respiratório (RCR) na oxidação de carboidratos e ácidos gordos, e finalmente, a biologia molecular, através de proteínas-chave como a proteína quinase B (AKT), a proteína quinase ativada por adenosina monofosfato (AMPK), a carnitina palmitoil transferase 1 (CPT-1), a proteína desacopladora 2 (UCP2), o 4-hidroxinonenal (4-HNE) e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Os camundongos do GH desenvolveram maior peso corporal (30,95%, P<0,001), gordura epididimal (68,64%, P<0,001), gordura retroperitoneal (109,38%, P<0,01) e glicemia de jejum (19,52%, P<0,05) comparados aos do GC. Os parâmetros Max dP/dt e BPM apresentaram diminuição no GHIR quando comparado ao GHLB (P<0,001 e P<0,05). O parâmetro Min dP/dt apresentou-se reduzido no GCIR e GHIR quando comparado aos grupos GCLB e GCLB (P<0,05; P<0,0001 respectivamente). Camundongos do GHIR apresentaram redução do Tau quando comparado aos grupos GCIR e GHLB (P<0,0001). Estes desequilíbrios na hemodinâmica cardíaca foram associados a função mitocondrial, uma vez que, o GHLB apresenta a RCR reduzida para oxidação de ácidos graxos e carboidratos (P<0,05 e P<0,01, respectivamente) e o GHIR apenas na oxidação dos ácidos graxos (P<0,01). Além disso, o GHIR apresentou diversas alterações nas proteínas-chave do metabolismo energético cardíaco, como diminuição do conteúdo de AKT (P<0,05) e aumento do conteúdo de CPT-1 (P<0,05), 4-HNE (P<0,05) e GAPDH (P<0,05) quando comparado ao CGIR. Finalmente, a expressão do mRNA para CPT1, GAPDH e UCP2 foi aumentada no GHIR quando comparado aos GCIR (P<0,05) e GHLB (P<0,05). A expressão de mRNA para UCP2 e CPT-1 foi reduzida no GCIR quando comparado ao GCLB (P<0,01 e P<0,05, respectivamente). O estudo apresenta resultados consistentes, demonstrando efeitos deletérios sobre o metabolismo cardíaco adulto resultante de alterações nutricionais durante a lactação.