A via L-argininaóxido nítrico, estresse oxidativo e ciclo da uréia na obesidade

A obesidade é um distúrbio metabólico de etiologia multifatorial e elevada prevalência no Brasil, que pode ser definida por um índice de massa corporal (peso em quilogramas dividido pela altura em metros ao quadrado) maior ou igual a 30 kg/m2, e que está associada de forma independente a um elevado risco de morbidade e mortalidade cardiovascular devido aos eventos aterotrombóticos. O óxido nítrico (NO), uma pequena molécula gasosa, é produzido através da conversão do aminoácido catiônico L-arginina em L-citrulina e NO em uma reação catalisada por uma família de enzimas denominadas NO-sintases (NOS), e funciona como um protetor cardiovascular modulando por exemplo o relaxamento do músculo liso vascular e a função plaquetária. O objetivo desta tese foi avaliar a via L-arginina-NO, bem como investigar a função plaquetária, o estresse oxidativo, e a atividade da arginase em pacientes com obesidade. O transporte de L-arginina, a produção de guanosina monofosfato cíclica (GMPc), a atividade e a expressão das isoformas da NOS (iNOS e eNOS), a atividade da arginase, o estresse oxidativo (produção de espécies reativas de oxigênio EROs; atividade da superóxido dismutase SOD; e atividade da catalase), bem como a função plaquetária foram medidos nas plaquetas dos pacientes com obesidade. Nas hemácias, foram medidos o transporte de L-arginina e a atividade da NOS e da arginase. Os níveis de aminoácidos e de marcadores inflamatórios (fibrinogênio e proteína C reativa) também foram medidos sistemicamente. Os resultados demonstram que o influxo de L-arginina via sistema y+L, a atividade da NOS e a produção de GMPc estão diminuídos nas plaquetas dos pacientes obesos em relação aos controles saudáveis, enquanto que não houve diferença na atividade da arginase. Além disso, a expressão das isoformas da NOS bem como a agregação plaquetária em plaquetas de pacientes com obesidade mostrou-se aumentada em relação aos controles. Nas hemácias destes pacientes, observou-se elevado influxo de L-arginina via sistema y+ e y+L e atividade da NOS, e nenhuma diferença na função da arginase. A concentração plasmática de L-arginina não foi afetada pela obesidade, mas já os marcadores inflamatórios estavam significativamente aumentados. A produção de EROs e a atividade da catalase nas plaquetas não estava alterada em pacientes com obesidade, enquanto que a atividade da SOD mostrou-se diminuida. Assim, apesar do aumento da produção de NO pelas hemácias, é possível que a baixa produção plaquetária de NO, além do estado inflamatório e um possível estresse oxidativo, estejam contribuindo para a elevada atividade plaquetária observada na obesidade. As descobertas aqui apresentadas contribuem para uma melhor compreensão dos eventos cardiovasculares presentes na obesidade.

Avaliação do estrese oxidativo e da via L-arginina-óxido nítrico em plaquetas na gestação normal e na pré-eclâmpsia

A Pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome hipertensiva específica da gravidez, atualmente compreendida como uma doença sistêmica que cursa com inflamação, distúrbios da coagulação, desordens metabólicas, disfunção endotelial e desequilíbrio entre agentes vasoconstrictores e vasodilatadores. Contudo, a fisiopatologia da PE ainda não foi completamente elucidada. Este estudo investigou, em 51 gestantes, o estresse oxidativo, a via L-arginina-óxido nítrico e agregação plaquetária, na gestação normal (n=27) e na PE (n=24). Amostras de soro e plaquetas de gestantes normotensas e com PE, foram utilizadas para a medida de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a carbonilação de proteínas, a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), assim como a produção de óxido nítrico (NO) pela formação de nitrito. Nas plaquetas foram avaliados, também, o transporte de L-arginina, a atividade da óxido nítrico sintase (NOS) e a agregação plaquetária. Em amostras de plasma foram realizadas medidas da proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) e do aminoácido L-arginina. Estes resultados demonstram que não há diferença nas medidas da proteína C reativa e da L-arginina entre gestantes normotensas e com PE. A formação de nitritos e a atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT e GPx se encontram reduzidas no soro de gestantes com PE, enquanto a medida de TBARS e a carbonilação de proteínas não foi diferente das gestantes normotensas. Em plaquetas, o transporte de L-arginina pelo sistema y+L está diminuído na PE, ao passo que, a atividade da NOS, a formação de nitrito e a agregação plaquetária não modificaram em relação a gestação normal. A carbonilação de proteínas está aumentada em plaquetas na PE e a atividade da CAT está reduzida. Concluiu-se, que a menor formação de nitrito no soro sugere uma menor produção de NO em pacientes com PE. Este dado correlaciona com uma redução da defesa antioxidante observada pela menor atividade das enzimas SOD, CAT, GPx que deve contribuir para uma maior inativação do NO. Apesar dos níveis plasmáticos normais de L-arginina na PE, o sistema de transporte via y+L está reduzido em plaquetas, o que pode estar associado em parte ao estresse oxidativo que contribui para alterações físicas e estruturais da membrana, podendo afetar o influxo do aminoácido. Apesar do transporte de L-arginina reduzido e do aumento do estresse oxidativo em plaquetas na PE, não houve alteração da atividade da NOS, da produção de NO e da agregação plaquetária, indicando que mecanismos compensatórios possam estar contribuindo para a manutenção da produção de NO e de sua função modulatória sobre a agregação

