Estudo da bioenergética mitocondrial de cardiomiócitos de camundongos obesos

A obesidade é uma doença crônica, resultante do excesso de gordura no organismo. O aumento da obesidade no mundo, tem se revelado como um dos fenômenos clínicos e epidemiológicos da atualidade. Estudos populacionais e em modelos animais demonstram que a origem da epidemia da obesidade está relacionada a fatores genéticos, modificações de hábitos nutricionais, redução da atividade física, e alterações nutricionais durante a lactação, desempenhando um papel relevante no desenvolvimento da obesidade, DM2 e cardiomiopatias. As mitocôndrias são os coordenadores centrais do metabolismo energético, assim, alterações funcionais e estruturais dessa organela têm sido associadas à desordens metabólicas. Elas exercem um papel na sobrevivência e função dos cardiomiócitos devido à alta demanda energética do miocárdio. Desta forma, disfunções mitocondriais estão relacionadas com disfunções no miocárdio e conseqüente progressão de cardiomiopatias. Neste estudo, avaliamos a bioenergética e a ultraestrutura de cardiomiócitos de camundongos obesos e controle hiperalimentados durante a lactação. O consumo de oxigênio das fibras cardíacas foi avaliado por respirometria de alta-resolução, utilizando um oxígrafo-2K-Oroboros. A ultraestrutura dos cardiomiócitos foi analisada por microscopia eletrônica de transmissão e o conteúdo das proteínas Carnitina palmitoil transferase 1 (CPT1), Proteína desacopladora 2 (UCP2) , Transportador de glicose 1 e 4 (GLUT1) e (GLUT4), Proteína Kinase ativada por AMP (AMPK) e Proteína kinase ativada por AMP fosforilada p(AMPK) por Western blotting (WB). Além disso, o peso dos animais, a gordura retroperitoneal, epididimal e a glicemia em jejum foram determinadas. Nossos resultados confirmaram que os animais do grupo hiperalimentados (GH), aos 90 dias de vida, apresentaram aumento da massa corporal, de gordura epididimária e retroperitoneal comparado ao grupo controle (GC). As taxas respiratórias foram semelhantes nos dois grupos quando foram utilizados os substratos dos complexos I e II. Entretanto, quando o ácido graxo palmitoil-L-carnitina foi utilizado, a taxa respiratória máxima do GH foi significativamente menor. A análise ultraestrutural dos cardiomiócitos do GH demonstrou intenso dano na matriz mitocondrial e maior presença de gotículas de lipídios, caracterizando deposição ectópica. Os resultados do WB mostraram aumento significativo do conteúdo de CPT1 e UCP2 no GH comparado ao GC. Não foram encontradas diferenças significativas no conteúdo de GLUT1 entre os grupos, entretanto, observamos maior conteúdo do GLUT4 no GH. Além disso, encontramos maior conteúdo de AMPK no GH, ao passo que o conteúdo de pAMPK foi semelhante entre os grupos. Entretanto, a razão pAMPK/AMPK é significativamente menor no GH. Esses resultados sugerem que a hiperalimentação durante a lactação leva a obesidade na vida adulta com alterações na bioenergética e ultraestrutura dos cardiomiócitos.

Sinalização da grelina no coração de camundongos obesos após hipernutrição durante a lactação

