3 resultados para Sequenciamento

em Universidade Catolica de Brasilia


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Sapporo virus é um membro do gênero Sapovirus da família Caliciviridae, é um agente causador de gastrenterite aguda. Seu genoma é linear, de senso positivo, ssRNA, com tamanho de cerca de 7,5 kb, poliadenilado na região terminal 3 '. Sapporo virus é dividido atualmente em cinco genogrupos (GI-GV), sendo que um genogrupo específico de suínos (GIII). No Brasil, sabe-se que os vírus que mais causam gastrenterites são os rotavírus e norovírus, ao passo que a ocorrência de sapovírus parece ser esporádica. No Distrito Federal, um sapovírus foi encontrado recentemente por RT-PCR de uma amostra fecal, visando amplificar parte do gene da proteína do capsídeo. A fim de identificar o genótipo do sapovírus isolado, o fragmento de DNA amplificado por RT-PCR foi sequenciado utilizando primers específicos para sapovírus na Plataforma de Sequenciamento da Universidade Católica de Brasília. O sapovírus isolado do DF foi identificado como genótipo 2 de genogrupo I. A análise filogenética foi realizada com esta região. Decidiu-se então sequenciar o genoma completo por clonagem dividindo em duas regiões genômicas. Primeiro a região 5’ e segundo a região 3’. Após o sequenciamento utilizando a técnica de primer walking, comparou-se os resultados com todas as sequências de genoma completo de Sapporo virus encontradas no GenBank, encontrando uma semelhança de 72% entre o sapovírus do DF com um sapovírus japonês (número de acesso HM002617).

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As infecções gastrointestinais causam grande impacto social e econômico no mundo inteiro, em especial aos países em desenvolvimento por serem endêmicas, contribuírem com a desnutrição e aumentarem o risco de morte em crianças menores de cinco anos. Entre os microrganismos causadores de gastroenterites, os vírus são os de maior envolvimento, normalmente relacionados com surtos originados de água e/ou comida contaminadas. O Sapovirus é um agente etiológico das doenças diarreicas que pertence à família Caliciviridae. Está associado principalmente a surtos em enfermarias, orfanatos e escolas. Este trabalho objetiva a clonagem e expressão da proteína P1 em sistema bacteriano com fins futuros de desenvolvimento de anticorpos para uso diagnóstico. Com o gene codificante da proteína P1, de 600pb, foi realizada uma clonagem em plasmídeo (pENTR-2b) depois uma subclonagem num vetor de expressão (pDEST17) usando o sistema Gateway, todas reações positivaram, e foram confirmadas pelo sequenciamento dos plasmídeos. Em seguida a indução da expressão com L-arabinose foi realizada e foram coletadas as alíquotas. Estas alíquotas foram corridas em gel de poliacrilamida revelando bandas de 20kDa, mais intensas com 4 horas de indução, nos pellets. Estes mesmos pellets foram submetidos ao teste de Western blot, com anticorpos anti-HisTag para ligação específica com a proteína de interesse; O resultado obtido foi favorável, mostrando reação apenas na banda de 20kDa, o tamanho esperado da proteína. O Sapovírus está aumentando de forma expressiva seu reconhecimento em surtos diarreicos no mundo todo, tornando necessária uma técnica confiável, simples e com custo efetivo razoável para uso diagnóstico na rotina laboratorial.

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A gastroenterite aguda é um problema de saúde pública caracterizada por febre, vômitos e diarréias. É uma patologia que causa altos índices de morbidade e mortalidade em seres humanos em todo o mundo. Os principais enteropatógenos virais relacionados com a gastroenterite são os rotavírus, calicivírus, adenovírus e astrovírus. Para a detecção destes gastrovírus existem várias técnicas, classificadas como não moleculares, tais como, microscopia eletrônica, técnicas de isolamento viral para astrovírus e ensaio imunoenzimático (ELISA), e moleculares, incluindo hibridização, PCR e o sequenciamento. Existe uma variante da PCR convencional, denominada PCR multiplex, o qual incorpora diferentes conjuntos de oligonucleotídeos específicos para mais de um alvo, permitindo simultâneas amplificações em uma única reação. O objetivo deste estudo é padronizar a técnica de PCR multiplex para detecção de astrovírus, sapovírus e norovírus genogrupo I e II, descrita por Yan et al. (2003) com modificações, nos laboratórios de biotecnologia da Universidade Católica de Brasília e no LACEN/DF. Este trabalho analisou 30 amostras fecais humanas para execução cega, com resultados previamente conhecidos cedidas pelo Instituto Evandro Chagas de Belém para validação da técnica da PCR multiplex, a ser utilizado como diagnóstico no LACEN/DF. Os resultados obtidos são: 6,6% (n=02) de positividade para astrovírus, 3,3% (n=01) para sapovírus e 3,3% (n=01) para norovírus genogrupo II. O PCR multiplex é uma metodologia rápida e com custos mais baixos que a PCR monoplex, tendo uma boa sensibilidade e especificidade. Este é um trabalho que apresenta resultados preliminares e estudos futuros são necessários para validação final da técnica.