Corpo carotídeo e hipertensão: alterações celulares e da matriz extracelular

O aumento de doenças cardiovasculares possui como fator primordial e, mais comum, o aumento da pressão arterial (PA). Esta, pode gerar complicações em outros órgãos e acarretar diversas patologias, podendo levar a morte. A hipertensão é uma síndrome multifatorial, cuja maior incidência ocorre em indivíduos obesos, sedentários e consumidores em excesso de bebidas alcoólicas e sal. O corpo carotídeo (CC) é um órgão quimiorreceptor localizado na bifurcação da artéria carótida, formado de estruturas básicas chamadas glomus. Cada glomus carotídeo é constituído de células tipo 1 envoltas por células tipo 2 ou sustentaculares. Este trabalho teve como objetivo analisar as alterações morfofuncionais que ocorrem no CC, causada por hipertensão arterial induzida pelo L-NAME, um inibidor da enzima óxido nítrico sintase. Para isso, o estudo utilizou 20 ratos Wistar divididos em dois grupos: controle (C) e L-NAME (LN). Após a administração de 40mg/kg/dia de L-NAME por 45 dias, o CC foi coletado. Observou-se aumento significativo da pressão arterial a partir da segunda semana de administração de L-NAME. Análise quantitativa mostrou uma redução no número de núcleos do glomus carotídeo e o aumento na área total do órgão no grupo LN. Não foi encontrado diferença significativa no número de núcleos totais do corpo carotídeo entre os grupos. Na análise morfológica do grupo LN, observamos a formação de vacúolos nas células tipo 1 do glomus, bem como uma redução do número total de núcleos das células de cada glomus carotídeo. A análise qualitativa sugeriu um aumento no número de fibras colágenas e fibras do sistema elástico na matriz extracelular e grânulos no grupo LN. Imunomarcações com anticorpo anti VEGF e NF-kB e nNOS mostram-se aumentadas e dispersas por todo CC no grupo LN em relação ao grupo C. Além disso, marcações para Substância-P também foram observadas em maior quantidade nas células tipo 1 do grupo LN. Quanto à marcação para PGP 9.5, houve a redução desta marcação caracterizada dentro do glomus carotídeo grupo LN comparado ao grupo C. O estudo sugere que o corpo carotídeo, em resposta à hipertensão induzida pela inibição da enzima óxido nítrico sintase, gera mudanças morfofisiológicas semelhantes as encontradas em hipóxia.

Malnutrição protéica e desenvolvimento hipocampal: estudo das implicações sobre memória/aprendizado e avaliação da distribuição da Óxido Nítrico Sintase