A grelina é um ligante endógeno do receptor secretagogo do hormônio do crescimento (GHSR), potente estimulador da liberação do hormônio de crescimento (GH), ingestão alimentar, e adiposidade. Além disso, sua ação hormonal inclui regulação do metabolismo energético cardíaco. Entretanto, a hipernutrição no início da vida leva ao desenvolvimento da obesidade, induz hipertrofia cardíaca, compromete a função cardíaca, e gera insuficiência cardíaca na vida adulta. Avaliar proteínas chaves no processo de sinalização da grelina no remodelamento cardíaco no coração de camundongos obesos após a hipernutrição na lactação. A obesidade foi induzida por redução de ninhada e camundongos adultos (180 dias) foram divididos em: grupo hiperalimentado, GH com obesidade decorrente de hipernutrição na lactação e controle, GC. Cardiomiócitos (cmi) do ventrículo esquerdo foram analisados por microscopia de luz e estereologia, o conteúdo e fosforilação de proteínas cardíacas: receptor de grelina (hormônio do crescimento secretagogo receptor 1a, GHSR-1a), proteína quinase-B (AKT e pAKT), phosphatidil inositol 3-quinase (PI3K), proteína quinase ativada por AMP (AMPK e pAMPK), m-TOR, pmTOR, Bax, Bcl2 e actina foram analizados por western blotting. A expressão gênica do GHSR-1a foi analisada por PCR em tempo real. A respirometria de alta resolução dos cardiomiócitos foi analisada por oxígrafo OROBOROS. Significância estatística (P< 0,05) determinada por teste t-Student não-pareado. Nossos dados demonstram que a hipernutrição na lactação induz aumento no peso corporal, iniciado aos 10 dias de idade, persistindo até os 180 dias de idade. A glicemia, peso do fígado, e da gordura visceral foram maiores no grupo GH. Além disso, o grupo GH também apresentou aumento no peso do coração e razão peso do coração/CT (comprimento da tíbia), indicando hipertrofia e remodelamento cardíaco, aumento na expressão e conteúdo de GHSR-1a no coração, associado ao maior conteúdo de PI3K e maior conteúdo e fosforilação de AKT, diminuição no conteúdo de Bcl2. Em contraste, o conteúdo e fosforilação da AMPK e mTOR no coração não foram diferentes entre os grupos. Os níveis de grelina plasmático no GH foram menores. A respiração do GH com grelina foi menor que no GC com grelina. A incubação das fibras cardíacas com grelina resultou em aumento do fluxo respiratório após adição de citocromo c nos grupos com grelina, indicando dano à membrana mitocondrial e extravazamento de citocromo c. Os grupos GC com grelina e GH sem grelina apresentaram RCR menor comparado ao GC sem grelina, indicando desacoplamento mitocondrial. Nossos resultados mostram que a hipernutrição na lactação induz diminuição do nível de grelina plasmática e aumento da expressão do GHS-R1a no cardiomiócito do animal quando adulto. Tal processo determina aumento da sensibilidade a grelina no coração, processo que ocorre independentemente de variações do AMPK e mTOR. Sugerimos uma redução no efeito protetor da ação da grelina na AMPK. Também, demonstramos que o remodelamento do miocárdio nestes animais adultos associa-se a GHSR-1a, PI3K, e fosforilação da AKT, mas não com AMPK e mTOR na vida adulta.

Efeito da hiperalimentação na lactação sobre a regulação da adiposidade corporal e sinalização da grelina no tecido adiposo branco de camundongos jovens e adultos

