Quantificação e caracterização fenotípica e funcional das células NK do sangue periférico em lúpus eritematoso sistémico (LES)

Introdução: O Lúpus Eritematoso Sistémico (LES) é uma doença inflamatória crónica auto-imune que afecta múltiplos órgãos. A sua etiologia é multifactorial, em que a interacção entre factores genéticos, hormonais, ambientais e infecciosos leva à perda de tolerância imunológica e à produção de auto-anticorpos dirigidos principalmente contra antigénios nucleares, alguns dos quais participam nas lesões teciduais. As células NK através das suas capacidades citotóxicas e produção de citocinas inflamatórias podem influenciar as doenças auto-imunes. Objectivos: O objectivo deste estudo foi quantificar e analisar as características imunofenotípicas e funcionais das duas principais subpopulações de células NK nos pacientes com LES. Material e Métodos: Este estudo incidiu numa população de 44 indivíduos com diagnóstico de LES, dos quais 18 se encontravam na fase activa e 26 na fase inactiva da doença e em 30 indivíduos saudáveis, que constituíram o grupo controlo. Para este universo populacional, foi estudada a percentagem (%) e número absoluto de células NK, assim como das suas duas subpopulações, CD56dim e CD56bright, no sangue periférico e a frequência com que estes dois grupos celulares expressam o antigénio CD57 e o receptor de quimiocina CXCR3, e produzem interferon-gama (IFN- γ), factor de necrose tumoral-alfa (TNF- α), granzima B e perforina, assim como a quantidade de proteína por célula (MIF - média de intensidade de fluorescência), por citometria de fluxo. Resultados: Os resultados obtidos revelam uma clara diminuição dos números absolutos e relativos de células NK nos doentes com LES, principalmente naqueles com doença activa, enquanto que as proporções dos subtipos de células NK, não foram afectadas. Nos pacientes com LES activo encontrámos uma baixa densidade de CXCR3 em ambos os subtipos de células NK e uma baixa frequência de células NK CD56dim a expressar CXCR3. Para além disso, observámos que a expressão de granzima B nos dois grupos de doentes com LES está diminuída mas a percentagem de células NK a expressar granzima B e perforina está aumentada, especialmente na doença activa. Observou-se uma diminuição na percentagem de células NK CD56dim e CD56bright a produzir TNF- α e na sua expressão nas células NK CD56dim na doença activa, enquanto que a expressão de IFN- γ nas células NK CD56bright está aumentada em todos os pacientes com LES. Conclusão: Os nossos resultados sugerem que as células NK apresentam alterações funcionais e fenotípicas únicas, que são particularmente evidentes na doença activa, e podem afectar o desenvolvimento da doença.

Deteção/quantificação de eritrócitos com hemoglobina fetal na gravidez e pós parto utilizando um analisador hematológico

Introdução: As células F(CF) são eritrócitos contendo hemoglobina (Hb) F e outros tipos de hemoglobina. São encontradas em indivíduos de todas as idades, ao contrário dos eritrócitos fetais, só encontrados em fetos e recém-nascidos. Nestes eritrócitos fetais, a Hb F é o tipo dominante de Hb. Estudos publicados indicam que a gravidez pode levar a um aumento progressivo de células com Hb F no sangue materno, devido à presença de CF e/ou de células fetais, estas últimas frequentemente associadas a hemorragia feto–materna (HFM). Objetivo: (1) Determinação da percentagem (%) de células com Hb F em sangue materno, usando um anticorpo Anti-Hb F num analisador hematológico. (2) Quantificação de CF e/ou células fetais na gravidez e pós o parto. (3) Elaboração de algoritmo para a triagem de HFM. Material e Métodos: Estudadas 168 amostras de sangue materno: 29 no 1º trimestre da gravidez (1ºT); 43 no segundo (2º T); 82 no terceiro (3ºT), 14 pós-parto (PP) (amostras entre dia 0 e dia 7, após parto); 32 controlos negativos (Ctl N) com homens adultos saudáveis e 30 controlos positivos (Ctl P), obtidos por mistura de sangue do cordão com sangue do adulto, AB0 compatíveis. Amostras processadas no analisador hematológico Cell-Dyn Sapphire tm, em modo RBC Flow, após ajuste de parâmetros IAS, FL1 e FL3, utilizando um reagente com iodeto de propídio e 2,5 uL de anticorpo monoclonal anti-Hb F FITC. Imagens analisadas pelo software FCS Express V3. Análise estatística com Kruskal-Wallis e teste t-Student (significância estatística p <0,05). Cut-off para HFM obtido pelo valor mínimo, em %, em que se detetam células fetais na amostra Ctl P. Resultados: foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na % células com Hb F (P<0,0001) nos grupos estudados. % CF aumenta com a gravidez:1ºT vs Ctl N - p <0,0217 e também durante a gravidez 1ºT Vs 3ºT – P=0,0007. Mesmo depois do PP a % CF está aumentada Ctl N vs PP: - p<0,0001. Valores médios de % CF residuais em adultos saudáveis: 0,53. Maioria das amostras nos diferentes grupos estudados apresenta % CF acima do valor residual (>0,53%): 66% no grupo 1ºT, 83 % no 2º T e 91% no 3º T. Valor cut-off para suspeita de HFM de 1,70% de células com Hb F. Teste preciso (CV+- 4%) para baixas % de células com Hb F. Discussão/Conclusão: Há um aumento células com Hb F durante a gravidez e esse aumento permanece no período PP. Em duas amostras do 3ºT obteve-se % células com Hb F elevada, superior ao cut-off (≥1,70%), sendo detetada uma população de prováveis células fetais. A presença células fetais nestas amostras foi confirmada por citometria de fluxo com Anti-Hb F/ Anti-CA, com subsequente diagnóstico de HFM. Esta metodologia é simples, rápida e não dispendiosa, quando aplicada a um analisador hematológico, representa uma mais-valia no rastreio da HFM. No futuro, pode integrar o protocolo de análises de rotina das grávidas, permitindo detetar as HFM silenciosas, que são a origem de muitas anemias de causa desconhecida em recém-nascidos.