A nutrição inadequada é um dos principais fatores não-genéticos que afetam o desenvolvimento do encéfalo. O hipocampo é uma estrutura bastante sensível a alterações no aporte nutricional durante o desenvolvimento. No hipocampo a óxido nítrico sintase (ONS) é uma enzima altamente expressa e o óxido nítrico (ON) já foi apontado como tendo papel fundamental na potenciação de longa duração (LTP) e depressão de longa duração (LTD), responsáveis pelo processo de memória e aprendizado. Neste trabalho estudamos o efeito da malnutrição no comportamento associado à memória e aprendizado e na distribuição da ONS, através da técnica da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato diaforase (NADPH-d). O presente trabalho foi aprovado pelo COMITÊ DE ÉTICA (CEA/055/2009). Foram utilizados ratos Wistar machos, divididos em dois grupos: grupo controle (GC) e grupo malnutrido (GM). A malnutrição se deu através da administração, para a mãe, de uma ração com 0% de proteína durante os 10 primeiros dias de lactação, iniciando-se no dia do nascimento dos filhotes. O GC recebeu ração comercial (22% de proteína). Os encéfalos foram processados histologicamente nas idades de P10, P20, P30, P45 e P90 (n=5 para cada idade e grupo estudado), sendo então realizada a histoquímica da NADPH-d para avaliar a distribuição da ONS. A avaliação dos comportamentos associados à ansiedade foi realizada através do labirinto em cruz elevado (LCE), o comportamento associados à busca por novos estímulos foi medida através do campo vazado (CV) e a memória/aprendizado foi avaliada através do labirinto aquático radial de 8 braços (LAROB) em animais P40 (n=10 para cada grupo) e P90 (n=11 para cada grupo). No GM em P10 observamos maior densidade de células NADPHd+ no giro denteado. Em P20, a marcação para NADPH-d no GM foi menor e esse padrão foi mantido em P30 e P45. No GM em P90 não observamos efeitos da dieta. Em P10, no GM observamos menor número de corpos marcados no stratum pyramidale (SPy). Em P20 o SPy encontrava-se intensamente marcado em ambos os grupos. Em P30 GM observamos maior número de células marcadas no SPy. Entretanto em P45, ambos os grupos apresentaram poucos corpos marcados. Em P90, o GM apresentou mais células marcadas no SPy. Não foram observadas diferenças significativas nas variáveis analisadas para o LCE. O GM em P90 explora maior número de orifícios, tanto na periferia (F=8,1; gl=1; P=0,014) quanto no número total (F=7,5; gl=1; P=0,017). Não foram observadas diferenças significativas para as variáveis analisadas no CV em P40. No teste de memória/aprendizagem foram observadas diferenças significativas entre o GM e o GC na latência de escape no 1 dia de testes em P90 (F=5,2; gl=1; P=0,033), com o GM apresentando melhor desempenho quando comparado ao GC. Esses valores podem ser explicados pela redução da latência para encontrar a plataforma de escape no GM. Não foram observadas diferenças significativas no LAROB em P40. Nossos resultados demonstram que a malnutrição protéica restrita aos 10 primeiros dias da lactação altera a distribuição da NADPH-d no hipocampo. A malnutrição afetou o comportamento dos animais em P40. Por outro lado, em P90 os primeiro dia de teste, sugerindo que o efeito observado está mais associado à novidade do ambiente de teste.

Atividade do flavonóide quercetina em Leishmania braziliensis usando hamster como modelo de infecção

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Estudos prévios mostraram que o flavonóide quercetina tem ação terapêutica pela via oral em camundongos infectados com L. amazonensis. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade do flavonóide quercetina sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário da quercetina foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos e hamsters. O efeito da quercetina sobre macrófagos foi avaliado pela dosagem de óxido nítrico pelo método de Griess nos sobrenadantes das culturas e espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular através do H2DCFDA. In vivo a atividade terapêutica da quercetina foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com quercetina pela via oral (2mg/ 5X / semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas.A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A quercetina não apresentou atividade sobre o crescimento de promastigotas em cultura em nenhuma das concentrações testadas. Em amastigotas intracelulares quercetina apresentou ação dose dependente em macrófagos de camundongos e hamsters inibindo 45% e 54% e 25% e 48 %, respectivamente nas concentrações de 50 e 100g/ml após 48h de tratamento. O pré - tratamento dos macrófagos de camundongos e hamsters com quercetina foi capaz de inibir o crescimento de amastigotas intracelulares em 57, 58 e 74% e 49, 50, e 58% respectivamente, nas concentrações de 25, 50 e 100 g/ml, apresentado ação inibitória significativa em todas as concentrações testadas. Não houve alteração na produção de NO pelos macrófagos, entretanto macrófagos pré tratados com a quercetina por 24 horas antes da infecção apresentaram um aumento significativo na produção de EROs, quando comparados aos controles. Macrófagos tratados antes e depois da infecção, apresentaram diminuição da produção de EROs. In vivo, a quercetina foi capaz de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado ( P< 0,05). Os animais tratados com quercetina apresentaram maior resposta intradérmica aos antígenos de L. braziliensis. Esses dados mostram que a quercetina tem atividade sobre L. braziliensis, inibindo amastigotas intracelulares in vitro e sendo capaz de controlar o tamanho das lesões em hamsters infectados quando administrada pela via oral.