A obesidade é um dos maiores problemas de saúde pública que cresce em todo o mundo, resultante de um desequilíbrio entre ingestão alimentar e gasto energético. O aumento da adiposidade leva ao desenvolvimento de alterações funcionais. Pode-se dizer que a obesidade é o principal fator de risco para o desenvolvimento de doenças crônicas de maior prevalência como dislipidemias, doenças cardiovasculares e diabetes do tipo 2, acarretando na redução da qualidade e expectativa de vida. A Grelina é um hormônio sintetizado pelo estômago, que atua em diferentes tecidos através de um receptor específico (GHS-R1a), incluindo hipotálamo e tecido adiposo. A grelina tem uma ação direta sobre a regulação hipotalâmica da ingestão alimentar, induzindo um efeito orexígeno. Por outro lado, a grelina também modula o armazenamento de energia nos adipócitos. Esta dupla ação sugere que este hormônio pode atuar como uma ligação entre o sistema nervoso central e mecanismos periféricos. Portanto, considerando que a hiperalimentação neonatal induz obesidade na idade adulta por mecanismos desconhecidos, neste estudo foram pesquisados os efeitos da hiperalimentação no início da vida sobre o desenvolvimento da obesidade e, em particular, a sinalização da grelina no tecido adiposo em ratos jovens e adultos. Foram utilizados camundongos Swiss hiperalimentados através do modelo de redução da ninhada. Para induzir a hiperalimentação as ninhadas foram reduzidas a 3 filhotes machos por lactante no 30 dia de vida pós-natal. As ninhadas controles foram ajustadas em 9 filhotes por lactante. Foram avaliados parâmetros antropométricos como: massa corporal e massa do tecido adiposo visceral. A glicemia de jejum foi avaliada utilizando glicosímetro e fitas teste. A análise do conteúdo das proteínas envolvidas na via de sinalização da grelina foram detectadas pelo método de Western Blotting. Os grupos controle (C) e hiperalimentado (H) foram estudados aos 21 e 180 dias de vida. Os dados demonstram que a hipernutrição no início da vida induz um aumento significativo no peso corporal dos camundongos jovens, começando aos 10 dias, e este aumento de peso persistiu até à idade adulta (180 dias de idade). A glicemia e o peso da gordura visceral foram significativamente maiores no grupo hiperalimentado aos 21 e 180 dias, quando comparado com o grupo controle. Os níveis plasmáticos de grelina acilada apresentaram uma redução de 70% nos animais jovens e 49% adultos obesos. Além disso, no tecido adiposo branco, observamos um maior conteúdo (242%) do receptor de grelina (GHSR1a) nos animais hiperalimentados com 21 dias, e este aumento foi associado à modulação positiva do conteúdo e fosforilação de proteínas envolvidas no estoque e utilização de energia celular, tais como AKT, PI3K, AMPK, GLUT-4, e CPT1. No entanto, ao chegar à idade adulta os animais hiperalimentados não apresentaram diferença significativa no conteúdo de GHS-R1a e das proteínas AKT, PI3K, AMPK, GLUT-4, e CPT1. O conteúdo de PPARɣ foi menor no grupo obeso aos 21e 180 dias. Basicamente, mostramos que o metabolismo do tecido adiposo está alterado na obesidade adquirida no início da vida e, provavelmente, devido a essa modificação, ocorre um novo padrão da via de sinalização da grelina.

Disfunção mitocondrial e cardíaca em camundongos induzida por dieta rica em ácidos graxos poliinsaturados

Indivíduos obesos apresentam maior risco de morbidade e mortalidade atribuída às doenças cardiovasculares. A composição da dieta é um fator que prediz o fenótipo cardíaco em resposta a obesidade e, o tipo de ácido graxo pode afetar de forma diferencial a estrutura e a função do miocárdio. Estudos têm mostrado que a disfunção mitocondrial exerce um papel chave na patogênese da insuficiência e hipertrofia cardíaca, e as alterações mitocondriais observadas em falhas cardíacas apontam para defeitos em sítios específicos da cadeia transportadora de elétrons. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a função contrátil ventricular em camundongos, alimentados com dieta hiperlipídica, rica em ácidos graxos poliinsaturados, buscando elucidações através da bioenergética mitocondrial. Após desmame, camundongos machos C57Bl/6 passaram a receber dieta manipulada contendo 7% (C) ou 19% (HF) de óleo de soja, até os 135 dias de idade. A ingestão alimentar e a massa corporal foram monitoradas e foi realizado teste de tolerância à glicose. No final do período experimental, os animais foram anestesiados e submetidos à avaliação da composição corporal por Absortimetria de Raios X de Dupla Energia (DXA), e em seguida, sacrificados por exsanguinação. No plasma foram determinados o perfil lipídico e a insulina. O coração, o tecido adiposo intra-abdominal e o subcutâneo foram coletados, pesados, processados para análise histomorfológica. Fibras cardíacas do ventrículo esquerdo foram utilizadas para análise da respiração mitocondrial através de oxígrafo. O coração também foi utilizado para a técnica de perfusão de coração isolado de Langendorff, e para análise da expressão de proteínas relacionadas à bioenergética de cardiomiócitos, através de Western Blotting. O índice de HOMA e de adiposidade foram calculados. O grupo HF apresentou maior adiposidade, sem alteração na ingestão alimentar. Foi observada intolerância a glicose, hiperinsulinemia e resistência à insulina, além de alterações desfavoráveis no perfil lipídico. Foi observado alteração na morfologia cardíaca e quadro de cardiomiopatia hipertrófica, refletindo em alteração hemodinâmica, determinando maior contratilidade, maior pressão ventricular e função diastólica prejudicada. Em relação à atividade mitocondrial dos cardiomiócitos foi observada menor oxidação de carboidratos (-47%) e de ácidos graxos (-60%). Porém, sem alteração na expressão de proteínas relacionadas à bioenergética de cardiomiócitos, CPT1, UCP2, GLUT1, GLUT4, AMPK e pAMPK. A partir desses resultados, concluímos que o tipo e a quantidade de ácidos graxos predizem o fenótipo cardíaco na obesidade, promovendo alteração na capacidade oxidativa mitocondrial, na morfologia e na hemodinâmica cardíaca