Efeitos da hipóxia-isquemia perinatal sobre o comportamento motor, distribuição da Tirosina Hidroxilase na substância negra e da NADPH diaforase no hipocampo durante o desenvolvimento em ratos

A hipóxia isquemia (HI) pré-natal é uma das principais causas de mortalidade e doenças neurológicas crônicas em neonatos, que podem apresentar déficits remanentes como: retardamento, paralisia cerebral, dificuldade de aprendizado ou epilepsia. Estes prejuízos, provavelmente, estão relacionados com o atraso no desenvolvimento neural, astrogliose e com a perda de neurônios e oligodendrócitos. Déficits funcionais e cognitivos estão associados à degeneração de vias dopaminérgicas e de estruturas hipocampais. A enzima tirosina hidroxilase (TH) é a enzima limitante na síntese de dopamina e seus níveis são alterados em eventos de HI. O óxido nítrico (NO) é um gás difusível que atua modulando diferentes sistemas, participando de eventos como plasticidade sináptica e neuromodulação no sistema nervoso central e é produzido em grandes quantidades em eventos de injúria e inflamação, como é o caso da HI. O presente estudo teve por objetivos avaliar, utilizando o modelo criado por Robinson e colaboradores em 2005, os efeitos da HI sobre o comportamento motor e avaliar o desenvolvimento de estruturas encefálicas relacionadas a este comportamento como a substância negra (SN) e o complexo hipocampal. A HI foi induzida a partir do clampeamento das artérias uterinas da rata grávida, por 45 minutos no décimo oitavo dia de gestação (grupo HI). Em um grupo de fêmeas a cirurgia foi realizada, mas não houve clampeamento das artérias (grupo SHAM). A avaliação do comportamento motor foi realizada com os testes ROTAROD e de campo aberto em animais de 45 dias. Os encéfalos foram processados histologicamente nas idades de P9, P16, P23 e P90, sendo então realizada imunohistoquímica para TH e histoquímica para NADPH diaforase (NADPH-d), para avaliação do NO. Nossos resultados demonstraram redução da imunorreatividade para a TH em corpos celulares na SN aos 16 dias no grupo HI e aumento na imunorreatividade das fibras na parte reticulada aos 23 dias, com a presença de corpos celulares imunorreativos nesta região no grupo HI. Demonstramos também aumento do número de células marcadas para NADPH-d no giro dentado nos animais HI, nas idades analisadas, assim como aumento na intensidade de reação no corno de Ammon (CA1 e CA3) aos 9 dias no grupo HI, e posterior redução nesta marcação aos 23 e 90dias neste mesmo grupo. Nos testes comportamentais, observamos diminuição da atividade motora no grupo HI com uma melhora do desempenho ao longo dos testes no ROTAROD, sem entretanto atingir o mesmo nível do grupo SHAM. Os animais HI não apresentaram maior nível de ansiedade em relação ao grupo SHAM, descartando a hipótese das alterações observadas nos testes de motricidade estarem relacionadas a fatores ansiogênicos. O modelo de clampeamento das artérias uterinas da fêmea se mostrou uma ferramenta importante no estudo das alterações decorrentes do evento de HI pré-natal, por produzir diversos resultados que são similares aos ocorridos em neonatos que passam por este evento.

Atividade in vitro da pterocarpanoquinona LQB-118 sobre o Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é endêmica na América Latina sendo considerada uma doença negligenciada com grande impacto socioeconômico. A infecção é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi que é transmitido pela forma vetorial, entre outros mecanismos. O tratamento consiste basicamente no uso de dois fármacos, o benznidazol e o Nifurtimox que apresentam uma série de efeitos colaterais e atuam muito pouco nas formas amastigotas intracelulares o que faz com que o tratamento atual seja restrito e insatisfatório.Várias atividades farmacológicas foram atribuídas ao lapachol e a pterocarpanos, tais como atividade antitumoral e antiparasitária. Devido a esse potencial foi sintetizado uma molécula híbrida, a pterocarpanoquinona LQB-118, e algumas moléculas derivadas. A LQB-118 mostrou anteriormente atividade antitumoral e anti-Leishmania. O objetivo do presente trabalho foi investigar a atividade in vitro da LQB-118 e suas moléculas derivadas sobre o Trypanosoma cruzi clone Dm28c. Para avaliação inicial do efeito anti-parasitário das moléculas, amastigotas intracelulares, tripomastigotas metacíclicos e epimastigotas foram incubados com 20 M das LQBs 118, 168, 187, 182 e 236. A LQB-118 demonstrou atividade antiparasitária nas três formas evolutivas (90% na forma amastigota, 44% na forma tripomastigota e 70% na forma epimastigota) do parasito, enquanto as moléculas derivadas não mostraram atividade significativa. Sendo assim os estudos foram continuados com a molécula LQB-118. A ação da LQB-118 sobre as amastigotas intracelulares foi dose dependente, com redução do índice de infecção em 81% e 88% nas concentrações de 20 e 30 M respectivamente. Já sobre tripomastigotas, a LQB-118 foi menos ativa reduzindo a mobilidade dessas formas em até 45% a 30 M. Sobre a forma epimastigota a ação foi dose-dependente chegando a inibir 96% o crescimento dos parasitos a 20 M, com alterações da morfologia tais como arrendondamento do corpo celular e perda do flagelo. A dose capaz de inibir 50% foi de 4,2 M para amastigota intracelular e 38,1 M para tripomastigotas. Para macrófagos, a LC50 ficou em 40 M, uma concentração quase dez vezes maior que a IC50 para amastigotas. A capacidade das formas amastigotas intracelulares se diferenciarem em tripomatigotas e lisar os macrófagos foi avaliada após o tratamento com a LQB-118 por 72h. Observou-se um atraso do ciclo intracelular do parasito de modo dose-dependente, onde na concentração de 30 M o surgimento de tripomastigota foi no 9 dia enquanto nos controles foi no 5 dia de cultura. Para delinear o mecanismo de ação, foi avaliado o efeito direto sobre o parasito como a indução da fragmentação de DNA. A análise de indução da fragmentação do DNA feita pela marcação pelo TUNEL mostrou que o tratamento com a LQB-118 induziu seletivamente a fragmentação do núcleo das amastigotas enquanto o núcleo dos macrófagos se mantiveram íntegros. Macrófagos peritoneais pré-tratados com LQB-118 por 24 horas foram capazes de reduzir o número de amastigotas após 72h de cultivo na ausência da molécula, mas sem alteração na produção de óxido nítrico. Esses resultados mostram que a LQB-118 é ativa contra o T. cruzi, principalmente sobre a forma amastigota intracelular, que é a forma presente na fase crônica da infecção. O mecanismo de ação sugere que a LQB-118 é capaz de ser seletivamente tóxica para o parasito e também ativar os mecanismos microbicidas dos macrófagos de modo independente da produção de óxido nítrico.

Apoptose induzida por estreptococos do grupo B em células epiteliais respiratórias A549

Streptococcus agalactiae, ou Streptococcus do grupo B (GBS), é um importante patógeno oportunista que causa pneumonia, sepse e meningite em recém-nascidos e infecções em adultos imunocomprometidos. O pulmão aparentemente é o portal de entrada para o EGB na corrente sanguínea o que pode evoluir para uma septicemia. Os mecanismos de virulência relevantes envolve a habilidade do EGB em penetrar e sobreviver intracelularmente em células hospedeiras. Neste trabalho, foram analisados os mecanismos moleculares da apoptose epitelial induzida pelo EGB, e a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) em células epiteliais respiratórias A549 durante a infecção por EGB. Todas as amostras de EGB exibiram a capacidade de aderir e invadir células A549. A sobrevivência intracelular do EGB em células A549 ocorreu durante 24 h de incubação sem replicação do patógeno. No entanto, a amsotra 88641-V isolada de vagina não sobreviveu após 0,5 h de interação. O EGB promoveu a perda de viabilidade do epitélio durante a infecção. As alterações morfológicas em células A549 infectadas com o EGB incluem arredondamento celular, condensação nuclear, encolhimento celular e perda de contato célula-célula e célula-substrato. A dupla marcação AV/IP revelou que amostras de EGB sorotipo III induziram apoptose enquanto amostras do sorotipo V induziram morte celular semelhante a necrose em células A549. Caspase-3 foi ativada durante a apoptose induzida por EGB em células epiteliais. No entanto, a ativação de caspases-8 e -9 foi detectada apenas para a amostra 88641-V e as amostras EGB do sorotipo III, respectivamente. Experimentos comparativos de Immunoblotting revelaram que o EGB induziu um aumento da expressão Bim, uma proteína pró-apoptótica e diminuiu a expressão de Bcl-2 e Bcl-xL, proteínas anti-apoptóticas. As células A549 apresentaram perda de potencial de membrana mitocondrial Δψm e co-localização com o Bax. Ensaio de espectrometria de massa identificou a proteína PI-2a, uma proteína estrutural de pili, que exibe atividade carboxipepdidase. Descobrimos que os dois sorotipos (III e V) induziram a produção ROS e NO em células A549. Em conclusão, a apoptose induzida pelo EGB em células A549 é um mecanismo importante de virulência, resultando na destruição de tecidos, escape do sistema imune do hospedeiro com espalhamento bacteriano e, em consequência, a doença invasiva ou uma infecção sistémica.