Hemodinâmica cardíaca e o metabolismo energético mitocondrial de camundongos adultos hiperalimentados na lactação

O desequilíbrio nutricional no início da vida leva ao desenvolvimento da obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares na idade adulta. Este estudo teve como objetivo analisar os efeitos a longo prazo da hiperalimentação na lactação por meio do modelo de redução da ninhada na hemodinâmica e bioenergética cardíaca. Vinte e quatro camundongos machos Swiss adultos foram divididos em dois grupos (controle e hiperalimentado) submetidos a duas condições (linha de base e isquemia/reperfusão) formando quatro grupos no total: grupo controle linha de base (GCLB), grupo controle isquemia/reperfusão (GCIR), grupo hiperalimentado linha de base (GHLB) e o grupo hiperalimentado isquemia/reperfusão (GHIR), todos com seis camundongos/grupo. As alterações cardíacas foram analisadas por meio da hemodinâmica cardíaca, da respiração mitocondrial e da biologia molecular. Os parâmetros hemodinâmicos analisados foram a velocidade de contração (Max dP/dt), a velocidade de relaxamento (Min dP/dt), o tempo de relaxamento cardíaco isovolumétrico (Tau) e os batimentos por minuto (BPM). A respiração mitocondrial foi avaliada por meio da razão do controle respiratório (RCR) na oxidação de carboidratos e ácidos gordos, e finalmente, a biologia molecular, através de proteínas-chave como a proteína quinase B (AKT), a proteína quinase ativada por adenosina monofosfato (AMPK), a carnitina palmitoil transferase 1 (CPT-1), a proteína desacopladora 2 (UCP2), o 4-hidroxinonenal (4-HNE) e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Os camundongos do GH desenvolveram maior peso corporal (30,95%, P<0,001), gordura epididimal (68,64%, P<0,001), gordura retroperitoneal (109,38%, P<0,01) e glicemia de jejum (19,52%, P<0,05) comparados aos do GC. Os parâmetros Max dP/dt e BPM apresentaram diminuição no GHIR quando comparado ao GHLB (P<0,001 e P<0,05). O parâmetro Min dP/dt apresentou-se reduzido no GCIR e GHIR quando comparado aos grupos GCLB e GCLB (P<0,05; P<0,0001 respectivamente). Camundongos do GHIR apresentaram redução do Tau quando comparado aos grupos GCIR e GHLB (P<0,0001). Estes desequilíbrios na hemodinâmica cardíaca foram associados a função mitocondrial, uma vez que, o GHLB apresenta a RCR reduzida para oxidação de ácidos graxos e carboidratos (P<0,05 e P<0,01, respectivamente) e o GHIR apenas na oxidação dos ácidos graxos (P<0,01). Além disso, o GHIR apresentou diversas alterações nas proteínas-chave do metabolismo energético cardíaco, como diminuição do conteúdo de AKT (P<0,05) e aumento do conteúdo de CPT-1 (P<0,05), 4-HNE (P<0,05) e GAPDH (P<0,05) quando comparado ao CGIR. Finalmente, a expressão do mRNA para CPT1, GAPDH e UCP2 foi aumentada no GHIR quando comparado aos GCIR (P<0,05) e GHLB (P<0,05). A expressão de mRNA para UCP2 e CPT-1 foi reduzida no GCIR quando comparado ao GCLB (P<0,01 e P<0,05, respectivamente). O estudo apresenta resultados consistentes, demonstrando efeitos deletérios sobre o metabolismo cardíaco adulto resultante de alterações nutricionais durante a lactação.