Influência da ck2 no processo de interação Leishmania donovani-macrófagos

O gênero Leishmania apresenta espécies capazes de desenvolver doenças de grande importância para a saúde pública, as leishmanioses, que apresentam prevalência mundial de 12 milhões de pessoas. Quando os parasitos entram em contato com o hospedeiro humano passam por um processo de metaciclogênese adquirindo capacidade de interagir com os macrófagos. Inúmeras atividades biológicas são desencadeadas pela ativação de sistemas de transdução de sinais, onde as proteínas cinases e fosfatases desempenham papel fundamental. A proteína cinase CK2 parece estar presente em todas as células eucarióticas (núcleo, citoplasma e superfície). É caracterizada como enzima serina/treonina cinase, embora também seja capaz de fosforilar resíduos de tirosina em suas proteínas-alvo. No presente trabalho, demonstramos que o principal inibidor da CK2, TBB, foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. donovani e mostrou um mecanismo de ação irreversível, entretanto não foi capaz de induzir apoptose nas formas promastigotas de L. donovani. O pré-tratamento dos parasitos e macrófagos, assim como a adição do TBB durante o processo de infecção induziram uma redução significativa no número de amastigotas por macrófagos possivelmente pelo mecanismo de morte celular programada demosntrada pela técnica do TUNEL. O tratamento de macrófagos com TBB não induziram o aumento de óxido nítrico. Ensaios de imunofluorescência demonstraram a presença de CK2α em promastigotas. Macrófagos não infectados demonstraram pouca marcação para CK2α. Após a interação, a enzima mostrou-se distribuída preferencialmente na periferia dos macrófagos. Os dados do trabalho sugerem que a CK2 é uma importante enzima para a atividade biológica da Leishmania donovani, tendo seu estudo importante relevância para a descoberta de novos alvos terapêuticos.

Alterações eritrocitárias induzidas pelo exercício físico

Evidências crescentes têm demonstrado que o exercício prejudica a estrutura da membrana eritrocitária, como consequência do aumento do estresse físico e químico. O óxido nítrico (NO) derivado dos eritrócitos afeta a fluidez da membrana e a sua biodisponibilidade depende do equilíbrio entre a sua síntese e eliminação por espécies reativas de oxigênio. Nós investigamos se o exercício realizado em diferentes intensidades afetaria biodisponibilidade do NO eritrocitário e se levaria a um quadro de estresse oxidativo. Dez homens (26 4 anos, VO2pico 44,1 4,3 mL.kg-1.min-1) realizaram um teste cardiopulmonar máximo em esteira e um teste de exercício submáximo a 70% VO2pico durante 30 min. O sangue foi coletado em repouso e imediatamente após os exercícios para isolamento dos eritrócitos. O exercício máximo aumentou a contagem de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito, sem levar a qualquer alteração na massa corporal que pudesse sugerir hemoconcentração devido a uma redução do volume plasmático. Observou-se uma diminuição do influxo de L-arginina depois do teste submáximo, mas não no teste máximo. No entanto, a atividade da óxido nítrico sintase, ou seja, a produção de NO, foi aumentada após o teste máximo. Os níveis de GMPc não se alteraram após ambos os teste de exercício. Em relação aos biomarcadores de estresse oxidativo, o exercício submáximo reduziu a oxidação proteica e aumentou a atividade da catalase e a expressão da glutationa peroxidase, enquanto que o exercício máximo levou a uma maior peroxidação lipídica e diminuição da atividade da SOD. Nem a atividade glutationa peroxidase ou a expressão NADPH oxidase foram afetadas pelo exercício. Estes resultados sugerem que o exercício induziu alterações no estresse oxidativo de eritrócitos, que parecem estar mais associadas com a intensidade do que a duração do execicio. Além disso, nas intensidades recomendadas para a promoção da saúde, o exercício mostrou ser protetor, aumentando a atividade e a expressão de enzimas antioxidantes importantes e reduzindo os danos oxidativos.

Ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante por ExoU de Pseudomonas aeruginosa

ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citosol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. No presente trabalho, o efeito de ExoU na ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU), com a mutante deletada no gene exoU, PA103∆exoU, ou com a mutante complementada com exoU sem atividade tipo fosfolipase A2, PA103∆UT/S142A. Análises das dosagens de hidroperóxidos lipídicos e isoprostanos, considerados marcadores de estresse oxidativo, revelaram que ExoU promoveu um aumento em suas concentrações. Foi observado, também, que ExoU estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e peroxinitrito nas células infectadas, assim como a expressão de iNOS e eNOS, mas não de nNOS. Além disso, ExoU foi responsável pelo aumento da atividade de SOD1 e pela redução dos níveis de GSH, mas não afetou a atividade da catalase ou de NQO1. No modelo in vivo, a dosagem de malondialdeído, um subproduto da lipoperoxidação de membranas, evidenciou uma maior produção deste composto no pulmão de camundongos infectados pela cepa produtora de ExoU, em comparação ao pulmão de camundongos infectados pela cepa mutante. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, levando à peroxidação lipídica e modulando o sistema de defesa antioxidante

Características morfológicas de vermes adultos machos e fêmeas de Schistosoma mansoni recuperados de camundongos desnutridos e deficientes em óxido nítrico

Esquistossomose e desnutrição são graves problemas de saúde pública nos países em desenvolvimento. A esquistossomose provoca uma série de morbidades, que é influenciada, em grande maioria, pela natureza do estímulo à resposta imunológica e ao estado nutricional do hospedeiro. Durante a infecção esquistossomótica, a resposta imune produz citocinas que são liberadas e estimulam a produção de óxido nítrico. Numerosos estudos demonstraram que o estado nutricional e a resposta imune afetam as características fenotípicas dos vermes adultos. No entanto, se o óxido nítrico desempenha um papel neste fenômeno é desconhecido. Neste estudo, os camundongos do tipo selvagem (grupo controle) e camundongos knockout com deficiência na produção de óxido nítrico foram alimentados com uma dieta comercial (UNILAB) ou uma dieta básica regional, dieta com baixa concentração de proteína (7,87%). Por meio de um sistema digital de análise de imagem (Image Pro Plus, USA) e microscopia confocal, estudou-se a morfologia da ventosa oral, tegumento e o sistema reprodutor de vermes machos e fêmeas. Vermes machos e fêmeas recuperados de camundongos desnutridos com deficiência de oxido nítrico mostraram descamação do tegumento. A superfície dorsal de vermes desnutridos machos apresentaram tubérculos irregulares, distribuídos de forma desigual, e escassos. O sistema reprodutivo de vermes fêmeas desnutridas não demonstrou alterações morfológicas. No entanto, os machos deste grupo exibiram menor número de células no processo de diferenciação dentro dos lobos testiculares. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a deficiência de produção de óxido nítrico não induz alterações morfológicas em nível do tegumento e do sistema reprodutor de vermes machos. Em contraste, a desnutrição é responsável por tais alterações morfológicas, principalmente no sistema reprodutivo e na ventosa oral.

Ação do Glucantime sobre macrófagos de camundongos

Os antimoniais pentavalentes, tais como o Glucantime, são geralmente usados como fármacos de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses, no entanto seu mecanismo de ação não é completamente esclarecido. Atua contra formas amastigotas intracelulares de Leishmania sp, comprometendo o potencial redox levando danos ao DNA do parasito. Alguns trabalhos sugerem que o Glucantime aumenta a capacidade fagocítica e a produção de TNF-alfa por fagócitos. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade do Glucantime modular a atividade do macrófago, a principal célula hospedeira da Leishmania. Inicialmente, a toxicidade do Glucantime foi testada sobre macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, tratando as monocamadas in vitro por 48 horas. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A capacidade do Glucantime (0,1, 1 e 10 mg/ml) modular os macrófagos foi avaliada tratando as monocamadas de macrófagos peritoneais por 24 horas antes da infecção com Leishmania braziliensis. Após 48 horas de incubação com meio de cultura foi avaliado o índice de infecção por contagem. Antes e após a infecção foram analisados a produção de óxido nítrico (NO) pelo método de Griess, espécies reativas de oxigênio (EROS) por fluorimetria usando a sonda H2DCFDA e a produção de citocinas por ELISA. Para avaliar se o Glucantime seria capaz de modular macrófagos in vivo, camundongos suíços foram tratados por 5 dias consecutivos com 8 mg de Glucantime pela via intraperitoneal. Macrófagos peritôneais foram avaliados quanto a sua capacidade de controlar a infecção in vitro com L. braziliensis. Os resultados mostraram que nas concentrações até 10 mg/ml, o Glucantime não alterou a viabilidade dos macrófagos in vitro. O pré-tratamento dos macrófagos com Glucantime nas concentrações de 0.1mg/mL, 1mg/mL e 10mg/mL, foi capaz de reduzir o índice de infecção em 49%, 74% e 85%, respectivamente. Em macrófagos não infectados a produção de NO foi aumentada na concentração de 10mg/ml de Glucantime. O tratamento com 1 e 10 mg/ml de Glucantime foi capaz de aumentar significativamente a produção de EROs (p<0,05 e p<0.01, respectivamente) e a produção IL-12 (p<0,05), mas a IL-10 não foi alterada. Não houve alterações significativas desses parâmetros em relação ao controle após a infecção com L. braziliensis. Os macrófagos oriundos dos animais tratados com Glucantime foram capazes de reduzir o índice de infecção por L. braziliensis (p<0,05). Esses resultados sugerem que o Glucantime é capaz de ativar os macrófagos e esse efeito pode contribuir para o mecanismo de ação desse fármaco.