Bioenergética mitocondrial do coração na obesidade induzida por dieta ocidental em camundongos Swiss

A obesidade, doença resultante do acúmulo excessivo de gordura corporal, é importante fator de risco para diabetes mellitus tipo 2, dislipidemias e doenças cardiovasculares, doenças de alta prevalência em todo o mundo. O processo de transição nutricional decorrente da globalização contribuiu para o crescente número de indivíduos com obesidade, principalmente pela modificação nos hábitos alimentares da população, com ampla inclusão de produtos industrializados ricos em gordura saturada, sal e açúcar, denominada dieta ocidental. Os mecanismos pelos quais a obesidade induzida por dieta leva ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares ainda não estão completamente esclarecidos na literatura, porém sabe-se que a obesidade leva ao comprometimento da função cardíaca e do metabolismo energético, aumentando a morbidade e mortalidade. Em grande parte dos estudos relacionados à obesidade, o metabolismo energético celular comprometido associa-se à disfunção mitocondrial. Neste contexto, torna-se importante avaliar a função mitocondrial na obesidade, visto que as mitocôndrias são organelas com funções-chave no metabolismo energético. No presente estudo, avaliamos inicialmente o efeito obesogênico da dieta ocidental em camundongos Swiss por 16 semanas a partir do desmame. Para tal, analisamos a ingestão alimentar, evolução da massa corporal, Índice de Lee, peso das gorduras epididimal e retroperitoneal, peso e morfologia do fígado, relação entre o peso do fígado/massa corporal, peso do ventrículo esquerdo (VE)/massa corporal, glicemia de jejum e teste intraperitoneal de tolerância à glicose. Avaliamos também o consumo de oxigênio das fibras cardíacas através da respirometria de alta resolução. Além disso, o conteúdo das proteínas envolvidas no metabolismo energético: Carnitina Palmitoil Transferase 1 (CPT1), proteína desacopladora 2 (UCP2), Transportadores de glicose 1 e 4 (GLUT1 e GLUT4), proteína quinase ativada por AMP (AMPK), proteína quinase ativada por AMP fosforilada (pAMPK), receptor de insulina β (IRβ) e substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1) foi determinado por western blotting. Nossos resultados confirmaram o caráter obesogênico da dieta ocidental, visto que os camundongos submetidos a esta dieta (GO), apresentaram-se hiperfágicos (P<0,001) e obesos (72,031,82, P<0,001), com aumento progressivo no ganho de massa corporal. Além do aumento significativo dos parâmetros: Índice de Lee (362,902,44, P<0,001), gorduras epididimal e retroperitonial (3,310,15 e 1,610,11, P<0,001), relação entre o peso do fígado/massa corporal (0,060,003, P<0,001) e peso de ventrículo esquerdo (VE)/massa corporal (0,080,002, P<0,01), hiperglicemia de jejum (192,1014,75, P<0,01), intolerância à glicose (P<0,05, P<0,01) e deposição ectópica de gordura no fígado. A respirometria de alta resolução evidenciou disfunção mitocondrial cardíaca no grupo GO, com reduzida capacidade de oxidação de carboidratos e ácidos graxos (P<0,001) e aumento do desacoplamento entre a fosforilação oxidativa e a síntese de ATP (P<0,001). Os resultados de western blotting evidenciaram aumento nos conteúdos de CPT1 (1,160,08, P<0,05) e UCP2 (1,080,06, P<0,05) e redução no conteúdo de IRS-1 (0,600,08, P<0,05). Não houve diferença significativa nos conteúdos de GLUT1, GLUT4, AMPK, pAMPK, pAMPK/AMPK e IRβ. Em conclusão, o consumo da dieta ocidental resultou no desenvolvimento de obesidade com disfunção mitocondrial associada a alterações no metabolismo energético.

Função mitocondrial cardíaca de camundongos filhotes e adultos submetidos à hiperalimentação durante a lactação

Estudos demostram que a hiperalimentação no período pós-natal causa obesidade, alterações cardiometabólicas e resistência à insulina em longo prazo. O objetivo do estudo foi investigar as consequências da hiperalimentação na lactação nos corações de camundongos filhotes e adultos ao longo do desenvolvimento. Para induzir a hiperalimentação na lactação, o tamanho da ninhada foi reduzida a 3 filhotes machos no terceiro dia, grupo hiperalimentado (GH). O grupo controle (GC) permaneceu com 9 filhotes da lactação ao desmame. Avaliamos a massa corporal, gordura epididimária e retroperitoneal, morfologia hepática e cardíaca, ultraestrutura dos cardiomiócitos, peso do PVE/CT, glicemia de jejum, triglicerídeos, colesterol total, insulina plasmática e HOMA-IR. Analisamos o consumo de oxigênio das fibras cardíacas através da respirometria de alta resolução, atividade enzimática da PDH, CS e LDH no coração e glicogênio hepático. Biologia molecular, através das proteínas: IRβ, IRS1, pIRS1, PTP1B, PI3K, Akt, pAkt, GLUT1, GLUT4, AMPKα, pAMPKα, HKII, CPT1, UCP2, FABPm, CD36, PGC-1α, PPARα, 4HNE, complexos da CTE (I, II, III, IV e V), α-tubulina, GP91 e VADC. Diferenças entre os grupos analisadas por Two-Way ANOVA, com significância p<0,05. O GH apresentou aumento da massa corporal, gordura epididimária, retroperitoneal e colesterol total em todas as idades; glicemia de jejum, insulina, índice de HOMA-IR e triglicerídeos aos 21 e 90 dias. Aumento do índice de Lee aos 60 e 90 dias. GH apresentou diminuição: do IRβ e GLUT4 aos 21 e 60 dias; aumento do IRβ aos 90 dias; aumento do IRS1, PTP1B, aos 21 e 90 dias e da AKT, pAMPK/AMPK e GLUT1 aos 21 dias; diminuição da pIRS1/IRS1, PI3K, pAKT/AKT aos 21 e 90 dias; diminuição da HKII aos 21 dias e aumento aos 60 e 90 dias; aumento da PDH aos 90 dias; aumento da LDH aos 21 dias e redução aos 60 dias; aumento da CS aos 21 dias e diminuição aos 60 e 90 dias; aumento da oxidação de carboidratos aos 21 dias e redução aos 90 dias; diminuição na oxidação de ácidos graxos aos 60 e 90 dias. Adicionalmente, aumento do desacoplamento mitocondrial entre a fosforilação oxidativa e a síntese de ATP aos 60 e 90 dias. Diminuição da CPT1 e aumento da UCP2 aos 21 e 90 dias. Diminuição da PGC-1α aos 60 e 90 dias; da FABPm e CD36 em todas idades. Aumento da 4HNE aos 21 e diminuição aos 90 dias. Diminuição na expressão do mRNA para CPT1 aos 21, 60 dias. Diminuição na expressão do mRNA para PPARα e aumento na expressão do mRNA para UCP2 aos 21 dias; diminuição na expressão do mRNA para UCP2 ao 60 dias. Alterações morfológicas cardíacas e hepáticas, assim como na ultraestrutura dos cardiomiócitos, em todas as idades, maior conteúdo de glicogênio hepático aos 21 e 90 dias. Concluímos que a hiperalimentação na lactação levou à obesidade, com aumento da oxidação de glicose, alterações no metabolismo energético associadas à diminuição da sensibilidade à insulina, redução da capacidade oxidativa mitocondrial, levando ao desacoplamento e alteração da morfologia e ultraestrutura dos cardiomiócitos do desmame até a idade adulta.