Efeitos da associação de biomateriais com doadores de óxido nítrico no reparo tecidual cutâneo de camundongos

A aplicação tópica de doadores de óxido nítrico é conhecida pelos seus efeitos benéficos no reparo tecidual cutâneo. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da associação de biomateriais com doadores de óxido nítrico no reparo tecidual cutâneo de camundongos. Camundongos swiss machos foram submetidos a lesões excisionais por punch de biópsia de 8 mm no dorso. Os animais foram separados em 4 grupos (n=6 em cada grupo) de acordo com a aplicação do curativo de polivinil álcool e hidrogel sobre a lesão de punch: a) grupo polivinil álcool com grupos tiol e Pluronic F-127 (PVA-SH/F127) - tratado com hidrogel sem S- nitrosoglutationa (GSNO) e filme sem óxido nítrico; b) grupo polivinil álcool S-nitrosado (PVA-SNO/F127-GSNO) - tratado com hidrogel contendo GSNO e filme com óxido nítrico; c) grupo PVA-SNO - tratado apenas com filme óxido nítrico e d) grupo PVA-SNO/ F127 - tratado com hidrogel sem GSNO e filme com óxido nítrico. Os animais foram tratados por 7 dias consecutivos com aplicação diária de curativos com seus respectivos biomateriais. Após 7 dias de tratamento, foram retirados os curativos e as lesões foram deixadas cicatrizar por segunda intenção. O grupo tratado com filme de PVA-SNO (d) associado ao hidrogel F127, comparado com os demais grupos descritos acima, apresentou melhora no reparo tecidual, melhora da contração da lesão, diminuição do gap epitelial e densidade celular, aceleração da fase inflamatória, aumento da diferenciação miofibroblástica e aumento da expressão de colágeno do tipo III (p<0,05, ao menos). Com base nesses dados, a combinação de filmes PVA liberadores de óxido nítrico com F-127 pode representar uma nova abordagem para o tratamento de lesões cutâneas.

Alterações na biodisponibilidade de óxido nítrico e no estresse oxidativo em plaquetas de mulheres na pós-menopausa

O risco de desenvolver doença cardiovascular aumenta com o avançar da idade, sendo exponencialmente maior em mulheres após a menopausa em relação a mulheres em idade reprodutiva. Esse aumento pode ser, em parte, explicado por uma hiperatividade plaquetária e disfunção endotelial nessas mulheres. Em plaquetas, o óxido nítrico é uma molécula essencial para a inibição da sua ativação e agregação; cuja biodisponibilidade depende de sua síntese e inativação por espécies reativas de oxigênio. Assim, o presente estudo visa determinar os efeitos da menopausa sobre a função plaquetária, biodisponibilidade de óxido nítrico e estresse oxidativo. Para tal, a amostra foi constituída por mulheres sendo elas 15 jovens entre 20 e 40 anos (grupo controle), 12 mulheres entre 45 e 60 anos pós-menopausadas há no mínimo 12 meses que não faziam uso de reposição hormonal e que não possuíam fatores de risco para doença cardiovascular. Os resultados demonstraram que mulheres pós-menopausadas apresentam uma hiperagregação plaquetária induzida por colágeno em relação a mulheres jovens. Essas mulheres também apresentaram o influxo de L-arginina aumentado em relação ao grupo controle. No entanto, a atividade da enzima óxido nítrico sintase estava diminuída nas mulheres após a menopausa, assim como os níveis plasmáticos de L-arginina. A expressão das enzimas iNOS e eNOS não diferiu significativamente entre os grupos. A expressão das subunidades 1 e 1 da enzima guanilato ciclase, e a fosfodiesterase 5 não se apresentaram diferentes entre os grupos. A expressão das enzimas glutationa peroxidase, subunidades gp91phox e p47phox da NADPH oxidase não estavam alteradas em plaquetas de mulheres pós-menopausadas, já a catalase estava mais expressa neste grupo. Em relação à atividade das enzimas antioxidantes, foi observado um aumento na superóxido dismutase em mulheres pós-menopausadas. Esse grupo apresentou ainda níveis mais elevados de grupamentos sulfidrila. Já em relação a danos proteicos não foi possível observar diferença entre os grupos. Dessa forma, esses resultados podem contribuir para uma melhor compreensão da hiperagregação plaquetária observada nas mulheres após a menopausa, o que, por sua vez, pode contribuir para a elucidação de mecanismos envolvidos na morbidade e mortalidade cardiovascular elevada nessa população.